體外膜肺氧合中血栓炎癥反應(yīng)及管路生物相容性的研究進展*

馬嘯龍,陳博,劉成,蘇揚,郭彎彎,喬蕊(.北京大學(xué)第三醫(yī)院檢驗科,北京009;.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部,北京009)

體外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation, ECMO)是在重度心肺功能衰竭時,使用機器部分或全部提供心、肺功能支持的一種生命支持技術(shù)[1]。自新型冠狀病毒爆發(fā)以來,ECMO在危重癥患者的支持治療方面取得了良好的成效。但是,ECMO在為患者提供心肺支持的同時,常伴隨出現(xiàn)一系列并發(fā)癥,如氧合器堵塞、感染等。而其中最重要的,則是由于血液長時間暴露在人工管道和膜表面,導(dǎo)致體內(nèi)非特異免疫的廣泛激活,觸發(fā)血栓形成、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,引發(fā)體內(nèi)系統(tǒng)性血栓炎癥反應(yīng),導(dǎo)致或進一步加重器官損傷[2-3]。目前,針對于ECMO管路接觸引起血栓和炎癥的主要預(yù)防措施是使用普通肝素,但抗凝藥物的使用是導(dǎo)致出血并發(fā)癥的原因之一,出血發(fā)生率可高達30%～70%[4],因此,ECMO管路材料的生物相容性改進同樣重要。本文就ECMO中血栓炎癥反應(yīng)的機制和ECMO管路材料生物相容性改進研究進展進行探究總結(jié),希望為臨床ECMO治療和相關(guān)研究提供參考。

1 ECMO中的血栓-炎癥反應(yīng)

當患者的血液接觸到ECMO的異物表面時,多個系統(tǒng)被迅速激活,主要包括凝血系統(tǒng)、補體系統(tǒng)、內(nèi)皮細胞、白細胞、血小板和細胞因子,這導(dǎo)致血栓形成和炎癥反應(yīng)同時存在。這種ECMO相關(guān)血栓-炎癥反應(yīng)類似于全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),可能會導(dǎo)致內(nèi)皮損傷和內(nèi)臟功能障礙[5-10]。

1.1凝血系統(tǒng) 凝血系統(tǒng)中參與ECMO管路接觸激活的主要有以下血漿蛋白:凝血因子(F)Ⅻ、FⅪ、高分子激肽原(high molecular weight kininogen,HMWK)和前激肽釋放酶(Fletcher因子)。

當血液與體外循環(huán)管路表面接觸時,內(nèi)源性凝血途徑迅速啟動,FⅫ激活為FⅫa,FⅫa在ECMO啟動后10 min內(nèi)即可達到最高水平[11]。FⅫa是凝血系統(tǒng)接觸激活的最初產(chǎn)物,FⅫa接下來激活FⅪ成為FⅪa,FⅪa將FⅨ轉(zhuǎn)化為FⅨa,進而激活FⅩ。

此外,FⅫa還可以將前激肽釋放酶轉(zhuǎn)化為活性激肽釋放酶,將HMWK轉(zhuǎn)化為緩激肽。激肽釋放酶和緩激肽除了起促進凝血的作用外,還能促進炎癥的發(fā)生,緩激肽具有多效性,包括刺激一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-10的釋放,體外循環(huán)中激肽釋放酶的產(chǎn)生也可以直接激活中性粒細胞。研究表明,通過使用一種抑制性抗體中和FⅫa可以在體外實驗和動物模型中減少ECMO的炎癥[12]。

一般來說,外源性凝血途徑在體外循環(huán)中的作用較小,因為外源性凝血途徑激活需要組織損傷和其引起的組織因子(tissue factor,TF)暴露。但實際上,TF也會存在于體外循環(huán)中,并處于促炎癥狀態(tài)[13]。在體外循環(huán)中,激活的補體能誘導(dǎo)單核細胞表達TF,TNF-α和IL-6也可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達可溶性TF[14]。

不管通過哪種途徑,共同途徑中激活的FⅩ將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶,凝血酶將纖維蛋白原裂解成纖維蛋白,導(dǎo)致血栓形成。另一方面,凝血酶除了在凝血中起作用外,在炎癥中也起著重要作用,其能增加內(nèi)皮細胞P-選擇素和E-選擇素的表達,以及中性粒細胞的黏附和激活。凝血酶還誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞產(chǎn)生血小板激活因子(platelet activating factor,PAF),這是另一種中性粒細胞的激活劑,能影響中性粒細胞表達促炎細胞因子[15]。

1.2血小板 在與ECMO管路接觸后,血小板被激活并開始黏附在纖維蛋白原上,促進凝血酶生成,引發(fā)血栓。近些年,人們發(fā)現(xiàn)除了參與血栓和止血的過程,血小板更是介導(dǎo)非特異免疫炎癥反應(yīng)和促進炎癥反應(yīng)放大的重要細胞[16]。它可以通過表面受體表達、顆粒內(nèi)容物釋放、微粒釋放等方式與許多免疫細胞相互作用,參與到機體的炎癥反應(yīng)中。

活化血小板上表達的CD40配體和內(nèi)皮細胞上的CD40相互作用,促進中性粒細胞的組織遷移,誘發(fā)內(nèi)皮細胞中趨化因子和黏附分子的產(chǎn)生和釋放。另外,活化血小板與中性粒細胞和單核細胞結(jié)合,可能誘導(dǎo)其分泌促炎癥細胞因子和單核細胞表達TF,引發(fā)這些免疫細胞的促炎作用。

此外,血小板的激活會引起形狀的改變,導(dǎo)致血小板向循環(huán)中釋放顆粒,血小板顆粒含有多種可溶性介質(zhì),包括趨化因子、促炎癥細胞因子、蛋白酶、黏附因子、生長因子、血管生成因子和止血因子[17]。這可以進一步促進其他血小板、白細胞和內(nèi)皮細胞對ECMO的炎癥反應(yīng)[18-19]。

近年來研究發(fā)現(xiàn),血小板活化后有一群發(fā)生氣球樣改變,稱為促凝血小板。促凝血小板內(nèi)結(jié)構(gòu)性表達炎癥小體組成部分[20],生成在無菌性炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用的IL-1β,并包裹在血小板微粒中釋放,這些血小板微?？梢酝ㄆ鋽y帶的 IL-1β介導(dǎo)內(nèi)皮和遠距離組織炎癥損傷[21]。研究表明在許多疾病中,血小板源性微粒的含量增多。例如在類風濕關(guān)節(jié)炎患者中,其關(guān)節(jié)液中含有大量的帶有血小板標志物CD41a的微粒[22]。但是血小板微粒與ECMO炎癥反應(yīng)的關(guān)系尚無相關(guān)研究。

1.3補體系統(tǒng) 補體系統(tǒng)是ECMO啟動時人體最先啟動的宿主防御系統(tǒng)之一。補體系統(tǒng)激活和裂解的循環(huán)產(chǎn)物,包括C3a、C4a和C5a,可以激活血小板和內(nèi)皮細胞,增加毛細血管的通透性和血管張力,引發(fā)炎癥反應(yīng)。

在補體激活的三種啟動途徑中,經(jīng)典途徑和凝集素途徑是由抗原-抗體復(fù)合物形成誘導(dǎo)的,而替代途徑可以直接由血液與ECMO管路的生物材料接觸裂解C3誘導(dǎo),因此,人們認為替代途徑是ECOM期間補體激活的主要手段。然而,在ECMO期間FⅫa激活補體蛋白C1、丙胺-肝素復(fù)合物形成、缺血-再灌注期間腸道釋放內(nèi)毒素,因此,補體系統(tǒng)也可以通過經(jīng)典途徑被激活[23-24]。

關(guān)于ECMO期間補體系統(tǒng)激活及其對患者預(yù)后影響的研究很少,且都是在20世紀90年代進行的[25-26],管路材料生物相容性優(yōu)化和離心泵的改進可能對ECMO期間補體激活水平產(chǎn)生影響,例如研究表明現(xiàn)代ECMO中普遍使用的肝素包被管路材料可以減少補體的激活[27]。

一些文獻分別對ECMO體外模型[28]、新生兒ECMO[28]和成年患者ECMO[25]中的補體激活進行了研究,顯示ECMO期間補體因子的水平迅速升高,峰值出現(xiàn)在1至2小時內(nèi)。Vallhonrat等[25]描述了兩名接受ECMO的成年急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)患者,其C3b和補體終末復(fù)合物(terminal complement complex,TCC)的水平迅速升高,這在ECMO開始的15 min內(nèi)很明顯。但水平在60 min前就達到峰值,180 min后開始下降,2 d后達到接近基線水平。

1.4白細胞 一般來說,白細胞被認為是ECMO期間誘發(fā)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要參與者之一。補體在體外循環(huán)開始時幾乎瞬間激活中性粒細胞,研究表明加入針對C5的人類單克隆抗體可明顯抑制激活[29]。ECMO的體外模型顯示,中性粒細胞的激活在最初的30 min內(nèi)急劇增加,幾小時內(nèi)達到高峰,此后逐漸下降,并且白細胞并不粘附在管路上[30]。

一旦被激活,中性粒細胞就會脫顆粒,釋放儲存的細胞毒性酶,如中性粒細胞彈性蛋白酶、骨髓過氧化物酶和溶菌酶。此外,通過呼吸爆發(fā),中性粒細胞也能夠釋放有細胞毒性的活性氧。在ECMO期間,中性粒細胞正是通過這些機制,在血管內(nèi)和遷移到組織后,成為器官損傷的影響者[31]。

單核細胞也會因ECMO被激活[30],盡管比中性粒細胞的激活更慢[23]。當受到適當?shù)拇碳r,單核細胞可能會分泌一些促炎癥的細胞因子。

1.5內(nèi)皮細胞 內(nèi)皮功能障礙是ECMO治療的危重癥患者不良后果的一個重要標志[32-33]。盡管不直接與體外循環(huán)接觸,血管內(nèi)皮在ECMO期間的炎癥反應(yīng)中也起著關(guān)鍵作用。與SIRS類似,體外循環(huán)產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)導(dǎo)致內(nèi)皮細胞廣泛激活,在一些細胞因子、補體產(chǎn)物和活性氧的作用下,內(nèi)皮細胞的基因表達發(fā)生改變。被激活的內(nèi)皮細胞反過來分泌促炎癥細胞因子并增加其黏附分子的表達,導(dǎo)致白細胞的遷移增加。

補體介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞激活很短暫,因此,促炎癥細胞因子循環(huán)水平的增加是內(nèi)皮細胞激活的主要原因。TNF-α和IL-1β可能是這個過程中最重要的細胞因子[23]。無論哪種機制的內(nèi)皮激活都會導(dǎo)致被激活的中性粒細胞的募集、滾動、黏附和遷移。

1.6紅細胞 盡管血液接觸ECMO人造管路不會對紅細胞產(chǎn)生影響,但紅細胞在ECMO血栓-炎癥反應(yīng)中仍起重要作用。當血液在ECMO治療中以不同速度通過管路、離心泵、氧合器,會導(dǎo)致紅細胞受到不同剪切力的作用,因此溶血的發(fā)生是不可避免的[34-35]。破裂的紅細胞會釋放出游離血紅蛋白、血紅素和鐵蛋白。研究表明,在豬ECMO模型的4 h循環(huán)期間,游離血紅蛋白大約每小時增加0.02 mmol/L[32]。

游離血紅蛋白和血紅素能通過觸發(fā)免疫系統(tǒng)和補體系統(tǒng),誘發(fā)或加劇炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,從而導(dǎo)致終端器官損傷。鐵蛋白從亞鐵狀態(tài)轉(zhuǎn)化為鐵狀態(tài)時,能產(chǎn)生高活性的羥基自由基,進一步促進氧化應(yīng)激和對脂質(zhì)及蛋白質(zhì)的相關(guān)修飾,改變細胞膜的極性和滲透性,使細胞更容易被裂解[36]。此外,由于溶血或紅細胞應(yīng)激反應(yīng),紅細胞會向循環(huán)中釋放各種促炎癥細胞因子和趨化因子。

2 ECMO管路生物相容性改進

多年來,人們一直希望通過優(yōu)化ECMO設(shè)備來減少患者的并發(fā)癥,例如為減少高剪切力,可以通過優(yōu)化離心泵設(shè)計和在臨床中調(diào)整插管位置和深度改變患者轉(zhuǎn)速流量比而實現(xiàn)。人們同時希望通過ECMO管路的修飾來模仿生理條件,提高材料的生物相容性,減少患者血液與管路接觸引發(fā)的血栓形成和炎癥反應(yīng)。目前主要的管路生物相容性修飾方式可以分為三大類[37]:生物活性表面、生物惰性表面以及表面的內(nèi)皮細胞化。

2.1生物活性表面 生物活性表面指的是將能發(fā)揮生物活性的物質(zhì)涂抹包被在材料上,其中發(fā)展最早的包被方式是將肝素包被在ECMO管路上,通過降低全身肝素化來減少出血的風險[38],Carmeda公司在1983年就開發(fā)了商品化的肝素涂層ECMO管路[39-40]。肝素涂層管路通過肝素的局部釋放可以最大限度地減少血液與人造管路接觸時產(chǎn)生的負面影響[41],早期研究發(fā)現(xiàn)肝素涂層能減少45%的補體激活[42]。研究表明,相比于沒有涂層的設(shè)備,有肝素的氧合器可以減少以下影響:接觸后凝血系統(tǒng)激活、補體系統(tǒng)激活,血小板激活,粒細胞激活,炎癥,平衡紊亂和腦損傷等[43]。

然而,一些研究表明,氧合器上的肝素涂層減少了部分炎癥反應(yīng)和血栓形成,但與無涂層的氧合器相比,其他并發(fā)癥幾乎相同。目前,大部分相關(guān)研究是在短時間(小于6 h)的體外實驗或在短期體外循環(huán)中進行的,因此對于ECMO這類需長期支持的治療,這些研究結(jié)果并不充分。

NO包被是目前一種比較接近應(yīng)用于臨床的包被方式,NO由內(nèi)皮細胞釋放以誘導(dǎo)血管舒張,能促進血小板和血管平滑肌細胞中環(huán)狀單磷酸鳥苷(GMP)的增加,由此抑制血小板的活化和黏附[37]。研究表明,在體外循環(huán)中NO涂層具有良好的抗血栓形成特性[44]。目前的NO涂層產(chǎn)生和輸送NO的能力不足,保存期也不能超過4周,限制了其應(yīng)用于長期建立體外生命支持患者中的應(yīng)用[4]。目前NO涂層尚無商品化的ECMO管路應(yīng)用,但已應(yīng)用于臨床支架產(chǎn)品[45]。

2.2生物惰性表面 構(gòu)建生物惰性表面的目的是減少血液與管路接觸時的生物反應(yīng)。1980年以來,人們將清蛋白用作涂層材料,構(gòu)建具有親水表面的基礎(chǔ)層,能減少對疏水表面的生物反應(yīng)[46],它通常適用于肝素禁忌癥的情況[47]。清蛋白缺乏與血小板、白細胞和凝血酶的結(jié)合序列,因此清蛋白用作涂層時,可以減緩血小板的激活。但是在循環(huán)過程中,清蛋白會被血漿蛋白取代,因此清蛋白的涂層不能維持長時間穩(wěn)定[47]。目前常作為多層生物活性涂層的一部分,與肝素聯(lián)合使用。

目前有很多研究嘗試通過將高分子聚合物包被在ECMO管路壁,降ECMO管路的反應(yīng)性。聚-2甲氧基乙基丙烯酸酯(PMEA)是一種血液相容的聚合物,由疏水性的聚乙烯鏈和溫和的親水尾部組成,能為血液創(chuàng)造一個親水性的表面,蛋白質(zhì)和血小板不會變性或黏附在上面。體外循環(huán)的動物模型中也顯示親水表面可以抑制補體系統(tǒng)的激活[37]。在接受冠狀動脈旁路移植的患者中,PMEA涂層在減少血小板黏附、聚集和蛋白質(zhì)吸附方面具有優(yōu)勢[48]。然而,其他研究發(fā)現(xiàn),使用PMEA涂層患者術(shù)后白細胞減少和全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的風險較高,且血小板聚集沒有減少[49]。

與此類似的還有聚氧化乙烯(PEO)和聚-MPC-BMA-TSMA(PMBT),一些體外實驗和動物模型中,證明了這些涂層與肝素涂層在一些方面沒有差異[50],并優(yōu)于無涂層管路[51]。但是,對于這些高分子材料的包被是否優(yōu)于肝素包被,目前尚沒有共識。

2.3表面內(nèi)皮細胞化 表面內(nèi)皮化是指希望通過在管路表面種植細胞構(gòu)建內(nèi)皮層,實現(xiàn)血液和材料之間完全的血液相容性。相比于其他希望通過模仿內(nèi)皮細胞特性來調(diào)節(jié)血栓-炎癥的包被方式,用內(nèi)皮細胞將實現(xiàn)更高的血液相容性。目前有研究調(diào)查了在ECMO氣體交換膜上建立內(nèi)皮單層的可行性[52],由于內(nèi)皮細胞不易粘附在疏水表面[47],因此材料的基底必須能使內(nèi)皮細胞附著和粘合,同時保留內(nèi)皮細胞的活力。研究發(fā)現(xiàn),肝素/清蛋白涂層的膜纖維是一個良好的基底,可使內(nèi)皮細胞附著形成內(nèi)皮單層。此外,肝素/清蛋白涂層還能避免未被細胞覆蓋區(qū)域發(fā)生血栓[53]。

但是,內(nèi)皮化技術(shù)的成本、生產(chǎn)時效、質(zhì)量保證等問題仍未解決。例如在低溫條件下,內(nèi)皮化氧合器的保質(zhì)期為2周[54],而其他涂層氧合器的保質(zhì)期一般為2年。因此這仍是一個需大量實驗研究的領(lǐng)域。

3 總結(jié)

ECMO具備強大的心肺支持能力,在危重患者救治中發(fā)揮著重要的作用,而隨著設(shè)備的完善和醫(yī)學(xué)的發(fā)展,這種支持的應(yīng)用在未來可能會繼續(xù)增加。盡管目前在改進ECMO設(shè)備和保護血液方面已有一些進展,但患者的死亡率仍很高。因此,充分研究ECMO患者血栓炎癥反應(yīng)的發(fā)病機制,以及如何通過優(yōu)化ECMO管路及抗凝策略抑制血栓炎癥反應(yīng),具有很高的臨床意義和價值。