EDTA依賴性血小板減少癥血小板解聚方法在不同血細胞檢測系統(tǒng)的效果評價

鐘陽,李穎能,張偉紅(廣州市第一人民醫(yī)院檢驗科,廣州510180)

EDTA依賴性假性血小板減少癥(EDTA-dependent pseudo-thrombocytopenia,EDTA-PTCP)是由于在EDTA抗凝血中EDTA誘導(dǎo)血小板(platelets,PLT)中的特殊蛋白使PLT發(fā)生凝集導(dǎo)致PLT發(fā)生假性減少的現(xiàn)象[1]。雖然這種現(xiàn)象發(fā)生的幾率很低(0.07%～1%)[2],但卻給臨床診治工作帶來很大困擾,既容易造成誤診又延誤時效,繼而增加患者的經(jīng)濟負擔(dān)[3]。目前臨床多應(yīng)用電阻抗法(PLT-I法)對存在EDTA-PTCP現(xiàn)象的患者血液標(biāo)本進行檢測,但考慮到存在不同程度的PLT聚集反應(yīng),PLT-I法的PLT數(shù)值常低于實際值,最終無法提供數(shù)據(jù)參考[4-5]。針對這種現(xiàn)象,臨床上提出使用枸櫞酸鈉、肝素鈉等其他抗凝劑替代EDTA-K2進行抗凝以解決EDTA-PTCP的PLT聚集現(xiàn)象[6],也有人提出在血中加入一定濃度的丁胺卡那霉素進行解聚[7-8]。近幾年,隨著血細胞分析儀的快速發(fā)展,有文獻報道邁瑞B(yǎng)C-6800 Plus(具有解聚功能)的熒光染色法(PLT-O法)對EDTA-PTCP患者的全血進行檢測時,能夠糾正PLT聚集[9-10]。本研究通過不同方法對25例EDTA-PTCP患者樣本中聚集PLT的PLT-O法解離效果進行比較,為實驗室處理EDTA-PTCP樣本提供參考。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源

1.1.1非EDTA-PTCP組 收集50例PLT高(PLT>300×109/L)、中(100×109/L≤PLT≤300×109/L)、低(PLT<100×109/L)值分布,檢測儀器無PLT報警且鏡檢無聚集,無白細胞、紅細胞碎片干擾的住院患者EDTA-K2抗凝靜脈血,每份標(biāo)本2 mL,檢測時間不超過4 h,其中男29例,女21例,年齡1～91歲,平均年齡57歲。

1.1.2EDTA-PTCP組 收集2020年1月至2021年4月PLT<100×109/L或在7天內(nèi)百分比減少50%靜脈血標(biāo)本;觀察標(biāo)本狀態(tài),排除因凝塊造成的假性PLT減低;推片染色,鏡檢發(fā)現(xiàn)有PLT聚集符合診斷為EDTA-PTCP的25例患者的EDTA-K2抗凝靜脈血,其中男11例,女14例,年齡26～98歲,平均年齡58歲。EDTA-PTCP組患者均進行確認實驗,患者在血細胞分析儀旁重新抽血置于EDTA-K2抗凝管中,若PLT數(shù)值隨標(biāo)本放置時間延長而下降且血涂片有血小板聚集則可確認為EDTA-PTCP患者。

參與本次研究的患者均簽署患者知情同意書,并得到廣州第一人民醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號:K-2019-176-01)。

1.2試劑和儀器 靜脈血無抗凝、EDTA-K2抗凝、枸櫞酸鈉抗凝、肝素抗凝真空采血管由廣州陽普醫(yī)療用品公司提供;丁胺卡那霉素由齊魯制藥公司生產(chǎn);瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液由BASO公司提供;Olympus雙目顯微鏡;SysmexXE-5000血細胞分析儀(XE-5000)和MindaryBC-6800 Plus(BC-6800 Plus)血細胞分析儀均使用原廠配套試劑和質(zhì)控品。

1.3實驗方法

1.3.1實驗前準(zhǔn)備 嚴格按照儀器說明書操作,操作前用配套的質(zhì)控物和校準(zhǔn)品進行質(zhì)控和校準(zhǔn),設(shè)置XE-5000檢測模式為:CBC+DIFF+NRBC+RET,BC-6800 Plus檢測模式為:CDR。

1.3.2實驗操作 將非EDTA-PTCP組的標(biāo)本顛倒混勻后分別在XE-5000和BC-6800 Plus上進行檢測,記錄PLT結(jié)果。對于EDTA-PTCP組的標(biāo)本,聯(lián)系患者血細胞分析儀旁抽血,無抗凝劑管、肝素鈉抗凝管、枸櫞酸鈉抗凝管各1管,EDTA-K2抗凝管3管(A、B、C管),每管2 mL靜脈血,采血過程嚴格依照操作規(guī)程進行。無抗凝劑管于XE-5000即時檢測(盡快檢測,避免血液發(fā)生凝固),用此檢測所得PLT數(shù)值為患者的準(zhǔn)確PLT數(shù)值;肝素抗凝管、枸櫞酸鈉抗凝管及EDTA-K2抗凝A管在不同時間段(即時、0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h),先后在XE-5000和BC-6800 Plus上按照EDTA-K2抗凝A管、肝素抗凝管、枸櫞酸鈉抗凝管的順序分別在XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-I和PLT-O模式下檢測PLT數(shù)值并進行血片觀察;患者EDTA-K2抗凝B、C管分別放置不同時間段(0.5 h、1.0 h)測定PLT數(shù)值后,兩管均加入濃度為100 mg/mL丁胺卡那霉素100 μL,加入丁胺卡那霉素后放置不同時間段(1.0 h、2.0 h、3.0 h)進行解離并先后在XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-I和PLT-O模式下測定各管PLT數(shù)值并進行血片觀察。

1.4數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計方法 EDTA-K2、肝素、枸櫞酸鈉3種抗凝管在不同時間段的檢測結(jié)果以無抗凝劑管即時檢測結(jié)果進行標(biāo)準(zhǔn)化處理,處理后的結(jié)果變成無抗凝管即時檢測值的解聚率和聚集率,標(biāo)準(zhǔn)化處理公式如下(Xi:3種抗凝管在不同時間段的檢測結(jié)果;X無抗凝劑:無抗凝劑管即時檢測結(jié)果;y1:處理后聚集率的結(jié)果;y2:處理后解聚率的結(jié)果):y1=(Xi-X無抗凝劑)/X無抗凝劑,y2=Xi/X無抗凝劑。

2 結(jié)果

2.1XE-5000與BC-6800 Plus對非EDTA-PTCP組PLT檢測結(jié)果比對 非EDTA-PTCP組50例樣本中,16例高值PLT,17例中值PLT,17例低值PLT,XE-5000與BC-6800 Plus的PLT-O檢測PLT的結(jié)果相關(guān)性較好,偏差較小,結(jié)果見圖1。

注:A,C分別是XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-I檢測模式和對非EDTA-PTCP組的50例樣本PLT數(shù)值的Passing-Bablok回歸分析和Bland-Altman偏差分析,B,D分別是XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-O檢測模式對非EDTA-PTCP組的50例樣本PLT數(shù)值的Passing-Bablok回歸分析和Bland-Altman偏差分析。

2.2實驗組結(jié)果

2.2.13種抗凝劑對EDTA-PTCP患者PLT的影響 用XE-5000的PLT-O通道檢測EDTA-PTCP組25例標(biāo)本的3種抗凝劑管中PLT聚集率,均隨標(biāo)本放置時間延長而上升,表明對這25例標(biāo)本來說,更換抗凝劑不會幫助血細胞分析儀對PLT的準(zhǔn)確計數(shù),放置各時間段后,血片上均可見PLT聚集,且隨時間延長,PLT聚集更嚴重,說明更換抗凝劑無法解決此25例EDTA-PTCP的PLT聚集。

2.2.2EDTA-K2抗凝管在各時間段PLT檢測結(jié)果與無抗凝劑管即時PLT檢測結(jié)果比對 將各時間段XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-O通道對A管檢測結(jié)果與無抗凝劑管即時檢測結(jié)果進行比對,XE-5000對A管即時檢測與無抗凝劑管即時檢測的結(jié)果無顯著差異(P>0.05),放置其他時間段(0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h)檢測結(jié)果均有顯著差異(P<0.05);在1 h內(nèi)BC-6800 Plus對A管檢測結(jié)果與無抗凝劑管即時檢測結(jié)果無顯著差異(P>0.05),放置2.0 h、3.0 h檢測結(jié)果均有顯著差異(P<0.05),結(jié)果見表1。BC-6800 Plus對A管在各時間段的PLT解聚率均大于XE-5000,見圖2。

表1 EDTA-K2抗凝管在各時間段PLT-O檢測結(jié)果與無抗凝劑管即時PLT檢測結(jié)果比對

圖2 EDTA-K2抗凝管在各時間段的PLT解聚率檢測結(jié)果

2.2.3不同時間內(nèi)加入丁胺卡那霉素后各模式下PLT聚集情況結(jié)果比對 對于XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-O檢測模式,BC-6800 Plus對不加丁胺卡那霉素(A管)和分別放置0.5 h和1 h后加入丁胺卡那霉素(B管和C管)抗凝管的各時間段PLT檢測結(jié)果相比于XE-5000更加接近準(zhǔn)確值(即時檢測值);對于不同時間加入丁胺卡那霉素的結(jié)果,抽血后放置0.5 h加入丁胺卡那霉素的解離效果稍微優(yōu)于抽血后放置1 h加入丁胺卡那霉素的解離效果,兩者解離的PLT數(shù)值在2 h以后趨于穩(wěn)定。結(jié)果見表2、表3和圖3。

表2 EDTA-K2抗凝管放置0.5 h加入丁胺卡那霉素(B管)后檢測PLT-O結(jié)果與無抗凝劑管即時檢測PLT結(jié)果比對

表3 EDTA-K2抗凝管放置1 h加入丁胺卡那霉素(C管)后檢測PLT-O結(jié)果與無抗凝劑管即時檢測PLT結(jié)果比對

圖3 XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-O模式對不同時間加入丁胺卡那霉素樣本的PLT解聚率

3 討論

根據(jù)國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(ICSH)推薦,全血細胞技術(shù)抗凝劑宜用EDTA,它與水相中的鈣離子形成穩(wěn)定的螯合物而阻止血液凝固,但隨著EDTA在臨床檢驗科的廣泛應(yīng)用,關(guān)于EDTA可誘導(dǎo)PLT發(fā)生體外異常聚集的報道也逐漸增多[6]。這種現(xiàn)象的發(fā)生會造成誤診又延誤時效,增加患者的經(jīng)濟負擔(dān),給臨床診治工作帶來很大困擾[6]。為此,尋找準(zhǔn)確計數(shù)此類患者血液中的PLT的最佳方案尤為重要。

面對EDTA-PTCP樣本,臨床上通常采用更換抗凝劑重新采血的方法[2]。根據(jù)2.2.1的結(jié)果,本研究的25例標(biāo)本更換為肝素或枸櫞酸鈉抗凝劑,其中的PLT數(shù)值依舊隨放置時間延長而下降,放置各時間段后,血涂片上也可觀察到PLT聚集現(xiàn)象。為進一步探索EDTA-PTCP標(biāo)本的解聚方法,邁瑞B(yǎng)C-6800 Plus中的PLT-O通道可以通過熒光試劑中的“解聚物質(zhì)”和形成渦流破壞PLT聚集[9-10]。本研究通過XE-5000和BC-6800 Plus的PLT-O通道檢測模式對非EDTA-PTCP組的50例標(biāo)本測試,其結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義,表明兩臺儀器對非PLT聚集標(biāo)本的PLT-O檢測結(jié)果相關(guān)性好。對放置各時間的EDTA-K2抗凝管(A管)標(biāo)本,BC-6800 Plus的PLT-O法對PLT的檢測結(jié)果均比XE-5000更接近真值,其解聚率也均大于XE-5000。為探索其他PLT解聚的效果,丁胺卡那霉素對聚集PLT具有解離作用,EDTA-K2抗凝管(B管)抽血后放置0.5 h加入丁胺卡那霉素的解離效果略優(yōu)于抽血后放置1 h加入丁胺卡那霉素(C管)的解離效果,兩者解離的PLT數(shù)值在2 h以后趨于穩(wěn)定;B、C兩管加入丁胺卡那霉素后于BC-6800 Plus的PLT-O檢測模式效果優(yōu)于在XE-5000的PLT-O檢測模式上,解聚后的PLT數(shù)值更接近于患者準(zhǔn)確PLT計數(shù)值。

對EDTA-PTCP的患者,建議聯(lián)系患者于血細胞分析儀旁即時檢測獲得準(zhǔn)確的PLT數(shù)值,若患者因某種原因無法做到即時檢測,可考慮在抽血后1 h內(nèi)用BC-6800 Plus檢測或1 h內(nèi)盡快加入丁胺卡那霉素進行解離并盡快送至檢驗科檢測。