生物反硝化抑制劑原花青素對土壤氮轉(zhuǎn)化及植物生長的影響

劉 濤，張 萱，沈阿林，蘇 瑤*

（1 浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，浙江杭州 311300；2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源與土壤肥料研究所，浙江杭州 310021；3 浙江環(huán)能環(huán)境技術(shù)有限公司，浙江杭州 310012）

氮肥施用為作物增產(chǎn)做出了巨大貢獻，但其過量施用及其不合理的管理措施也造成了較大程度的氮肥浪費和一系列環(huán)境問題，如土壤酸化、面源污染和溫室效應(yīng)加劇等。據(jù)統(tǒng)計，2021 年我國農(nóng)用化肥施用量(折純)為5403.59 萬t，其中氮肥施用量為1745.3 萬t[1]，但肥料利用率偏低。目前，我國三大糧食作物(水稻、玉米和小麥)氮肥當季平均利用率僅為32%～35%[2]。優(yōu)化施肥管理、提高作物氮素利用率和降低氮素環(huán)境污染成為當前我國農(nóng)業(yè)綠色健康可持續(xù)發(fā)展的重要需求。

土壤反硝化過程是土壤氮循環(huán)中的重要環(huán)節(jié)，指在硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶和氧化亞氮還原酶作用下將硝態(tài)氮(NO3-)依次還原為亞硝態(tài)氮(NO2-)、一氧化氮(NO)、氧化亞氮(N2O)和氮氣(N2)的過程。由于土壤反硝化過程將土壤氮素最終轉(zhuǎn)化為N2O 和N2釋放至大氣，被認為是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中氮素損失的重要環(huán)節(jié)之一。據(jù)統(tǒng)計，由土壤生物反硝化途徑造成的農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)氮肥損失率最高可達35.0%～52.0%[3]。另外，反硝化過程的中間產(chǎn)物N2O，還是造成全球變暖的重要溫室氣體之一，其增溫潛勢可達CO2的298 倍。Antonio等[4]采用15N 穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，添加硝酸鉀氮肥后土壤N2O 的排放有84% 以上來自反硝化作用。因此，有效調(diào)控土壤反硝化過程對于減少農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)氮素損失和N2O 排放具有重要意義。

土壤反硝化的限制因子主要包括土壤氧氣含量、碳氮含量、土壤 pH、溫度和土壤反硝化微生物種群的組成、豐度和活性等[5]。由于土壤反硝化過程多發(fā)生于兼氧或氧氣有效性受限的條件，過去大部分有關(guān)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中土壤反硝化的研究多聚焦于水田。實際上，土壤反硝化過程同樣廣泛發(fā)生于旱地土壤，尤其是秸稈還田后的土壤。一方面，還田秸稈碳經(jīng)轉(zhuǎn)化形成土壤活性有機碳組分，可為土壤反硝化微生物提供碳源；另一方面，秸稈腐解過程消耗氧氣也為反硝化過程創(chuàng)造了有利條件。有研究表明，長期秸稈還田下的稻-油輪作體系0—60 cm土層NO3--N 含量較不還田土壤顯著減少，降幅最高可達62%，這部分NO3--N 的損失一方面來自土壤微生物對氮素的固定，另一方面則來自土壤反硝化過程引起的氮素損失，研究結(jié)果顯示，還田處理組土壤反硝化微生物豐度較不還田處理增加了2.5～6.7倍[6-7]。相似的，向砂土中添加秸稈后180 天內(nèi)，0—25 cm 土層NO3--N 含量下降21%～91%，而反硝化微生物活性和豐度分別增加1.9～7.8 倍和0.6～5.1 倍[8]。一般而言，旱地作物更傾向以NO3--N 作為氮素養(yǎng)分進行吸收轉(zhuǎn)運[9]，若按傳統(tǒng)的通過抑制硝化過程來減少氮素損失的思路，將會影響土壤NO3--N 的形成而加劇旱地土壤NO3--N 含量的減少，進而可能影響對旱地作物氮營養(yǎng)的供應(yīng)。

近年來，通過直接抑制反硝化過程減少氮素損失作為控制旱地氮養(yǎng)分減損和溫室氣體減排的新思路已在國內(nèi)外引起了一定關(guān)注。生物反硝化抑制劑，指能夠抑制反硝化反應(yīng)的一類植物次生代謝產(chǎn)物，有關(guān)生物反硝化抑制劑原花青素的研究近年來也有一定報道[10-14]。國內(nèi)外學(xué)者采用土壤微宇宙培養(yǎng)試驗、盆栽模擬試驗和田間原位試驗等，在不同研究尺度初步探究了原花青素施用后的土壤環(huán)境和作物生產(chǎn)效應(yīng)，主要包括對土壤氮組分含量及N2O 排放的影響和對植物氮素積累、生物量及形態(tài)的影響等方面[11-19]。為進一步掌握生物反硝化抑制劑在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用效果與前景，本文從生物反硝化抑制劑的發(fā)現(xiàn)、反硝化抑制機理與效果，以及對植物生長的影響等方面的研究進展進行了系統(tǒng)的總結(jié)與梳理，并對其前景進行了展望。

1 生物反硝化抑制劑的發(fā)現(xiàn)

生物反硝化抑制劑最初主要發(fā)現(xiàn)于一些入侵植物，如亞洲虎杖(Fallopiaxbohemica)和蕨菜(Pteridium aquilinum)等的根部提取物，這類物質(zhì)被證實可以顯著抑制反硝化細菌的代謝活性，進而保障作物從土壤中獲取更多的NO3--N 用于自身生長[14,20]。此后，Bardon 等[21]對這些根部提取物進行了檢測分析，發(fā)現(xiàn)能夠抑制土壤反硝化作用的代謝物質(zhì)主要為原花青素。原花青素(procyanidins，簡稱PC)是一類多酚化合物的總稱，包括兒茶素、表兒茶素、兒茶素與表兒茶素形成的二聚體、三聚體、四聚體至十聚體等[22-23]?，F(xiàn)有研究證明，原花青素可對銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、克雷伯菌(Klebsiella trevisan)、蕓苔假單胞菌(Pseudomonasbrassicacearum)和蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)等具有抗菌特性[21,24]，且對其反硝化作用的抑制遠大于呼吸作用。Lacombe 等[25]研究表明，向4 種反硝化細菌培養(yǎng)物中添加濃度為0.01 mg/mL 的原花青素，不會對菌株有氧呼吸產(chǎn)生影響，但對其反硝化活性有所抑制；原花青素濃度提高到0.2 mg/mL，菌株生長同時受到顯著抑制；但更高濃度的原花青素亦不會對部分不敏感的菌株產(chǎn)生生長抑制。這些研究均表明，原花青素對反硝化過程的抑制不是由于原花青素的一般抗菌特性，而是對反硝化細菌的特異性抑制作用。

2 原花青素的作用機制

作為多酚化合物中的一類，原花青素對細胞膜同樣具有很強的親和力，可以改變細胞膜的完整性和穩(wěn)定性，從而有助于它們的抗菌活性[26-27]。研究表明，原花青素可被細胞膜表面吸附并進入脂質(zhì)雙層，進而改變細胞膜結(jié)構(gòu)，影響膜通透性[19,28]。細胞膜通透性的改變可以解釋高濃度原花青素的一般抗菌特性，但不能解釋與有氧呼吸相比對反硝化的更高敏感性。有研究表明，低濃度的原花青素不會使Pseudomonasbrasicacearum的細胞膜發(fā)生透化，但會改變其穩(wěn)定性[29]。因此，在低濃度下，反硝化作用比有氧呼吸的敏感性更高，推測可能是由于細胞膜穩(wěn)定性的改變干擾了膜結(jié)合硝酸還原酶或硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NarK 功能的發(fā)揮，由此直接或間接抑制硝酸鹽還原酶或亞硝酸鹽還原酶活性，形成對反硝化過程的抑制(圖1)。另外，有研究指出，原花青素還可與蛋白酶發(fā)生非特異性結(jié)合[30-31]，通過將效應(yīng)分子與蛋白質(zhì)活性位點以外的位點結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化[32]，進而影響蛋白酶功能的發(fā)揮。因此，在反硝化細菌中，原花青素可能通過改變膜結(jié)合硝酸還原酶或硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NarK 的構(gòu)象而影響其活性，進而產(chǎn)生對反硝化過程的特異性抑制。由于周質(zhì)硝酸還原酶和亞硝酸還原酶主要分布在細胞周質(zhì)中，其對原花青素的抑制響應(yīng)可能主要來自于硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NarK的功能改變。因此，相較于膜結(jié)合硝酸還原酶，周質(zhì)硝酸還原酶和亞硝酸還原酶對原花青素的抑制響應(yīng)可能較小。不過，目前有關(guān)原花青素對反硝化過程的抑制機理還存在較多不確定的方面，有待進一步深入研究。

圖1 原花青素的反硝化抑制機制假說圖Fig.1 Hypothesis diagram of denitrification inhibition mechanism of procyanidins

此外，有研究證實，黃酮家族中的某些分子可以誘導(dǎo)或抑制細菌中的特定基因表達[33]。原花青素作為一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮混合物，也被推測可能具有抑制反硝化過程中關(guān)鍵功能基因表達的作用。相關(guān)研究表明[29]，Pseudomonas brassicacearum在含硝酸鹽培養(yǎng)基中生長時，編碼膜結(jié)合態(tài)硝酸鹽還原酶的narG 基因表達量在暴露于原花青素時顯著增加，這主要是因為細胞具有恢復(fù)酶正常活性的負反饋機制的存在；但編碼亞硝酸鹽還原酶的nirS 基因表達卻顯著減少，主要與硝酸鹽還原為亞硝酸鹽過程受抑制而導(dǎo)致亞硝酸鹽含量減少有關(guān)。但是，當在含亞硝酸鹽培養(yǎng)基中生長時，nirS表達則不隨原花青素的添加而改變。這些結(jié)果表明，與反硝化過程相關(guān)的功能基因表達的變化主要與底物和產(chǎn)物含量變化相關(guān)，而非受原花青素的直接作用，但這些功能基因表達量的減少，會導(dǎo)致反硝化細菌活性的降低，進而抑制反硝化過程。

3 原花青素對土壤反硝化的影響

3.1 土壤反硝化抑制效果

基于不同試驗尺度的研究結(jié)果表明，向不同質(zhì)地的土壤施加原花青素均能表現(xiàn)出顯著的反硝化抑制效果，抑制程度則與土壤特性密切相關(guān)。Galland等[19]研究結(jié)果顯示，相較于有機碳含量更高的壤質(zhì)砂土(9.9 g/kg)，向有機碳含量為6.9 g/kg 的砂質(zhì)黏土中添加原花青素可獲得更高的反硝化抑制，抑制率為24%～32%，這主要是由于原花青素可與土壤有機質(zhì)強烈結(jié)合吸附，進而削弱生物活性。Ye 等[28]比較了原花青素在浙江金華(JH)和江蘇金壇(JT)不同水稻土上的反硝化抑制效果，結(jié)果也顯示在有機碳含量更高的JH 土壤中表現(xiàn)出的反硝化抑制率低于JT，反硝化抑制率分別為47.3%和57.1%。同樣，原花青素的鄰苯二酚基團可與土壤金屬離子發(fā)生螯合作用而削弱生物活性[34]。因此，在受重金屬污染以及鉀、鈣、鎂等金屬含量較高的土壤中，原花青素的反硝化抑制效果可能也會受到較大的影響。但目前，有關(guān)原花青素添加與土壤有機質(zhì)及重金屬間的互作機制仍有待進一步明確。此外，土壤反硝化抑制效果還與原花青素添加量及培養(yǎng)時間有關(guān)。相關(guān)研究結(jié)果顯示，添加原花青素210 kg/hm2條件下的反硝化抑制率為32%，是添加量87 kg/hm2下的1.3 倍[19]。Ye 等[28]以水稻土為研究對象，采用室內(nèi)培養(yǎng)試驗，結(jié)果顯示添加1 mg/g 干土原青花素即可對水稻土產(chǎn)生顯著的反硝化抑制，且添加后14 天時的抑制率達到最大，此后隨時間逐漸下降，這可能是由于原花青素亦可作為一種碳源和營養(yǎng)物質(zhì)而被土壤微生物降解利用，進而其反硝化抑制效果表現(xiàn)為隨添加時間延長而減弱[35-36]。

3.2 N2O 排放和土壤氮組分含量變化

原花青素添加至土壤后可通過抑制反硝化過程而減少其中間產(chǎn)物N2O 的排放量，但不同土壤的N2O 排放減少幅度仍然主要受土壤特性影響。對于反硝化活性較高的土壤，原花青素添加后的N2O 排放量減少幅度相對更高，主要與反硝化過程對N2O 的貢獻大小有關(guān)[37]。

原青花素添加對土壤礦質(zhì)氮組分的影響主要集中在對土壤硝態(tài)氮含量的影響上，但具體影響目前研究結(jié)果仍存在不一致之處。如Bardon 等[17]研究結(jié)果顯示，在不種植作物的土壤中添加原花青素后，土壤NO3--N 含量比未添加土壤增加6 倍。而Galland等[19]對不同質(zhì)地土壤的研究結(jié)果顯示，向壤質(zhì)砂土中添加原花青素，土壤NO3--N 含量增加113%，但對砂質(zhì)黏土卻無顯著影響。相反的，Ye 等[28]對采自河北省秦皇島(QHD)和浙江省金華(JH)的水稻土開展微宇宙培養(yǎng)試驗，結(jié)果卻顯示添加原花青素后7 天，QHD 和JH 土壤中的NO3--N 含量顯著下降。由于土壤NO3--N 同時參與土壤硝化、反硝化、硝酸鹽異化還原為銨以及微生物同化等多個氮轉(zhuǎn)化過程，因此其含量的變化與這些過程的活性均有關(guān)系。一方面，原青花素的添加可通過抑制土壤反硝化過程而減少土壤NO3--N 的損失；另一方面，也可能通過增強硝酸鹽異化還原為銨或土壤微生物同化作用，使土壤NO3--N 進一步轉(zhuǎn)化為土壤可儲存的氮而增加NO3--N 的轉(zhuǎn)化。目前，有關(guān)原花青素添加后對農(nóng)田土壤硝酸鹽異化還原為銨和土壤微生物同化過程的影響還鮮有報道，相關(guān)機制還不清楚，未來可結(jié)合15N 穩(wěn)定同位素標記技術(shù)、現(xiàn)代分子生物學(xué)以及組學(xué)技術(shù)等，進一步全面揭示原花青素添加后對土壤氮轉(zhuǎn)化過程的影響機制，以助于全面把握原花青素對土壤可利用氮水平的影響，進而指導(dǎo)作物氮養(yǎng)分管理。

3.3 土壤反硝化細菌豐度與種群結(jié)構(gòu)變化

較低劑量(＜83 kg/hm2)的原花青素添加對土壤中反硝化細菌的豐度不會產(chǎn)生顯著影響，但當原花青素施入量增加至210 kg/hm2時，土壤中nirK 型和nirS 型反硝化細菌豐度分別減少33%～45%和44%～67%，根際土壤反硝化細菌相對豐度減少4.5 倍[19]。Ye 等[28]研究結(jié)果顯示，與對照相比，添加原花青素可減少供試土壤nirS clade I、nirS clade II 和nirK clade III 的種群數(shù)量，減少比例在10%～25%左右，但對nirK clade I 數(shù)量的影響在不同土壤中表現(xiàn)有所不同。這表明，原花青素可對nirS-/nirK-反硝化菌不同clade 產(chǎn)生不同程度的影響。反硝化細菌對原花青素的不同響應(yīng)模式可能與土壤中反硝化細菌種群組成差異有關(guān)，而這種差異則主要受土壤特性的影響，如土壤pH、有機質(zhì)含量、氮含量等[19,38-39]。此外，Hugoni 等[16]研究結(jié)果表明，原花青素的添加并不會顯著改變土壤細菌和真菌的群落組成和多樣性，也不影響土壤中非目標微生物種群的功能；但原花青素添加會改變不同土壤中微生物間的相互作用，表現(xiàn)為不同種屬的微生物在添加原花青素后發(fā)生富集的情況不同，如砂質(zhì)黏土中Entotheonellaeota和Mucoromycota有所富集，而在壤質(zhì)砂土中則是Dependentiae和Rozellomycetes有所富集。

4 原花青素對植物生長的影響

4.1 植物地上和地下部生物量變化

添加原花青素可通過減少土壤氮素損失，增加對植物養(yǎng)分的供應(yīng)，保障植物生長所需，進而增加植物(如芹菜、生菜、萵苣)可食部分和根部的生物量[19,28,40]。Galland 等[18]設(shè)置施入不同含量及次數(shù)的氮肥與原花青素試驗，結(jié)果顯示，施肥處理較添加原花青素更能促進芹菜的生長，與未添加原花青素相比，原花青素添加可增加芹菜可食部分的鮮重47%～83%，同時增加株高37%～52%，相較于2 次原花青素施用，1 次施用下鮮重增加更多，但株高增加幅度較小。Galland 等[41]試驗表明，與未添加原花青素相比，施用210 kg/hm2的原花青素，生菜可食部分鮮重顯著增加16%。施用 83 和210 kg/hm2的原花青素，生菜根部鮮重分別增加39%和63%，根部干重分別增加52%和97%。此外，添加原花青素還可增加植物枝條47%[18]。由此可見，原花青素的添加量是影響植物生物量增加幅度的重要因子，但有關(guān)原花青素添加量與植物生長間存在怎樣的劑量關(guān)系仍不明確，需要結(jié)合特定土壤、施肥水平、肥料類型等開展系統(tǒng)的試驗以確定，進而指導(dǎo)實際生產(chǎn)中原花青素的科學(xué)施用。

4.2 植物組織氮含量變化

研究顯示，添加210 kg/hm2的原花青素可增加生菜可食部分氮含量，平均每棵增加N 3.6 g，但隨添加的原花青素濃度的增加，生菜可食部分氮含量從2.1%降至1.8%[41]。Galland 等[18]研究結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的芹菜中氮含量約為1.3%，添加原花青素后芹菜根部氮含量較未添加處理無顯著變化或略有減少。另有研究指出，添加原花青素后，作物的葉片、莖和根等組織中的氮含量均不會發(fā)生顯著變化[17,42]。這些研究結(jié)果表明，原花青素的添加可能只是為植物提供了更多的NO3--N，但并沒有顯著改變植物對氮養(yǎng)分的吸收轉(zhuǎn)運能力，進而在植物組織中并未出現(xiàn)N 的積累。但原花青素添加后引起的土壤可利用氮水平的改變也可能會間接影響植物次級代謝產(chǎn)物的合成。Cerovic 等[43]研究表明，當植物不受土壤低氮脅迫時，葉綠素水平相對較高，植物將合成更多的初級代謝產(chǎn)物；然而在氮缺乏的條件下，植物可通過合成相對更多的類黃酮等次級代謝產(chǎn)物來應(yīng)對環(huán)境變化而帶來的生長脅迫[44]。目前，鮮有關(guān)于原花青素添加對植物次級代謝產(chǎn)物合成與分泌影響的報道，而植物次級代謝產(chǎn)物與植物免疫能力、植物品質(zhì)等密切相關(guān)。因此，今后仍有必要進一步解析，在不同地力條件下添加原花青素對植物免疫及品質(zhì)等方面的影響及其相關(guān)機制。

4.3 植物組織形態(tài)變化

氮的有效性可強烈影響植物的形態(tài)特征，特別是根的形態(tài)特征，它同時受到外部NO3-供應(yīng)和內(nèi)部NO3-的強烈影響[45-48]。與NO3-直接接觸可刺激側(cè)根尖端的分生組織活動，從而誘導(dǎo)側(cè)根增殖并增加對根的生物量分配；但是，枝條中一定水平的 NO3-作為根分枝的系統(tǒng)抑制劑，可能會降低對根的生物量分配[41,49-50]。Bardon 等[17]研究顯示，在土壤中添加原花青素后38 天，未觀察到亞洲虎杖(Fallopiaxbohemica)高度和總干生物量的變化，卻發(fā)現(xiàn)其根莖質(zhì)量比隨著原花青素的添加量增加而增加。Zhao 等[37]也發(fā)現(xiàn)，添加原花青素的植物比在施用肥料后根比芽發(fā)育得更多。由此推測，原花青素添加有利于植物根系的發(fā)育與生長，一方面，原花青素通過限制NO3-損失，增加了根與NO3-之間的直接接觸，從而誘導(dǎo)植物在含NO3-的區(qū)域集中新的和更多的根系生長；另一方面，添加原花青素后未觀察到葉片和莖中 NO3--N 積累，因此也并未對根的生物量分配產(chǎn)生抑制。

5 展望

目前，有關(guān)生物反硝化抑制劑的研究尚處于起步階段，盡管已基本明確了原花青素在土壤氮素減損、N2O 減排和植物增產(chǎn)方面的有益效果，但仍需深入開展許多有關(guān)生物反硝化抑制劑的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究：

1)進一步探索生物反硝化抑制劑施用后對土壤氮素轉(zhuǎn)化的影響機制，一是結(jié)合穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)、現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和組學(xué)技術(shù)等，解析土壤微生物氮同化和硝酸鹽異化還原為銨過程對原花青素添加的響應(yīng)，闡釋土壤有效氮水平變化的微生物機理；二是研究在不同土壤條件下施用原花青素的效果差異，解析原花青素與土壤活性顆粒的互作機制。

2)明確原花青素施用量與植物產(chǎn)量間的劑量關(guān)系，并深入研究生物反硝化抑制劑施用對植物生長影響的分子機理，重點圍繞植物營養(yǎng)吸收轉(zhuǎn)運、次級代謝產(chǎn)物合成與分泌、植物免疫與品質(zhì)等方面闡釋原花青素添加的影響及機制，為指導(dǎo)原花青素施用作為植物生產(chǎn)過程中的肥料管理措施提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

3)開發(fā)基于原花青素的新型穩(wěn)定性肥料產(chǎn)品或土壤改良產(chǎn)品，并相繼開展田間效果評估?；谏锓聪趸种苿┑男滦头柿匣蛲寥栏牧籍a(chǎn)品將以其環(huán)境友好的特點，在未來綠色健康農(nóng)業(yè)發(fā)展中具有廣闊的應(yīng)用前景，也將對我國化肥減施增效和農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)安全的提升等產(chǎn)生重大意義。