基于網絡藥理學及實驗驗證補骨脂乙素治療2 型糖尿病的作用機制

劉曉然，李志齊，李雅娜，姜文國，夏振紅

濱州醫(yī)學院，山東 煙臺 264003

2 型糖尿病是世界上發(fā)病率持續(xù)上升的流行病之一[1-2]，其特征是由胰腺β 細胞的進行性丟失或胰島素抵抗和高胰島素血癥誘導的高血糖[3]，這與肥胖、氧化應激和炎癥密切相關[4-6]。胰島素抵抗主要發(fā)生在肌肉、脂肪和肝臟組織細胞中，胰島素抵抗導致細胞攝取葡萄糖減少[7-8]；在肝細胞中，胰島素抵抗導致糖異生和葡萄糖輸出增加[9]。隨著2 型糖尿病的加重，由于糖脂毒性β 細胞數(shù)量逐漸減少，產生胰島素的能力逐漸降低[10]。2 型糖尿病可引起多種發(fā)癥，包括糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病和糖尿病心血管功能障礙等疾病[11]，因此糖尿病患者的需求不僅要控制血糖，還要預防和治療由于長期高血糖引起的并發(fā)癥。

目前臨床上有許多治療2 型糖尿病的藥物，但這些藥物在降血糖的同時，具有一些不良反應[12]。此外，糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展并未得到完全根治，因此開發(fā)新的、更有效和更安全的藥物以治療2 型糖尿病及其并發(fā)癥的需求仍然存在，據(jù)報道天然化合物及其有效成分在2 型糖尿病的防治中不良反應少、療效穩(wěn)定、可長期使用，還通過多靶標、多途徑調節(jié)代謝紊亂，改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)。因此，一些具有降血糖活性的中藥越來越受到人們的關注。

補骨脂已被用于治療多種疾病，包括癌癥、炎癥性疾病、神經退行性疾病等。補骨脂提取物通過抗凋亡和抗纖維化功能降低糖尿病的糖毒性，改善糖尿病腎病[13-14]。補骨脂乙素是一種從補骨脂種子中提取的黃酮類化合物，傳統(tǒng)上用作膳食成分，類黃酮對糖尿病具有多重保護作用[15]，補骨脂乙素作為黃酮類的化合物，可能對2 型糖尿病產生有益影響。研究表明，補骨脂乙素具有抗菌、抗炎、抗癌、抗結核和抗氧化活性[16]；補骨脂乙素可以通過核因子-κB（NF-κB）通路抑制糖尿病大鼠腎炎，改善糖尿病大鼠的腎損傷[17]；補骨脂乙素還可以抑制脂肪細胞和斑馬魚體內的脂質積聚[18]，表明補骨脂乙素和2 型糖尿病和脂質代謝有一定的相關性，但補骨脂乙素治療2 型糖尿病尚缺乏相關報道。

網絡藥理學利用公共數(shù)據(jù)庫和文獻作為樣本，并使用網絡可視化工具分析和發(fā)現(xiàn)潛在的藥物和疾病靶點，以預測藥物的潛在作用靶點和途徑，揭示中藥或其復雜成分的作用機制。本研究通過網絡藥理學數(shù)據(jù)分析以揭示補骨脂乙素在2 型糖尿病治療中的潛在作用，探究補骨脂乙素在2 型糖尿病治療中的作用機制，在細胞水平構建胰島素抵抗細胞模型并進行實驗驗證，為補骨脂乙素在2 型糖尿病治療中的應用提供一個新的研究視角和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 補骨脂乙素作用靶點的獲取

采用 ECTM 數(shù)據(jù)庫（http://tcmip.cn/ECTM/index.php），查找補骨脂的活性成分補骨脂乙素相應的候選靶基因。將PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://Pub Chem.ncbi.nim.nih.gov）提供標準的補骨脂乙素的Canonical SMILES 格式，導入為“Homo sapiens”預設的SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.SwissTargetPrediction.ch）中，預測補骨脂乙素潛在目標。整理補骨脂乙素作用靶點并刪除重復靶點。

1.2 疾病靶點的獲取

基于GeneCards 以“type 2 diabetes”為關鍵詞獲取與2型糖尿病相關的靶點，靶點根據(jù)“Relevance score”降序排列，通過 MEDIAN 函數(shù)，保留Relevance score＞5.795 82 的靶點，通過查閱文獻補充靶點并刪除重復的靶點。

1.3 補骨脂乙素抗2 型糖尿病作用靶點的預測

將上述得到的補骨脂乙素作用的相關靶點以及2 型糖尿病相關靶點導入Venn 數(shù)據(jù)庫（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）中進行交互分析，獲得交集靶點作為補骨脂乙素治療2 型糖尿病的作用靶點。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網絡構建與分析

將相互交集的靶點導入 STRING 數(shù)據(jù)庫（http://sting-db.org），計算蛋白相互網絡關系，物種選“Homo sapiens”，以節(jié)點（node）和“邊”（edge）表示靶點關聯(lián)程度。同時采用Cytoscape 3.9.1 軟件對所得結果進行拓撲分析，通過插件MCODE 進行基因簇的分析，結合插件Cytohubba 的MCC 算法篩選核心靶標。

1.5 富集分析

將關鍵靶點導入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）做聚類分析，并對關鍵靶點所涉及的細胞功能（CC）、分子功能（MF）、生物功能（BP）進行富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。以P＜0.05 為閾值，完成關鍵靶點富集分析。通過微生信（http://bioinformatics.com.cn）平臺得出相應的富集結果，根據(jù)P值將前20 個結果繪制氣泡圖和通路氣泡圖。

1.6 藥物與試劑

補骨脂乙素（質量分數(shù)≥98%，貨號20784-50-3）購自大連美侖生物技術有限公司；二甲雙胍（質量分數(shù)≥99%，貨號1115-70-4）購自大連美侖生物技術有限公司；棕櫚酸（質量分數(shù)97%，貨號57-10-3）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；DMEM 高糖液體培養(yǎng)基[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，貨號11995065]；DMEM 無糖培養(yǎng)基[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，貨號11966025]；胎牛血清（FBS）[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，貨號C0232]；胰島素（貨號11061-68-0）購自大連美侖生物技術有限公司；熒光D-葡萄糖類似物2-NBDG（貨號186689-07-6）購自武漢安捷凱生物醫(yī)藥科技有限公司。

Western 及IP 細胞裂解液（碧云天生物技術有限公司，貨號P0013J）；胰島素受體（INS-R）抗體（ImmunoWay Biotechnology Company，貨 號YT2361）；胰島素受體底物1（IRS1）抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號WL03123）；磷脂肌醇-3-激酶（PI3K）抗體（CellSignaling Technology,Inc，貨號4257S）；蛋白激酶B（Akt）抗體（Proteintech Group,Inc，貨號10176-2-AP）；Anti-葡萄糖轉運蛋白2（GLUT2）Rabbit pAb（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號WL03363）。

1.7 胰島素抵抗細胞模型的建立、劑量確定及分組

1.7.1 胰島素抵抗細胞模型的建立 HepG2 細胞培養(yǎng)條件：DMEM 培養(yǎng)基＋10%胎牛血清＋1%青-鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。細胞貼壁培養(yǎng)，當細胞密度約為90%時，計數(shù)傳代于6 孔板培養(yǎng)皿中，進行后續(xù)實驗。在細胞生長處于對數(shù)期時，通過無糖DMEM 培養(yǎng)基饑餓細胞12 h，接著用200 μmol/L 棕櫚酸處理細胞24 h。

1.7.2 細胞活性的檢測 按照1×104HepG2 個細胞/mL（100 μL/孔）的密度將細胞接種于96 孔培養(yǎng)板。設置對照組、DMSO 組、補骨脂乙素（4、8、10、12、14 μmol/L）組，每組7 個復孔。加藥物處理24 h 后，棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 遍，使用DMEM培養(yǎng)基按照1∶10 比例稀釋CCK8 試劑，加CCK8后置于培養(yǎng)箱中作用30 min。后用酶標儀（TECAN）檢測細胞在450 nm 處A值。

1.7.3 2-NBDG 檢測細胞對葡萄糖的攝取 按照1×104個細胞/mL（100 μL/孔）的密度將細胞接種于96 孔培養(yǎng)板。設置對照組、模型組、補骨脂乙素組、二甲雙胍組，每組7 個復孔。模型組、補骨脂乙素組、二甲雙胍組細胞按1.7.1 項下方法進行胰島素抵抗誘導。補骨脂乙素組和二甲雙胍（200 μmol/L）組在胰島素抵抗模型基礎上分別加藥物處理24 h 后，棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 遍，更換為含有1×10-6mol/L 胰島素的無糖DMEM 培養(yǎng)基處理10 min，更換至含50 nmol/L 2-NBDG 的無糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min 后PBS 清洗2 次，最后每孔加100 μL PBS 溶液，用酶標儀（TECAN）檢測細胞在475、550 nm 處的A值。

1.7.4 細胞的分組及加藥處理 胰島素抵抗細胞細胞模型隨機分為模型組、二甲雙胍組、補骨脂乙素組。二甲雙胍組用200 μmol/L 二甲雙胍處理24 h，補骨脂乙素組用10 μmol/L 補骨脂乙素處理24 h，正常培養(yǎng)條件的HepG2 細胞作為對照組。

1.8 總RNA 提取和濃度測定

6 孔板每孔細胞中加入1 mL Trizol 裂解液，冰上裂解15 min；加200 μL 三氯甲烷劇烈振蕩，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液；加入與上清等體積的異丙醇后混勻，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min 后棄上清液；加DEPC 水配制的75%乙醇洗滌RNA 沉淀；4 ℃、7 500 r/min 離心5 min 后棄上清液；RNA 沉淀晾至透明，根據(jù)沉淀的體積加適量DEPC 水充分溶解RNA。通過DEPC 水空白檢測，通過Nano 儀器（Nanodrop，美國）檢測RNA 濃度，260、280 nm 的吸光度（A）比值需在1.8～2.1。

1.9 RT-PCR 法檢測 PI3K/Akt 信號通路相關mRNA 的水平

使用高容量cDNA 逆轉錄試劑盒（Vazyme，HiScript?III.RT SuperMix）將RNA 逆轉成cDNA用于qPCR，在QuantStudio 3 Flex 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)（美國Thermo Fisher 公司）檢測相對基因表達，將mRNA 水平歸一化至Actin 表達水平，數(shù)據(jù)按qRT-PCR 熒光定量數(shù)據(jù)分析法計算2-ΔΔCt。檢測模型組與對照組細胞中PI3K/Akt 信號通路指標mRNA 含量，并檢測補骨脂乙素干預后的變化。

1.10 Western blotting 檢測PI3K/Akt 信號通路相關蛋白表達的水平

細胞加藥處理結束后加入 RIPA 裂解液、Cocktail 冰上裂解30 min 后將細胞碎片混懸液轉移到離心管中，12 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清裝至離心管中以待檢測。使用BCA 蛋白質定量試劑盒測定蛋白含量。取適量上清，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，95 ℃蛋白變性10 min。電泳后，轉至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗（INS-R 按1∶1 000 稀釋，IRS1 按1∶1 500 稀釋，GLUT2 按1∶1 000 稀釋，PI3K 按1∶500 稀釋，p-PI3K 按1∶500 稀釋，Akt 按1∶1 000 稀釋，p-Akt按1∶1 000 稀釋，Actin 按1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜后TBST 溶液洗3 遍，加入二抗（按1∶20 000 稀釋），室溫孵育1 h。TBST 溶液3 遍，使用ECL 試劑盒進行顯影。以Actin 為內參，計算INS-R、IRS1、GLUT2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白相對表達量。

1.11 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism9 軟件用于所有數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以表示。使用雙尾、未配對的Student T檢驗來評估兩組之間的統(tǒng)計學意義，使用單因素方差分析（單因子方差分析）。

2 結果

2.1 補骨脂乙素抗2 型糖尿病的相關靶點

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫獲取補骨脂乙素的化學結構。從ECTM 數(shù)據(jù)庫、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫和結合文獻挖掘方法收集到的基因刪除重復項后，共得到100 個相關靶點；利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲取了與2 型糖尿病相關的靶點共8 279 個。將收集到的補骨脂乙素靶點與2 型糖尿病疾病靶點交互分析，結果表明，補骨脂乙素對應的靶點中有92 個與2 型糖尿病有關，見圖1。

圖1 補骨脂乙素作用靶點與2 型糖尿病疾病靶點相互取交集情況Fig.1 Intersection between isobavachalcone target and type 2 diabetes target

2.2 PPI 分析結果

將92 個重疊基因進一步擬合到STRING 中，PPI 網絡（交互得分≥0.150），包含補骨脂乙素和2型糖尿病的共同目標的86 個節(jié)點和379 個“邊”（圖2）。Cytoscape 3.9.1 軟件中插件MCODE 分析了具有MCODE 默認值的整個網絡，這產生了3 個Score＞5 的模塊，即集群1（節(jié)點：16，得分：6.8）（圖3A），集群2（節(jié)點：16，得分：6.4）（圖3B），集群3（節(jié)點：6，得分：5.2）（圖3C）。其中使用Cytohubba 和最大團中心性（MCC）算法作為潛在目標預測的過濾條件，篩選了從2 個聚類中提取的前38 個節(jié)點（圖3D～F）。在MCODE 和Cytohubba的篩選結果交叉后，獲得了35 個共同靶點，其中包括常見的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、酪氨酸蛋白激酶（SRC）、磷脂酰肌醇激酶-3 催化亞單位α 基因（PIK3CA）、絲裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）、酪氨酸激酶受體2（ERBB2）、低氧誘導因子-1（HIF1A）、間質表皮轉化因子（MET）、碳酸酐酶9（CA9）等。

圖2 藥物與疾病共同靶點的PPI 網絡圖Fig.2 PPI network diagram of drug and disease common targets

圖3 補骨脂乙素治療2 型糖尿病核心靶點的篩選Fig.3 Screening of core targets of isobavachalcone for the treatment of type 2 diabetes

2.3 GO 分析和KEGG 富集分析結果

有177 個BP、28 個CC、54 個MF 和113 個KEGG 途徑滿足P＜0.05 的條件。KEGG 途徑富集分析揭示了與2 型糖尿病治療靶點密切相關的途徑，包括PI3K/Akt 信號通路、胰島素信號通路和2型糖尿病信號通路。在BP 分析中，靶基因主要富集于信號轉導、蛋白磷酸化的調節(jié)、參與跨膜受體酪氨酸激酶信號通路的調節(jié)以及炎癥反應的調節(jié)等。核膜、質膜和細胞器包膜內腔被發(fā)現(xiàn)參與CC富集分析，MF 分析發(fā)現(xiàn)靶點參與結合SH2 結構域激活激酶活性、結合ephrin 受體參與細胞增殖活動以及氧化還原反應，見圖4。

圖4 補骨脂乙素35 個潛在治療2 型糖尿病靶點的GO 富集和KEGG 途徑富集分析Fig.4 GO enrichment and KEGG pathway enrichment analysis of isobavachalcone 35 potential therapeutic targets for type 2 diabetes

2.4 體外實驗驗證

2.4.1 補骨脂乙素最佳刺激濃度篩選 為了探尋補骨脂乙素最佳作用濃度，使用0、4、8、10、12、14 μmol/L 補骨脂乙素作用HepG2 細胞24 h，檢測細胞活力，與對照組相比，當補骨脂乙素濃度為4、8、10 μmol/L 時，細胞活力均沒有下降，當濃度為12 μmol/L 時，細胞活力開始有顯著下降趨勢（P＜0.05），因此選擇干預濃度為4、8、10 μmol/L。當補骨脂乙素濃度為10 μmol/L 時能顯著提高模型細胞的葡萄糖攝取能力（P＜0.01），因此后續(xù)研究選用補骨脂乙素的干預濃度為10 μmol/L，見圖5。

圖5 補骨脂乙素對HepG2 細胞活力及葡萄糖攝取能力的影響（，n=3）Fig.5 Effect of isobavachalcone on HepG2 cell viability and glucose uptake capacity (,n=3)

2.4.2 補骨脂乙素對胰島素抵抗細胞葡萄糖攝取能力的影響 與對照組相比，模型組HepG2 細胞攝取2-NBDG 的熒光強度顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，二甲雙胍組和補骨脂乙素組細胞熒光強度顯著增強（P＜0.01）。二甲雙胍組和補骨脂乙素組顯著提高了棕櫚酸處理細胞后葡萄糖的攝取能力，見圖6。

圖6 葡萄糖的攝取能力的檢測結果（，n=3）Fig.6 Detection of 2-NBDG (,n=3)

2.5 補骨脂乙素對胰島素抵抗細胞模型PI3K/Akt信號通路相關基因mRNA 表達的影響

與對照組相比，模型組INS-R、IRS1、GLUT2、PI3K、AktmRNA 水平均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。補骨脂乙素組INS-R、IRS1、GLUT2、PI3K、AktmRNA 的表達水平顯著高于模型組（P＜0.01、0.001），見圖7。

圖7 補骨脂乙素對胰島素抵抗細胞模型PI3K/Akt 信號通路相關基因mRNA 表達的影響（，n=3）Fig.7 Effect of isobavachalcone on mRNA expression of PI3K/AKT signaling pathway in insulin resistant cell model (,n=3)

2.6 補骨脂乙素對胰島素抵抗細胞模型PI3K/Akt信號通路蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組處理顯著降低了INS-R、IRS1、GLUT2、Akt、PI3K、p-Akt、p-PI3K 蛋白表達（P＜0.05、0.001）。與模型組相比，二甲雙胍組和補骨脂乙素組的INS-R、IRS1、GLUT2、Akt、PI3K、p-Akt、p-PI3K 的蛋白表達顯著上調（P＜0.01、0.001），見圖8。

圖8 補骨脂乙素對胰島素抵抗細胞模型PI3K/Akt 信號通路蛋白表達的影響（，n=3）Fig.8 Effect of isobavachalcone on protein expression of PI3K/Akt signaling pathway in insulin resistant cell model (,n=3)

3 討論

2 型糖尿病是多基因、多因素作用的疾病，僅根據(jù)單一作用靶點難以達到良好的治療效果[19]。中藥或天然藥物具有多成分、多靶點的特點，被視為藥物開發(fā)的重要來源[20]。由于中藥成分復雜且涉及靶點較多，從多成分中尋找具有潛在開發(fā)價值的天然產品通常具有挑戰(zhàn)性。網絡藥理學作為一種新的方法，從系統(tǒng)層次和生物網絡的整體角度出發(fā)，解析藥物與疾病之間的靶點網絡[21]。補骨脂乙素是補骨脂中的黃酮類的化合物，補骨脂乙素可以抑制NF-κB 通路改善大鼠糖尿病腎病，抑制腎臟炎癥，改善腎損傷[22]，表明補骨脂乙素與2 型糖尿病有一定的相關性。但補骨脂乙素在2 型糖尿病中的作用效果及機制仍需進一步的研究。

通過補骨脂乙素作用靶點與2 型糖尿病靶點的交集得到多個重疊的基因及核心靶點，PPI 顯示補骨脂乙素作用于2 型糖尿病的靶蛋白之間具有密切的相互作用，KEGG 分析表明靶基因富集在PI3K/Akt 信號通路，GO 分析表明補骨脂乙素治療2 型糖尿病的核心靶點參與PI3K 酶活性及PI3K 復合物的形成，表明PI3K/Akt 在補骨脂乙素治療2 型糖尿病機制可能起著重要的作用。PI3K/Akt 及其相關信號通路在生物體生長和關鍵BP（如葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質代謝、蛋白質合成和細胞增殖和存活）中起著關鍵的作用[23]。在血糖調節(jié)過程中，胰島素與靶細胞膜上的胰島素受體（IR）結合促進IRS-1 磷酸化，IRS1 通過SH2 結構域激活PI3K，PI3K 與下游效應物Akt 結合并激活其表達，進一步導致GLUT4 易位至細胞膜，增加細胞對葡萄糖的攝取，調節(jié)血糖平衡[24]，GLUT4 表達的改變會導致葡萄糖攝取或輸出障礙，導致胰島素抵抗的發(fā)生[25]。補骨脂乙素的潛在靶點與2 型糖尿病靶點的交集中均發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt 通路相關靶點，如PIK3CA、磷酸肌醇-3-激酶催化亞基β 肽（PIK3CB）、mTOR 等。PI3K/Akt 通過下游叉頭框蛋白O1（FOXO1）和糖原合成酶激酶3（GSK3）調節(jié)葡萄糖代謝，通過mTOR 蛋白復合體1（mTORC1）和固醇調節(jié)元件結合蛋白（SREBP）調節(jié)脂質代謝[26]。KEGG 富集分析中發(fā)現(xiàn)補骨脂乙素靶點也富集在PI3K/Akt 下游FOXO 和mTOR 信號通路。本研究利用細胞實驗對網絡藥理學預測結果PI3K/Akt 信號通路進行了驗證。

實驗結果顯示，胰島素抵抗細胞經補骨脂乙素處理后，胰島素抵抗細胞的葡萄糖攝取能力明顯增強，胰島素抵抗細胞中PI3K、Akt、INS-R、IRS1的mRNA 顯著升高，與葡萄糖攝取相關的GLUT2mRNA 表達水平也顯著增加。PI3K 和Akt 蛋白及其磷酸化也顯著升高，INS-R、IRS1、GLUT2 的蛋白表達水平與轉錄水平表達趨勢一致，說明補骨脂乙素通過PI3K/Akt 信號通路增加葡萄糖的攝取改善胰島素抵抗，從而發(fā)揮抗2 型糖尿病的作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學及細胞生物學技術對補骨脂乙素靶點及作用通路進行分析，表明補骨脂乙素治療2 型糖尿病是多成分、多靶點、多途徑協(xié)同作用的結果。補骨脂乙素可能通過PI3K/Akt 信號通路發(fā)揮對2 型糖尿病的治療作用，為其后續(xù)進一步深入研究提供了基礎和參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突