QuEChERS結合LC-MS/MS法測定燈盞花中農藥殘留*

楊光梅，黃 燕，盧 琦，李杰麗，任云偉，魏 波，范銀英，李浩成，郭利娟

(1.云南現代民族藥工程技術研究中心，云南 昆明 650217；2.國家中藥現代化工程技術研究中心 民族藥分中心，云南 昆明 650217；3.昆明理工大學附屬醫(yī)院 云南省第一人民醫(yī)院MICU科，云南 昆明 650032)

燈盞花主產于云南，是短葶飛蓬(菊科植物)Erigeron breviscapus (Vant.)Hand-Mazz的干燥全草，是比較常用的中藥材，又稱為燈盞細辛、東菊、地頂草等[1]。主要的有效成分為燈盞乙素和野黃芩苷，具有發(fā)表散寒、消炎、止痛之功效。是燈盞細辛顆粒、燈盞細辛口服液、燈盞花注射液和注射用燈盞花素等制劑主要原材料[2]。種植期間會受到病蟲害的影響，主要害蟲是蝸牛、蚜蟲、菜青蟲、地老虎。燈盞花在投料使用前雖然經過了適當的晾曬、干燥等處理，但作為全草藥材直接投入使用，非常有必要對其所含的農藥殘留成分，尤其是國家農業(yè)部及相關部門已明令禁止使用的高毒、劇毒、高殘留、致癌、致畸、致突變的農藥組分及《中國藥典》2020版四部農藥殘留的規(guī)定進行控制和考察，保證患者用藥安全，建立適用于燈盞花藥材的農藥殘留測定方法[3]。近年來，QuEChERs 發(fā)展較快已成為國際上廣泛并得認可的一種用于中藥材、農副產品等殘留檢測的快速樣品前處理技術.[4-7]本法有高效、快速、簡單、科學等特點，在農藥殘留檢測中得到普遍廣泛應用[8]。本實驗采用QuEChERs-超高效液相色譜-串聯質譜法測定中藥燈盞花29種禁用農藥殘留。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀 (Agilengt 1290 infinity-6470 LC/MS美國安捷倫公司)；電子天平 (SI-224賽多利斯科學儀器有限公司)；分液漏斗震蕩器(MMW東京理化器械株式會社)；多功能冷凍離心機 (Rotina 380R上海凌儀生物科技有限公司)；震蕩器 (VORTEX 海門市其林貝爾儀器制遠有限公司)。

1.1.2 試劑

乙腈 (GR，賽默飛世爾科技)、甲酸胺 (GR，天津市風船化學試劑科技開發(fā)有限公司)、磷酸、冰醋酸 (AR，國藥集團試劑有限公司)、QuEChERs SPE凈化管 (批號：6559539-01，北京迪馬科技公司)。

1.1.3 對照品

禁用農藥混合對照溶液(批號：610020-202001，中國食品藥品檢定研究院)

1.1.4 樣品

所用15批燈盞花藥材經鑒定均為正品，燈盞花：(批號：210701、220101昆明道地中藥飲片廠；批號：190103 云南金發(fā)藥業(yè)有限公司；批號：200526 云南展熠藥業(yè)有限公司；批號：210226、210510、210526 昆明市官渡區(qū)肖友明中藥材經營部；批號：211201、 211202、211203、211204、220301、220302、220303、22030昆明廣有堂中藥材經營部)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 色譜柱

Infinity Poroshell 120 EC-C18 (3.0 mm ×100 mm，2.1 μm)

2.1.2 流動相

A：0.1%甲酸溶液 (含5 mmoL甲酸銨)

B：乙腈-0.1%甲酸水溶液 (含5 mmoL甲酸銨)(95∶5)并按表.進行梯度洗脫：

表1 梯度洗脫表

2.1.3 流動相

色譜柱柱溫：40 ℃，流速：0.3 mL/min

2.1.4 進樣量

供試品溶液和對照品溶液：2 μL

2.1.5 質譜檢測器

干燥氣 (N2)流速：11.0 L/min；霧化氣 (N2)壓力：40 psi；干燥氣溫度：250 ℃；毛細管出口電壓：3500 V；靶氣流速：11.0 L/min；靶氣溫度：350 ℃；噴嘴電壓：0 V。

2.1.6 檢測模式

多反應監(jiān)測 (MRM)模式

2.2 對照品溶液的配制

精密量取對照品 0.5 mL 置于 10 mL 容量瓶中，加色譜級乙腈稀釋至刻度，混勻，獲得對照品儲備液。

2.3 基質溶液制備

取燈盞花空白基質樣品，同2.5供試品溶液制備方法制成溶液作為空白基質。

2.4 標準工作溶液的制備

精密量取對照品儲備溶液 10 μL 并加入空白基質 600 μL 混勻，即質量濃度約為 5 ng/mL 的混合標準溶液。精密吸取上述混合標準溶液 20 μL，精密加入空白基質 600 μL，混勻，即得質量濃度約為 1000 ng/mL 的混合標準溶液，用相同的方式依次稀釋分別得到質量濃度約為10、20、40、60、80、100、200 ng/mL 的混合標準工作溶液。

2.5 供試品溶液配制

取不同批次來源的供試品，粉碎，粉末 (并過三號篩)，精密稱定 3 g，放置于聚苯乙烯具塞離心管中，加入 15 mL 1%冰醋酸溶液，在渦旋儀上混勻讓藥粉充分浸潤，放置 30 min 以上，精密加入 15 mL 色譜乙腈與內標溶液 100 μL，混勻，置振蕩器上劇烈震蕩(500次/min)10 min 以上，加入質量比例為 (1∶4)無水乙酸鈉與無水硫酸鎂的混合粉末 7.5 g，及時搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩(500次/min)10 min 左右，于冰浴中冷卻 10 min，離心 (3500轉/min)5 min。取上清液 9 mL，置已預先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管[N-丙基乙二胺(PSA)300 mg，無水硫酸鎂 900 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠 300 mg，石墨化炭黑 90 mg，硅膠 300 mg]中，使物料充分混勻，再置振蕩器上劇烈震蕩(600次/min)10 min 使凈化完全，離心 (4500轉/min)10 min，吸取上清液，用微孔濾膜 (0.22 μm)濾過，作為供試品溶液 。

分別取對照品溶液、供試品溶液、空白基質溶液 2 μL 進樣，圖譜如下圖1、圖2、圖3。

圖1 對照品譜圖

圖2 樣品譜圖

圖3 空白基質譜圖

2.6 檢出限、定量限、線性關系與線性范圍考察

分別精密吸取上述2.4制備好的禁用農殘對照品溶液 2 μL 注入液相色譜儀按上述色譜條件測得峰面積，以峰面積積分值進行回歸處理。結果見表2。

表2 LC-MS/MS各分析物的檢測結果

2.7 系統精密度、準確度(加標回收率)

參照對照品溶液配制與供試品溶液配制方法，配制約 50 ng/mL 對照品溶液1份，對照品溶液連續(xù)進樣6針，分別記錄29項禁用農藥的保留時間與峰面積?？山邮軜藴剩焊鞣宓谋Ａ魰r間RSD≤2%(n=6)，各峰的峰面積RSD≤15%(n=6)。

采用全程加標法，即取約 3.0 g 燈盞花藥材粉末，精密稱定，加入農藥殘留對照品儲備液0.75、1.5、2.25 mL 各3份，對照品的加入量為與所取供試品中待測定成分量之比控制在1∶0.5、1∶1、1∶1.5左右，之后按照供試品溶液制備方法配制。按50%，100%，150%質量分數分別配制9份供試品加標溶液。對照品、供試品溶液各進樣1次，對照品溶液、供試品溶液分別進樣 2 μL，結果見表3。

表3 系統精密度、回收率結果

2.8 樣品定性、定量測定

2.8.1 定性測定

進行樣品定性分析測定時，如果檢出的色譜峰與對照品的保留時間一致，在扣除背景后的質譜圖中，被選擇的2個監(jiān)測離子對都同時出現，而且所選擇的監(jiān)測離子對與對照品的監(jiān)測離子對峰面積比一致(相對比例大于50%，允許偏差±20%：相對比例大于20%～50%，允許偏差±25%：相對比例大于10%～20%，允許偏差±30%；相對比例小于10%，允許偏差±50%)，則可判斷樣品中存在該農藥。

2.8.2 定量測定

取上述制備好的對照品溶液和供試品溶液各2μL注入，計算各分析物含量。結果：15批燈盞花藥材中均未檢查出29種分析物。

3 討論

樣品取樣量的確定—燈盞花藥材經加工處理后為干燥藥材，含水量不多。3 g的樣品量比較方便合適，且具有一定的代表性。不會因取樣量過大，而導致試劑、樣品的浪費及環(huán)境的污染。最后處理得到供試品溶液中藥材含量為0.5 g/mL，滿足藥材痕量分析要求。

提取后的燈盞花溶液含有植物甾醇、樹膠、樹脂、鞣質、揮發(fā)油等物質，參考文獻相關報道，快速樣品處理法 (QuEChERS)相對直接提取法能更好地去除雜質、防止被測組分和回收率的流失、保證試驗的準確性。

離子對的優(yōu)化與判斷標準根據全掃描質譜得到標準農藥的各保留時間劃分時間段，盡可能減少在每一時間段所檢測目標化合物的數量。在質譜圖中，選擇3對特征離子，豐度較高的一對作為定量離子對，其余兩對為定性離子對。采用保留時間和離子豐度比定性，再用定量離子對的峰面積定量.

參照《中國藥典》2020年版四部通則2341農藥殘留測定法第五法：高效液相色譜-串聯質譜法對15批燈盞花進行農藥殘留量的測定，其標準限度按 《中國藥典》2020年版四部通則0212藥材和飲片檢定通則項下33種禁用農藥不得檢出 表執(zhí)行，其中高效液相色譜-串聯質譜法收載30種農藥測定，但氣相色譜-串聯質譜法也有部分項目重復檢測，考慮分析物甲基異柳磷在氣相色譜-串聯質譜法檢測效果較佳，所以不在重復進行測定只測定上述29項結果均為未檢出。根據上述探索性研究結果表明，該方法基本可適用于燈盞花禁用農藥殘留的質量控制。

4 結論

本研究建立了燈盞花藥材中禁用農藥殘留量測定法。對不同來源、方法適用性、分析物含量等方面進行了考察研究，發(fā)現能按此超高效液相色譜-串聯質譜法對燈盞花藥材進行29種禁用農藥殘留測定，此方法能準確、快速、科學、有效地控制產品質量。確定取樣量為3 g，采用快速樣品處理法 (QuEChERS)處理，按超高效液相色譜-串聯質譜法為燈盞花29種禁用農藥殘留測定法。