紫錐菊近三倍體的非整倍體離體擴(kuò)繁能力分析

李慶玲，黎幸蓮，戴 倩，楊躍生*

（1.云浮市南藥研究院，廣東 云浮 527300；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

紫錐菊(Echinacea purpureaL. )為菊科(Asteraceae)紫錐菊屬(EchinaceaL.)植物，原產(chǎn)于北美，因具有抗菌、消炎、提升人體免疫力等藥用功效而備受市場(chǎng)青睞。同時(shí)，紫錐菊又因花色鮮艷，花期長(zhǎng)，而廣泛用于園藝植物觀賞和切花生產(chǎn)。與觀賞紫錐菊育種［1］相比，藥用成分含量高的藥用紫錐菊品種的培育相對(duì)滯后，且藥用成分含量在紫錐菊新品種審定中是非常重要的指標(biāo)。倍性育種是一種重要的生物技術(shù)育種方法，相對(duì)于低倍體，多倍體具有營(yíng)養(yǎng)器官巨大化和次生代謝產(chǎn)物含量更高等優(yōu)點(diǎn)。多倍體尤其是三倍體在有性繁殖過(guò)程中非常容易產(chǎn)生非整倍體后代［2-3］。非整倍體由于特定染色體的附加或減少會(huì)使得位于該染色體上的基因劑量增加或減少，相對(duì)于二倍體和四倍體，性狀變化具有多樣性；同時(shí)，非整倍體具有重要的遺傳學(xué)價(jià)值，如探究基因與染色體的關(guān)系，確定基因所屬的連鎖群或染色體臂等。與動(dòng)物相比，植物對(duì)非整倍體具有更強(qiáng)的忍耐力［4］，如香豌豆(Lathyrus sativusL.)［5］、蘋果屬(Malus)［6］和菊科植物［7］等的非整倍體均可以健壯生長(zhǎng)并作為遺傳研究材料或者種質(zhì)資源在育種上應(yīng)用，這使得植物的繁殖方式更加多樣化，通過(guò)大量培育具有不同染色體數(shù)目和構(gòu)成的非整倍體材料以達(dá)到繁育的目標(biāo)。

云浮市南藥研究院/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)楊躍生研究員課題組從2003年開(kāi)始從事紫錐菊倍性育種研究，相繼成功培育出單倍體［8］、四倍體［9］、三倍體、六倍體［10］、和八倍體［11］等植株。相對(duì)于二倍體，四倍體表現(xiàn)出更粗壯的植株長(zhǎng)勢(shì)和更高的藥用物質(zhì)含量［12-13］。紫錐菊多倍體，尤其是三倍體與二倍體自然雜交授粉產(chǎn)生大量非整倍體后代，Li等［3］在比對(duì)二、三倍體雜交后代的21個(gè)非整倍體株系時(shí)發(fā)現(xiàn)，13個(gè)株系的全株菊苣酸含量高于二、三倍體親本，其中有5個(gè)株系的全株菊苣酸含量接近二、三倍體親本的2倍以上；有14個(gè)非整倍體株系的全株綠原酸含量高于二、三倍體親本，其中有1個(gè)株系的全株綠原酸含量接近二、三倍體親本的5倍。紫錐菊四倍體也被報(bào)道過(guò)含有更高的菊苣酸和綠原酸含量［12-14］，但還沒(méi)有達(dá)到非整倍體的增長(zhǎng)幅度。

因非整倍體育性降低，不能正常進(jìn)行有性生殖，必須通過(guò)無(wú)性擴(kuò)繁的方式進(jìn)行繁殖。本課題組在二、四倍體雜交過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了接近三倍體的非整倍體株系，通過(guò)對(duì)其中4個(gè)非整倍體株系（染色體數(shù)目分別為31、32、32和34條，分別命名為CN31、CN32-1、CN32-2、CN34）系統(tǒng)性地開(kāi)展離體擴(kuò)繁能力研究，以期為后續(xù)選育和批量繁殖優(yōu)良非整倍體株系提供參考。

1 材料與方法

1.1 外植體制備及接種方式

1.1.1 不定芽誘導(dǎo) 切取無(wú)菌克隆苗的葉片、葉柄和根作為外植體。葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小方塊，葉柄和根均切成0.7 cm的長(zhǎng)度。外植體接種時(shí)，以葉片的上表面接觸培養(yǎng)基，葉柄和根外植體則隨機(jī)平放在培養(yǎng)基上并稍加按壓使其與培養(yǎng)基緊密接觸。每個(gè)培養(yǎng)瓶接種7個(gè)外植體，每個(gè)處理設(shè)6次重復(fù)。

1.1.2 不定芽生根 將高約2 cm，生長(zhǎng)狀態(tài)正常，至少有2片展開(kāi)葉的不定芽接種至生根培養(yǎng)基上，30 d后觀察并統(tǒng)計(jì)根系形成情況。

1.2 培養(yǎng)基配制

在培養(yǎng)基中添加了試驗(yàn)劑量的激素、非激素等成分后，另外添加30 g/L蔗糖、7 g/L瓊脂、0.1 g/L肌醇，用透氣性好的塑料瓶分裝，每個(gè)培養(yǎng)瓶分裝約40 mL；所有培養(yǎng)基pH值調(diào)至6.0，于121 ℃、100 kPa濕熱滅菌15 min。

1.3 培養(yǎng)條件

不定芽誘導(dǎo)、不定芽生根試驗(yàn)均在（25±2）℃的恒溫培養(yǎng)室中進(jìn)行，正常光照時(shí)間約12 h/d，光強(qiáng)約2000 lx。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

紫錐菊在不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生玻璃化不定芽，這類不定芽不能正常生根，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)逐漸褐化死亡，為無(wú)效芽。因此，本研究在不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中只統(tǒng)計(jì)每個(gè)外植體誘導(dǎo)的有效不定芽數(shù)，每個(gè)培養(yǎng)瓶取平均值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s法檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素對(duì)紫錐菊非整倍體有效不定芽誘導(dǎo)的影響

2.1.1 BA BA是一種最常用的植物細(xì)胞分裂素，對(duì)紫錐菊不定芽誘導(dǎo)有良好的刺激作用。4個(gè)非整倍體株系葉片、葉柄和根外植體誘導(dǎo)的不定芽分化情況如圖1所示。直觀上看，CN31不定芽數(shù)最多，誘導(dǎo)效果最好，且4個(gè)非整倍體株系葉片的誘導(dǎo)效果優(yōu)于葉柄和根外植體的。

圖1 4個(gè)紫錐菊非整倍體株系葉片、葉柄和根外植體的不定芽誘導(dǎo)情況

本研究設(shè)定的BA質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L，在一定的范圍內(nèi)，隨BA質(zhì)量濃度遞增，4個(gè)非整倍體株系誘導(dǎo)的有效不定芽數(shù)遞增，不同非整倍體株系及其不同的外植體對(duì)BA的敏感度不同（表1）。當(dāng)CN31的葉片在添加0.8 mg/L BA培養(yǎng)基中誘導(dǎo)時(shí)，其有效不定芽數(shù)最多，為1.96個(gè)；在添加0.4 mg/L BA培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)效果次之，但兩者差異不顯著；葉柄和根的最適BA質(zhì)量濃度為0.4 mg/L，此時(shí)有效不定芽數(shù)分別為1.38個(gè)和2.04個(gè)。CN32-1葉片外植體不定芽誘導(dǎo)的最適BA質(zhì)量濃度為0.4 mg/L，葉柄、根的分別為0.1、0.2 mg/L；葉柄外植體的有效不定芽數(shù)高于葉片和根的。CN32-2的葉片、葉柄、根外植體的最適BA濃度分別為0.8、0.4和0.4 mg/L，不定芽誘導(dǎo)率整體較低。CN34的葉片和葉柄外植體在添加0.4 mg/L BA時(shí)，有效不定芽數(shù)最多，分別為1.13、1.03個(gè)；根在添加0.2 mg/L BA時(shí)有效不定芽數(shù)最多，但也只有0.53個(gè)。綜上，取0.4 mg/L BA對(duì)4個(gè)非整倍體誘導(dǎo)不定芽較為適宜，CN31的不定芽誘導(dǎo)能力優(yōu)于其他3個(gè)株系的。

表1 不同BA質(zhì)量濃度對(duì)紫錐菊非整倍體有效不定芽數(shù)的影響 個(gè)

2.1.2 NAA NAA是一種人工合成的植物生長(zhǎng)素，與IAA相比能耐高溫、不易降解，因此廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)技術(shù)中。本研究設(shè)定的NAA質(zhì)量濃度分別為0(CK)、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025和0.030 mg/L，與含0.4 mg/L BA的MS培養(yǎng)基配合使用。由表2可知，NAA顯著影響非整倍體紫錐菊不定芽誘導(dǎo)，隨NAA質(zhì)量濃度的升高，紫錐菊不定芽誘導(dǎo)率明顯升高，到達(dá)高值后誘導(dǎo)率逐漸下降。CN31在添加0.015 mg/L NAA時(shí)，葉片、葉柄和根外植體的有效不定芽數(shù)均達(dá)到最大值，且與其他處理差異明顯。CN32-1葉片和根外植體不定芽誘導(dǎo)的最佳NAA質(zhì)量濃度為0.010 mg/L，而葉柄的為0.015 mg/L。CN32-2和CN34葉片外植體對(duì)NAA的耐受性較高，在添加0.025 mg/L NAA時(shí)有最多有效不定芽；葉柄和根外植體的最適NAA質(zhì)量濃度均為0.020 mg/L。綜上，CN31誘導(dǎo)的有效不定芽數(shù)高于其他3個(gè)株系的。

表2 不同NAA質(zhì)量濃度對(duì)紫錐菊非整倍體株系有效不定芽數(shù)的影響 個(gè)

2.1.3 DA-6 DA-6是一種高效植物生長(zhǎng)物質(zhì)，具有很高的生物活性，對(duì)多種農(nóng)作物具有顯著的增產(chǎn)、抗逆、抗病，改善品質(zhì)、催熟等功效。本研究設(shè)置6個(gè)DA-6質(zhì)量濃度：0（CK）、0.02、0.04、0.08、0.16和0.32 mg/L，配合添加了0.01 mg/L NAA、0.4 mg/L BA的MS培養(yǎng)基使用。由表3可知，4個(gè)非整倍體株系及其不同外植體對(duì)DA-6的敏感程度不同，其中，根對(duì)DA-6最為敏感，僅在濃度很低時(shí)能促進(jìn)不定芽再生；葉片的敏感度次之；葉柄則在較高DA-6濃度時(shí)才表現(xiàn)出促進(jìn)作用。CN31葉片和根外植體在0.04 mg/L DA-6時(shí)有效不定芽數(shù)最高，而葉柄的最佳DA-6質(zhì)量濃度為0.08 mg/L，平均每個(gè)外植體有效不定芽數(shù)為3.50個(gè)，高于葉片和根外植體的。CN32-1葉片和葉柄的最佳DA-6質(zhì)量濃度分別為0.08和0.16 mg/L，DA-6對(duì)根無(wú)明顯的促進(jìn)作用。CN32-2葉片和葉柄外植體分別在添加0.02和0.04 mg/L DA-6時(shí)，有效不定芽數(shù)最高，對(duì)葉柄的促進(jìn)作用尤其明顯，添加0.02 mg/L DA-6對(duì)根外植體表現(xiàn)出微弱促進(jìn)作用，當(dāng)添加量高于0.02 mg/L時(shí)就開(kāi)始抑制不定芽再生。在添加0.04 mg/L DA-6時(shí)，CN34葉片和葉柄外植體有效不定芽數(shù)最高，對(duì)葉片的促進(jìn)作用更為明顯；添加0.02 mg/L DA-6對(duì)根外植體有微弱的促進(jìn)作用。

表3 不同DA-6質(zhì)量濃度對(duì)紫錐菊非整倍體植株有效不定芽數(shù)量的影響 個(gè)

2.2 非激素條件對(duì)紫錐菊非整倍體有效不定芽誘導(dǎo)的影響

2.2.1 MS大量元素 大量元素含有豐富的礦質(zhì)元素，是組培實(shí)驗(yàn)室或工廠使用量最大的耗材之一。為探究不同比例的MS大量元素對(duì)紫錐菊非整倍體不定芽誘導(dǎo)的影響，本試驗(yàn)設(shè)定MS大量元素為標(biāo)準(zhǔn)比例的1/4、1/2、2倍，以標(biāo)準(zhǔn)比例為對(duì)照，4個(gè)處理分別表示為：1/4MS、1/2MS、MS和2MS。由表4可知，大量元素比例對(duì)紫錐菊不同非整倍體有效不定芽誘導(dǎo)的影響有差別，但最適比例是1/2MS和MS。CN31株系的3種外植體在1/2MS和MS培養(yǎng)基中有效不定芽數(shù)最多，CN32-1在1/2MS培養(yǎng)基中有效不定芽數(shù)量最高，CN32-2的葉片、葉柄在MS培養(yǎng)基中有效不定芽誘導(dǎo)效果最好，CN34在1/2MS培養(yǎng)基中3種外植體的有效不定芽數(shù)量均最佳。如果大量元素比例過(guò)低，外植體會(huì)因?yàn)榈貌坏阶銐虻牡V質(zhì)營(yíng)養(yǎng)而逐漸褐化死亡。

表4 不同MS大量元素比例對(duì)紫錐菊非整倍體有效不定芽數(shù)量的影響 個(gè)

2.2.2 土豆泥 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加土豆泥可以減輕玻璃化現(xiàn)象，能提高有效不定芽數(shù)量。為進(jìn)一步優(yōu)化土豆泥的添加比例，本研究設(shè)置5個(gè)添加劑量：0（CK）、2.5%、5.0%、7.5%和10.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），均配合添加0.01 mg/L NAA、0.4 mg/L BA的MS培養(yǎng)基。由表5可知，CN31本身玻璃化嚴(yán)重，在添加2.5%土豆泥時(shí)3種外植體有效不定芽數(shù)量最多，但當(dāng)添加量超過(guò)2.5%時(shí)就出現(xiàn)顯著的抑制作用。CN31-2自身玻璃化不嚴(yán)重，在添加土豆泥后3種外植體表現(xiàn)不一：葉片對(duì)土豆泥不敏感，葉柄在添加5.0%土豆泥時(shí)有效不定芽數(shù)量最高，根在添加2.5%土豆泥時(shí)有效不定芽數(shù)最高。添加5.0%的土豆泥能促進(jìn)CN32-2葉片和葉柄外植體的有效不定芽誘導(dǎo)，對(duì)根外植體的促進(jìn)作用不明顯。CN34本身玻璃化不嚴(yán)重，添加2.5%的土豆泥就能促進(jìn)有效不定芽誘導(dǎo)，添加太多反而起到抑制作用。因此，針對(duì)玻璃化嚴(yán)重的株系，在培養(yǎng)過(guò)程中添加適當(dāng)比例的土豆泥能有效抑制玻璃化，提高有效不定芽比例；玻璃化不嚴(yán)重的株系不必添加土豆泥。

表5 不同土豆泥含量對(duì)紫錐菊非整倍體有效不定芽數(shù)的影響 個(gè)

2.2.3 光暗條件 光照是影響植物生長(zhǎng)的重要因素。將4個(gè)非整倍體株系的葉片、葉柄和根外植體接種在含0.4 mg/L BA、0.01 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中，分為2組：一組放置于完全黑暗條件下培養(yǎng)2周后轉(zhuǎn)置正常光照培養(yǎng)，另一組一直置于正常光照下培養(yǎng)。由表6可知，短暫的暗培養(yǎng)可以有效提升葉片、葉柄和根外植體的有效不定芽誘導(dǎo)能力，但對(duì)不同非整倍體株系的提升效果不一致，對(duì)CN31的提升效果更為明顯。該結(jié)果與本課題組早期在二倍體上的研究結(jié)果一致。

表6 光照條件對(duì)紫錐菊非整倍體有效不定芽數(shù)的影響 個(gè)

2.3 NAA對(duì)紫錐菊非整倍體生根的影響

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)紫錐菊的不定芽生根時(shí)，NAA比IBA有更好的誘導(dǎo)能力，本試驗(yàn)設(shè)定5個(gè)NAA質(zhì)量濃度：0（CK）、0.01、0.03、0.05和0.08 mg/L。由圖2可知，4個(gè)非整倍體株系在不含或含較低質(zhì)量濃度NAA時(shí)，植株長(zhǎng)勢(shì)較差，根細(xì)，次根很少。隨著NAA質(zhì)量濃度的升高，地上部分隨地下部分的生長(zhǎng)而生長(zhǎng)，根明顯表現(xiàn)出紫紅色。CN31在添加0.05 mg/L NAA時(shí)，植株整體長(zhǎng)勢(shì)較好；CN32-1的主根數(shù)在添加0.08 mg/L NAA時(shí)最多，根直徑最粗，考慮地上部分長(zhǎng)勢(shì)，生根時(shí)選擇添加0.05 mg/L NAA；CN32-2根粗隨NAA質(zhì)量濃度的升高而增加，最優(yōu)的生根濃度仍為0.05 mg/L NAA；CN34在0.08 mg/L NAA時(shí)整體表現(xiàn)出最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)。

3 討論

本研究4個(gè)非整倍體株系不同外植體的有效不定芽誘導(dǎo)能力差異較大，整體來(lái)講，誘導(dǎo)率整體不高，還需要繼續(xù)改良培養(yǎng)基配方［15-17］，以提升繁殖能力。目前，紫錐菊的無(wú)性擴(kuò)繁體系已經(jīng)建立成熟［10,18］，可以滿足非整倍體繁殖的要求。無(wú)菌克隆苗的表型性狀直接決定移栽到室外環(huán)境時(shí)的成活率，本研究4個(gè)非整倍體株系的無(wú)菌苗根系發(fā)達(dá)，地上部分舒展，均可正常移栽到室外種植。Li等［3］在前期21個(gè)非整倍體株系研究發(fā)現(xiàn)，每一個(gè)非整倍體株系都有其特定的核型特征，即使有與親本相同的染色體類型（m、sm、st），但是每種染色體類型占據(jù)的比例卻截然不同，另外有少數(shù)非整倍體的個(gè)別染色體出現(xiàn)了極度縮短的變異；另外，非整倍體還可能會(huì)發(fā)生染色體缺失/復(fù)制/易位、基因組變化和基因表達(dá)紊亂等變異［19-20］，所有的這些染色體變異都會(huì)引起非整倍體的性狀多樣性［2］。紫錐菊非整倍體所有有關(guān)染色體的變異還需要通過(guò)核型分析和熒光原位雜交技術(shù)等更準(zhǔn)確的分析方法進(jìn)行驗(yàn)證，以明確非整倍體具體的染色體構(gòu)成［21-22］。

4 結(jié)論

BA和NAA是組織培養(yǎng)過(guò)程中不定芽誘導(dǎo)的主要決定因素。4個(gè)非整倍體株系及3種外植體對(duì)BA、NAA的敏感度不同，CN31的3種外植體的有效不定芽誘導(dǎo)能力優(yōu)于其他3個(gè)非整倍體株系的。DA-6對(duì)4個(gè)非整倍體株系3種外植體有效不定芽誘導(dǎo)能力的提升作用不明顯。大量元素含有豐富的礦質(zhì)元素，4個(gè)非整倍體株系的3種外植體在1/2MS或MS培養(yǎng)基中會(huì)誘導(dǎo)出較多的有效不定芽。針對(duì)玻璃化嚴(yán)重又很重要的株系，在培養(yǎng)過(guò)程中添加適當(dāng)比例的土豆泥能有效抑制玻璃化，提高有效不定芽比例；玻璃化不嚴(yán)重的株系則不必添加土豆泥。短暫的暗培養(yǎng)可以有效提升葉片、葉柄和根外植體的有效不定芽誘導(dǎo)能力，對(duì)CN31的提升效果更為明顯。4個(gè)非整倍體株系在添加0.05或0.08 mg/L NAA時(shí)的根系更發(fā)達(dá)，整體表現(xiàn)出最佳生長(zhǎng)狀態(tài)。