菜豆菌核病病原菌的分離鑒定及防治藥劑篩選

李孟華 劉大軍 劉 暢 楊曉旭 閆志山 馮國軍

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150081）

菜豆（PhaseolusvulgarisL.）是豆科菜豆屬重要的蔬菜作物，是人們?nèi)粘ｏ嬍持械鞍踪|(zhì)、纖維、熱量和微量元素的重要來源之一。隨著菜豆種植面積的增加，由真菌、病毒、細(xì)菌和線蟲引起的200余種傳染性病害成為了菜豆生產(chǎn)的主要限制因素（Assefa et al.，2019；Nay et al.，2019）。近年來由于菜豆種植規(guī)模擴(kuò)大、連續(xù)重茬種植等原因，菌核病成為黑龍江省菜豆生產(chǎn)中的主要病害之一，露地種植和大棚種植均有發(fā)生。菌核病，又稱白霉病（white mold disease），病原菌為核盤菌〔Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary〕，屬于真菌界子囊菌門盤囊菌綱柔膜菌目核盤菌科核盤菌屬。該菌寄主范圍廣，是一種世界性植物病原菌，可侵染豆科、茄科、十字花科等75 個科逾400 種植物，被認(rèn)為是最具破壞性的植物病原菌之一（Boland & Hall，1994）。核盤菌以菌核的形式在土壤、植株殘體或種子中越冬和越夏，當(dāng)氣候條件適宜時菌核萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤，釋放子囊孢子，隨雨水或氣流傳播，或萌發(fā)為菌絲侵染植物（Young & Werner，2012）。植株受害部位出現(xiàn)水漬狀菌絲，后期受害部位萎蔫、干枯并出現(xiàn)黑色菌核（Botelho et al.，2013；Howard &Shree，2013）。阿根廷大部分菜豆種植區(qū)都能檢測到核盤菌，該菌引起的菌核病造成菜豆減產(chǎn)30%，在雨季發(fā)生此病害甚至?xí)斐山^收（Singh &Schwartz，2010）。由核盤菌引起的油菜、甘藍(lán)、茄子菌核病在國內(nèi)造成的危害較為嚴(yán)重（吳興泉 等，2006；李韋柳 等，2021；張華蕊 等，2022）。劉春艷等（2007）依據(jù)病原菌培養(yǎng)形狀、形態(tài)特征等方法對天津地區(qū)保護(hù)地菜豆菌核病病原菌進(jìn)行鑒定，但傳統(tǒng)鑒定方法難以區(qū)分菌株之間的差別。近年來隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，病原菌的鑒定達(dá)到了分子水平，真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）在遺傳進(jìn)化中因具有高度保守性，成為目前病原真菌種屬分類鑒定的重要依據(jù)之一（陳鳳毛，2007；Damm et al.，2012）。

為精準(zhǔn)鑒定病原菌，有效防治菜豆菌核病，本試驗(yàn)對采集自黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)、綏化市蘭西縣菜豆種植區(qū)的菜豆菌核病病樣進(jìn)行病原菌分離、純化，并采用微生物學(xué)、分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，測定其生物學(xué)特性，利用菌絲生長速率法測定11 種殺菌劑對核盤菌的抑制效果，以期為黑龍江省菜豆菌核病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病株：于2021 年7 月從黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)、綏化市蘭西縣菜豆種植區(qū)采集已具有菌核病典型癥狀的病株，放入無菌牛皮紙袋并編號帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。

供試菜豆品種：祥冠、黃冠、1927-1-2、1971-7-9，均由黑龍江大學(xué)園藝學(xué)團(tuán)隊提供。在人工氣候箱溫度28 ℃/18 ℃（晝/夜）、光照時間12 h/12 h（晝/夜，下同）、相對濕度60%條件下培養(yǎng)健康植株，供致病性檢測。

供試培養(yǎng)基：察氏培養(yǎng)基，硝酸鈉3 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL；馬丁培養(yǎng)基，蛋白胨5.0 g、酵母浸出粉2.0 g、葡萄糖20 g、磷酸氫二鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL；菜豆葉培養(yǎng)基，菜豆葉100 g 切碎，加水煮沸30 min，紗布過濾，加葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL；玉米粉培養(yǎng)基，玉米粉30 g、瓊脂17 g、蒸餾水1 000 mL；麥芽汁培養(yǎng)基，麥芽汁150 mL、瓊脂3 g、蒸餾水1 000 mL。

供試殺菌劑：50%腐霉利可濕性粉劑（日本住友化學(xué)株式會社）、40%菌核凈可濕性粉劑（江西禾益化工股份有限公司）、50%啶酰菌胺水分散粒劑（巴斯夫歐洲公司）、30%噁霉靈水劑（江西禾益化工股份有限公司）、75%百菌清可濕性粉劑（江蘇利民化學(xué)有限責(zé)任公司）、50%多菌靈可濕性粉劑（江蘇三山農(nóng)藥有限公司）、25%吡唑醚菌酯懸浮劑（河北成悅化工有限公司）、30%肟菌酯 ·戊唑醇懸浮劑（浙江中山化工集團(tuán)股份有限公司）、16%多抗霉素可溶粒劑（山東省乳山韓威生物科技有限公司）、300 g · L-1醚菌 · 啶酰菌懸浮劑（巴斯夫歐洲公司）、29%戊唑 · 嘧菌酯懸浮劑（安道麥馬克西姆有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化與致病性測定 采用組織分離法分離病原菌。用無菌手術(shù)刀于病健交界處切取5 mm × 5 mm 的組織，先浸泡在75%乙醇中消毒30 s，無菌水沖洗3 次，再浸泡在1%次氯酸鈉溶液中消毒30 s，無菌水沖洗3 次，置于無菌濾紙上吸收多余水分后接種于PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃倒置培養(yǎng)。待菌絲生長后，挑取菌落邊緣菌絲接種于新的PDA 培養(yǎng)基上，如此反復(fù)數(shù)次，直到分離出單菌落形態(tài)分離物（方中達(dá)，1998）。挑取純化后的菌絲至PDA 斜面試管，于4 ℃保存?zhèn)溆?。采用活體組織接種和柯赫氏法則驗(yàn)證從菜豆菌核病病株上分離得到的病原真菌致病性。選取生長21 d、第1 片三出復(fù)葉完全展開且長勢一致的健康菜豆植株，分別在植株莖部和葉片接種直徑5 mm 的菌餅，每個菜豆品種處理5 株，設(shè)3 次重復(fù)，以接種相同大小的無菌PDA 餅為對照，接種后置于人工氣候箱中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將分離純化菌株接種于PDA 培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌株的菌落顏色、形狀、菌絲形態(tài)學(xué)指標(biāo)和菌核產(chǎn)生情況。

1.2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析 將玻璃紙剪成直徑為8.8 cm 的圓形，經(jīng)高溫高壓濕熱滅菌（121 ℃，20 min）2 次后，平鋪到準(zhǔn)備好的PDA 培養(yǎng)基上，吹干后接種分離物，封好后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。48～60 h 后，待菌絲剛長到培養(yǎng)基邊緣時，用無菌鑷子刮取菌絲，液氮速凍后采用改良CTAB 法提取分離物DNA（李煥宇 等，2017），利用ITS 通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴(kuò)增病原物的ITS 序列（盧文潔 等，2019）。PCR 擴(kuò)增體系總體積為50 μL：2×TaqPCR Master Mix 25 μL、5 μmol · L-1引物ITS1/ITS4 各2 μL、DNA 模板2 μL、ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性35 s，54 ℃退火35 s，72 ℃延伸50 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測（Alshahni et al.，2009），于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄電泳結(jié)果。PCR 產(chǎn)物由金唯智（蘇州）生物科技有限公司測序后，對測序結(jié)果用BLAST 程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對和同源性分析，利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建基于rDNA-ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，Boot-strap replications 值設(shè)為1 000。

1.2.4 培養(yǎng)基對菌絲生長和菌核形成的影響 將供試菌株接種于PDA 培養(yǎng)基純培養(yǎng)3 d 后，用滅菌打孔器沿菌落邊緣內(nèi)測打取直徑為5 mm 的菌餅，接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬丁培養(yǎng)基（MB）、菜豆葉培養(yǎng)基（LDA）、麥芽汁培養(yǎng)基（MEA）、玉米粉培養(yǎng)基（CMA）、察氏培養(yǎng)基（Czapek）上，在人工氣候箱25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，每處理5 次重復(fù)，2 d 后使用十字交叉法測量菌落直徑，20 d 后調(diào)查菌核數(shù)量，烘箱50 ℃烘干至菌核質(zhì)量不再變化測定菌核干質(zhì)量。

1.2.5 溫度對菌絲生長和菌核形成的影響 將直徑為5 mm 的菌餅接種于PDA 培養(yǎng)基中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)，每處理5 次重復(fù)，菌落直徑、菌核數(shù)量、菌核干質(zhì)量的測定方法同1.2.4。

1.2.6 pH 對菌絲生長和菌核形成的影響 用1 mol ·L-1HCl 和1 mol · L-1的NaOH 將PDA 溶液的pH調(diào)節(jié)至4、5、6、7、8、9、10，共7 個梯度。將直徑為5 mm 的菌餅分別接種于不同pH 的PDA 培養(yǎng)基中央，在人工氣候箱25 ℃黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每處理5 次重復(fù)，菌落直徑、菌核數(shù)量、菌核干質(zhì)量的測定方法同1.2.4。

1.2.7 光照對菌絲生長和菌核形成的影響 將直徑為5 mm 的菌餅接種于PDA 培養(yǎng)基中央，分別置于光照時間為24 h 連續(xù)光照、12 h/12 h 光暗交替、24 h 連續(xù)黑暗的人工氣候箱（25 ℃）中進(jìn)行培養(yǎng)，每處理5 次重復(fù)，菌落直徑、菌核數(shù)量、菌核干質(zhì)量的測定方法同1.2.4。

1.2.8 碳、氮源對菌絲生長和菌核形成的影響 碳源：以Czapek 培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，分別用相同質(zhì)量的可溶性淀粉、葡萄糖、甘露醇、木糖、麥芽糖、乳糖替換培養(yǎng)基中的蔗糖作為不同碳源。將直徑為5 mm 的菌餅分別接種于不同碳源的Czapek培養(yǎng)基中央，在人工氣候箱25 ℃黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每處理5 次重復(fù)，菌落直徑、菌核數(shù)量、菌核干質(zhì)量的測定方法同1.2.4。

氮源：以Czapek 培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，分別用相同質(zhì)量的氯化銨、尿素、蛋白胨、牛肉膏、甲硫氨酸、硫酸銨、酵母粉、硝酸鉀替換培養(yǎng)基中的硝酸鈉作為不同氮源。將直徑為5 mm 的菌餅分別接種于不同氮源的Czapek 培養(yǎng)基中央，在人工氣候箱25 ℃黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每處理5 次重復(fù)，菌落直徑、菌核數(shù)量、菌核干質(zhì)量的測定方法同1.2.4。

1.2.9 殺菌劑篩選及其抑菌作用 選取11 種國內(nèi)常用殺菌劑，采用菌絲生長速率法測定各藥劑對菜豆核盤菌的抑制作用。用無菌水將供試藥劑配成1 mg · mL-1母液（藥劑換算成有效成分為100%），待PDA 培養(yǎng)基冷卻至50 ℃時加入藥劑母液，制成終濃度分別為0.05、0.25、1、2.50、5.00 μg · mL-1的含藥培養(yǎng)基，以等量無菌水為空白對照。將直徑為5 mm 的菌餅接種于含藥的PDA 培養(yǎng)基中央，在人工氣候箱25 ℃黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每處理3 次重復(fù)，3 d 后使用十字交叉法測量菌落直徑，計算各藥劑濃度對菌絲生長的抑菌率、毒力回歸方程及EC50（肖宇峰 等，2022）。

抑菌率 = （對照菌落直徑-處理菌落直徑）/ 對照菌落直徑× 100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 25 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Duncan 氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜豆菌核病發(fā)病癥狀

菜豆菌核病主要危害菜豆植株中下部，全株均可感染發(fā)病。受害植株多從主莖基部分叉處開始發(fā)病，病斑呈褐色水漬狀并沿主莖及分枝擴(kuò)展，發(fā)病后植株莖基部出現(xiàn)深褐色腐爛且易造成植株倒折（圖1-a）。濕度大時發(fā)病部位可見白色絮狀菌絲，后期菌絲聚集部位出現(xiàn)黑色鼠糞狀菌核（圖1-b）。受害葉片多位于植株下部，葉片上亦出現(xiàn)褐色水漬狀病斑，可沿葉柄蔓延至莖部（圖1-c）。受害豆莢莢壁出現(xiàn)褐色水漬狀病斑，腹縫線及背縫線處可見白色絮狀菌絲，后期菌絲聚集部位出現(xiàn)黑色鼠糞狀菌核（圖1-d）。

2.2 病原菌的分離純化與致病性測定

從菜豆病株分離純化得到10 個菌株，菌落均為白色，菌株間形態(tài)特征一致，挑選代表菌株LMH-001 進(jìn)行致病性檢測。葉片接種菌株7 d 后出現(xiàn)褐色水漬狀病斑，病斑表面可見白色菌絲（圖2-a）；莖部接種7 d 后出現(xiàn)褐色水漬狀病斑，發(fā)病部位表層腐爛（圖2-b）。接種后發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病癥狀一致，對接種后發(fā)病部位進(jìn)行病原菌再分離，均能獲得與原分離菌株一致的病原菌。根據(jù)柯赫氏法則，確定菌株LMH-001 為菜豆菌核病的致病菌。

圖2 菜豆植株接種菌株LMH-001 后的發(fā)病癥狀

2.3 菜豆菌核病病原菌的鑒定

2.3.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 病原菌在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 后菌落呈圓形，直徑84～89 mm，菌絲為白色（圖3-a）；6 d 后培養(yǎng)基邊緣菌絲密集生長并聚集突起成團(tuán)，菌絲聚集物前期為白色，隨著體積膨大變?yōu)楹稚?，且表面有透明液滴出現(xiàn)（圖3-b）；9 d 后菌絲聚集物褐色加深逐漸變?yōu)楹谏砻娓街耐该饕旱蜗?，形成粗糙干燥的菌核，菌核沿培養(yǎng)基邊緣環(huán)形排列（圖3-c）。顯微鏡下（200 倍）觀察，菌絲無色透明、有隔（圖3-d）；菌核切片外層為堅硬黑褐色外殼，內(nèi)部為緊密白色菌絲聚集物（圖3-e）。將菌核置于4 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)35 d，再轉(zhuǎn)入人工氣候箱20 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)，41 d 后菌核開始萌發(fā)（圖3-f）。

圖3 菌株LMH-001 的菌絲生長與菌核形成

2.3.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用引物ITS1 和ITS4 從菌株LMH-001 上擴(kuò)增得到長度為512 bp 的片段（圖4），將供試菌株ITS 序列與GenBank 中已有的序列進(jìn)行BLAST 比對，結(jié)果顯示，菌株LMH-001 的ITS 序列與S.sclerotiorum（GenBank 登錄號MG640582.1）和S.sclerotiorum（GenBank 登錄號KX276153.1）的同源性大于99%。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株LMH-001與S.sclerotiorum聚在同一分支（圖5）。結(jié)合各菌株形態(tài)學(xué)特征，將供試菌株鑒定為核盤菌（S.sclerotiorum）。

圖4 供試菌株LMH-001 的ITS 序列PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖5 基于ITS 序列構(gòu)建的菌株LMH-001 及其相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 菜豆菌核病病原菌的生物學(xué)特性

2.4.1 培養(yǎng)基對菌絲生長和菌核形成的影響 由表1 可以看出，菌株LMH-001 在6 種培養(yǎng)基上均能生長并形成菌核，其中在MEA 培養(yǎng)基上菌絲生長速度最快，培養(yǎng)2 d 平均菌落直徑5.51 cm，顯著大于其他培養(yǎng)基；PDA 培養(yǎng)基次之；供試菌株在MEA、LDA、PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d 后均形成菌核；MB 培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d 后形成的菌核數(shù)量最多，顯著多于其他培養(yǎng)基，但菌核干質(zhì)量較??；PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d 后產(chǎn)生的菌核干質(zhì)量最大，平均每皿0.175 1 g。綜合菌絲生長速度和菌核形成情況，供試病原菌的最適生長培養(yǎng)基為PDA。

表1 不同培養(yǎng)基對菜豆菌核病菌絲生長和菌核形成的影響

2.4.2 溫度對菌絲生長和菌核形成的影響 由表2 可以看出，病原菌LMH-001 在5～35 ℃范圍內(nèi)菌絲均可生長，最適生長溫度為20、25 ℃，培養(yǎng)2 d 菌落直徑分別為5.42、5.40 cm，顯著大于其他溫度處理；溫度為5、35 ℃時菌落直徑顯著低于10～30 ℃處理，菌絲生長受到明顯抑制；0、40 ℃時菌絲停止生長。供試病原菌在10～30 ℃培養(yǎng)20 d 均可以形成菌核，菌核形成的最適溫度為20、25℃，培養(yǎng)6 d 即可形成菌核，且平均每皿菌核數(shù)量（32.3、43.6 個）和菌核干質(zhì)量（0.168 7、0.171 9 g）均顯著高于其他溫度處理。

表2 不同溫度對菜豆菌核病菌絲生長和菌核形成的影響

2.4.3 pH 對菌絲生長和菌核形成的影響 由表3可以看出，病原菌LMH-001 在pH 4～10 范圍內(nèi)菌絲均可生長并形成菌核，當(dāng)pH 為6 時，培養(yǎng)2 d菌落直徑可達(dá)5.13 cm，顯著大于其他處理；pH 為10 時菌落直徑顯著低于其他處理，菌絲生長受到明顯抑制。供試病原菌在pH 為6 時培養(yǎng)6 d 形成菌核，培養(yǎng)20 d 時平均每皿菌核數(shù)量33.8 個，菌核干質(zhì)量0.183 9 g。綜合結(jié)果來看，菌絲生長與菌核形成的最適pH 為6。

表3 不同pH 對菜豆菌核病菌絲生長和菌核形成的影響

2.4.4 光照對菌絲生長和菌核形成的影響 由表4 可以看出，病原菌LMH-001 在24 h 連續(xù)光照、12 h/12 h 光暗交替、24 h 連續(xù)黑暗條件下菌絲均可生長且能形成菌核，不同光照處理對菌絲生長、菌核形成時間、菌核干質(zhì)量無顯著影響；24 h 連續(xù)光照下培養(yǎng)20 d 平均每皿菌核數(shù)量為36.2 個，顯著高于其他處理。

表4 不同光照對菜豆菌核病菌絲生長和菌核形成的影響

2.4.5 碳源對菌絲生長和菌核形成的影響 由表5可以看出，病原菌LMH-001 在7 種碳源培養(yǎng)基上菌絲均能生長，對葡萄糖的利用效果最好，培養(yǎng)2 d 后平均菌落直徑為4.97 cm，培養(yǎng)7 d 時形成菌核，20 d 時平均每皿菌核數(shù)量為33.2 個，每皿菌核干質(zhì)量為0.142 8 g，均顯著高于其他處理；對木糖的利用效果最差，培養(yǎng)2 d 后平均菌落直徑為0.64 cm，顯著低于其他處理，培養(yǎng)20 d 時未形成菌核。

表5 不同碳源對菜豆菌核病菌絲生長和菌核形成的影響

2.4.6 氮源對菌絲生長和菌核形成的影響 由表6可以看出，病原菌LMH-001 在9 種氮源培養(yǎng)基上菌絲均能生長；除尿素和硫酸銨氮源培養(yǎng)基外，其他7 種氮源處理均能在培養(yǎng)20 d 內(nèi)形成菌核，其中對酵母粉的利用效果最好，培養(yǎng)2 d 后菌落直徑為6.82 cm，6 d 時形成菌核，培養(yǎng)20 d 平均每皿菌核數(shù)量為53.2 個，每皿菌核干質(zhì)量為0.248 9 g，顯著高于其他氮源處理，其次為牛肉膏、蛋白胨；對尿素的利用效果最差，培養(yǎng)2 d 后平均菌落直徑為0.73 cm，顯著低于其他氮源處理，培養(yǎng)20 d 時未形成菌核。

表6 不同氮源對菜豆菌核病菌絲生長和菌核形成的影響

2.5 殺菌劑篩選及其抑菌作用

由表7 可以看出，11 種殺菌劑對病原菌LMH-001 有不同程度的抑制效果，EC50介于0.116 9～38.379 8 μg · L-1之間。其中肟菌酯 · 戊唑醇、戊唑 · 嘧菌酯、吡唑醚菌酯、菌核凈4 種殺菌劑的EC50值較小，分別為0.116 9、0.203 0、0.203 2、0.205 0 μg · L-1，對菜豆核盤菌的抑制效果較好。

3 結(jié)論與討論

核盤菌屬（Sclerotinia）下的真菌是重要的植物病原菌（楊淼泠 等，2021），本試驗(yàn)通過微生物學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，確定了采集自哈爾濱市呼蘭區(qū)、綏化市蘭西縣的菜豆菌核病病株的致病菌為核盤菌（S.sclerotiorum）?；诤吮P菌的近緣屬種遺傳距離分析，供試病原菌LMH-001 與其他屬種存在顯著的遺傳距離，而且其ITS 序列與核盤菌的同源性大于99%，與本試驗(yàn)中的傳統(tǒng)鑒定結(jié)果吻合，可以確定菌株LMH-001 為核盤菌。

本試驗(yàn)中，菜豆菌核病病原菌在PDA 平板上生長良好，與王瑋等（2012）研究結(jié)果一致；利于菌絲生長和菌核形成的最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母粉，與劉春艷等（2007）研究結(jié)果不同；菌絲生長適宜溫度為5～35 ℃，最適溫度為20～25℃，產(chǎn)生菌核數(shù)量最多、干質(zhì)量最大，與孫敬賢和張魯剛（2015）、劉婷婷等（2016）的研究結(jié)果一致，這與菌核病在黑龍江初秋發(fā)生的溫度濕度條件特點(diǎn)吻合，但與顧玉陽等（2020）對扁豆菌核病最適菌核產(chǎn)生溫度的研究結(jié)果不同。在pH 4～10 的條件下，核盤菌菌絲均能生長和產(chǎn)生菌核，表明該菌能夠適應(yīng)不同的pH 環(huán)境，這可能與其在生長過程中分泌草酸和多種酶類等物質(zhì)有關(guān)（Xu et al.，2015；Tian et al.，2021）；菌絲生長和菌核形成的最適pH為6，與劉志恒等（2013）研究結(jié)果一致。隨著pH值的增加，核盤菌菌核形成的數(shù)量減少，與唐仕娟等（2021）對向日葵菌核病病原菌的研究結(jié)果不同，該菌在pH 值為10 時仍能產(chǎn)生菌核。核盤菌在逆境條件下，溫度較低時形成的菌核數(shù)量較少，平均單個菌核干質(zhì)量較大，溫度較高時平均單個菌核干質(zhì)量較??；pH 值較高時產(chǎn)生的菌核數(shù)量較少，平均單個菌核干質(zhì)量較大，pH 值較低時平均單個菌核干質(zhì)量較小。但關(guān)于其形成機(jī)理尚不明確。核盤菌產(chǎn)生的菌核對逆境具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，菌核萌發(fā)后產(chǎn)生的菌絲和子囊孢子有利于該病害的傳播，因此菌核在核盤菌的生命周期和病害循環(huán)中都具有重要作用（Liang et al.，2018）。本試驗(yàn)對供試病原的生物學(xué)特性測定表明，核盤菌利用碳、氮源范圍較廣，對溫度、pH 適應(yīng)能力強(qiáng)，光照對菌絲生長與菌核形成無顯著影響，這與石鳳梅等（2013）研究結(jié)果一致。

隨著黑龍江各地的菜豆種植面積逐年增加，菜豆菌核病危害趨勢越發(fā)嚴(yán)重，目前對菜豆菌核病的防治仍以化學(xué)防治為主。本試驗(yàn)通過對農(nóng)藥有效成分的殺菌效果進(jìn)行篩選，30%噁霉靈水劑中的有效成分hymexazol 和300 g · L-1醚菌 · 啶酰菌懸浮劑中有效成分Boscalid 均對菌核病有較好的防治作用，可以為菌核病的防治提供更多用藥選擇。11 種殺菌劑的室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果表明，肟菌酯 · 戊唑醇對菌絲生長的抑制效果最好，EC50值為0.116 9 μg ·L-1，其次為戊唑 · 嘧菌酯、吡唑醚菌酯、菌核凈，EC50值均≤0.205 0 μg · L-1。因此，可將肟菌酯 ·戊唑醇作為防治菜豆菌核病的首選藥劑，4 種殺菌劑交替使用，避免產(chǎn)生抗藥性（李永剛和陳麗娜，2011）。控制菌核病的發(fā)生需要通過化學(xué)防治、生物防治、農(nóng)業(yè)防治（如輪作）和選育抗病品種等方式建立綜合的防治方案（Smolinska & Kowalska，2018）。對于黑龍江省菜豆菌核病，建議加強(qiáng)田間管理，在初秋病害發(fā)生前期提前預(yù)防，減少侵染源。由于本試驗(yàn)僅于實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，還需要開展田間試驗(yàn)測定大田環(huán)境對菜豆核盤菌的影響，以期在菜豆生產(chǎn)中少量高效用藥，降低用藥成本，減少農(nóng)藥殘留。