基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究香砂枳術(shù)丸治療功能性消化不良的作用機(jī)制與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

李雪巖 羅志強(qiáng) 韓 星 楊文寧 陳洪嬌 江曉泉 森慕黎 汪國(guó)鵬 劉 洋

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京,102488; 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京,102488;3 中財(cái)瀚熙〔北京〕生物科技發(fā)展有限公司,北京,101503)

香砂枳術(shù)丸,最早出自《景岳全書》,由枳實(shí)、白術(shù)、砂仁和木香組成,是《中華人民共和國(guó)藥典》收載的基本藥物。其中木香為君藥,枳實(shí)為臣藥,具有健脾開胃、順氣寬胸、行氣消痞的功效,可用于脘腹疼痛、食欲不振、脾虛氣滯等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明,此制劑具有調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng),促進(jìn)消化的功能,現(xiàn)常用于治療功能性消化不良(Functional Dyspepsia,FD),療效較為顯著[1-3]。

FD是臨床消化系統(tǒng)的常見病癥,據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì),全球范圍內(nèi)FD患病率為10%～30%,其中亞洲人群患病率8%～23%,且有升高的趨勢(shì),嚴(yán)重影響了人們的生命質(zhì)量[4-5]。目前,西醫(yī)暫沒(méi)有明確針對(duì)FD的藥物,而中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的優(yōu)勢(shì),通過(guò)明確疾病的病因、病機(jī)和辨證論治,可有效地緩解癥狀、降低復(fù)發(fā)率,極大地提高患者的康復(fù)率。

“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”最早由英國(guó)藥理學(xué)家HOPKINS于2007年提出[6],研究者可從生物信息學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的角度,整體研究中藥復(fù)方的藥理作用機(jī)制,這與中藥整體觀的思路不謀而合。

中藥復(fù)方是按照配伍規(guī)律將多種不同中藥按一定比例組合而成的一種經(jīng)典給藥形式,在我國(guó)醫(yī)療體系中發(fā)揮著重要的作用。然而由于中藥復(fù)方所涉及的成分較為復(fù)雜、靶點(diǎn)眾多,而且缺乏探索中藥復(fù)方組合規(guī)律的方法,難以完全闡釋中藥復(fù)方防病、治病的作用機(jī)制。ZHANG等[7]通過(guò)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺(tái),以清絡(luò)飲為研究對(duì)象,揭示了其抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等關(guān)鍵過(guò)程,為日后對(duì)中藥復(fù)方深入系統(tǒng)研究提供了理論參考?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理論,逍遙散、四妙丸、桃紅四物湯等經(jīng)典中藥復(fù)方治療慢性疾病的作用機(jī)制逐漸被揭示并得到證實(shí)[8-11]。因此,本文以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路,結(jié)合分子對(duì)接,探索中藥復(fù)方制劑香砂枳術(shù)丸對(duì)治療FD的潛在作用機(jī)制,為其實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)與參考。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 數(shù)據(jù)分析平臺(tái)及軟件 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php);中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具(Bioinformatics Analysis Tool of Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine,BATMAN-TCM,http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm);Perl語(yǔ)言;在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,https://omim.org);UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/);治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(Therapeutic Target Database,TTD,https://www.db.idrblab.org/ttd/);Drug Bank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/);GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/);STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/);Cytoscape軟件;MOE軟件;RCS PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/);DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)。

TCMSP是由西北大學(xué)計(jì)算生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室建立的中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái),包括是《中華人民共和國(guó)藥典》注冊(cè)的499種中藥及化合物(共計(jì)30 000余個(gè)),是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)常用的分析平臺(tái)[12]。通過(guò)在“Herb name”項(xiàng)下分別輸入4味中藥進(jìn)行檢索活性成分,并且以影響藥效的關(guān)鍵參數(shù)類藥性(Drug Likeness,DL)和口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)作為篩選條件[13],最小值分別設(shè)定為0.18和30%得到活性成分。BATMAN-TCM是國(guó)內(nèi)首個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥分子機(jī)制的在線生信研究平臺(tái),可實(shí)現(xiàn)中藥及復(fù)方成分和靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)和分析[14]。通過(guò)在“Formula”項(xiàng)下輸入“XIANG SHA ZHI ZHU WAN”,將“Score cutoff”設(shè)定為30,建立活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。

1.1.2 動(dòng)物 無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)SD大鼠,雄性,7周齡,體質(zhì)量約220 g,購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可合格證號(hào):SCXF(京)2019-001,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,溫度25～27 ℃,相對(duì)濕度50%～70%,實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，嚴(yán)格遵循北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理部的倫理標(biāo)準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：BUCM-4-2022061501-2061)。

1.1.3 藥物 香砂枳術(shù)丸(安徽亳州,批號(hào):2023-3-15);多潘立酮(西安楊森制藥有限公司,批號(hào):MKJOX54)。

1.1.4 試劑與儀器 活性炭粉(天津市登峰化學(xué)試劑廠,批號(hào):20221223);羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20200713);蔗糖(西隴科學(xué)股份有限公司,批號(hào):2105062);氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司,批號(hào):2206081907);大鼠5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)試劑盒,大鼠血管活性腸肽(Vasoactive Intestinal Peptide,VIP)試劑盒,大鼠白細(xì)胞介素6(Interleukin-6,IL-6)試劑盒(北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司,貨號(hào):DG20153D,DG20146D,DG94490Q)。酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司,美國(guó),型號(hào):MultiSkan FC);超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司,型號(hào):KQ5200E);電子分析天平(Sartorius公司,德國(guó),BSA2202S);高速冷凍離心機(jī)(Sigma離心機(jī),德國(guó),型號(hào):1-15PK)。

1.2 方法

1.2.1 香砂枳術(shù)丸活性成分靶點(diǎn)的篩選 分別在TCMSP和BATMAN-TCM平臺(tái)篩選活性成分相關(guān)靶點(diǎn),使用Perl語(yǔ)言和UniProt進(jìn)行靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化,將Organism設(shè)置為“Homo sapiens(Human)”,統(tǒng)一使用UniProt ID表示,建立成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.2 FD靶點(diǎn)的篩選 以“Functional Dyspepsia”為檢索關(guān)鍵詞,分別在TTD、Drug Bank、OMIM和GeneCards這4個(gè)國(guó)際認(rèn)可的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲取疾病靶點(diǎn),建立疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.3 “中藥復(fù)方-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 Cytoscape是一款能圖形化顯示數(shù)據(jù)并可數(shù)據(jù)分析的可視化軟件,將獲取的活性成分與靶點(diǎn)導(dǎo)入,構(gòu)建“中藥復(fù)方-活性成分-作用靶點(diǎn)”的藥物靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò),用于探究香砂枳術(shù)丸治療FD的藥理學(xué)作用機(jī)制。

1.2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了明確藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系,將活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)分別導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),將“Organism”項(xiàng)下設(shè)置為“Homo sapiens(Human)”,分別構(gòu)建活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.5 核心靶點(diǎn)篩選 將“1.2.4”項(xiàng)下網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape,使用“Merge”功能并借助Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò),選取度值(Degree)大于2倍中位數(shù)的靶點(diǎn)作為候選核心靶點(diǎn)。采用CytoNCA插件對(duì)候選核心靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析。以接近中心性(Closeness Centrality,CC)和介度中心性(Betweeness Centrality,BC)為標(biāo)準(zhǔn),篩選標(biāo)準(zhǔn)為大于1倍中位數(shù)。符合標(biāo)準(zhǔn)的靶點(diǎn)即可作為核心靶點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 將核心靶點(diǎn)輸入DAVID,使用“Functional Annotation”功能,將“Gene List Manager”和“Population Manager”項(xiàng)下均設(shè)置為“Homo sapiens”后進(jìn)行生信學(xué)分析。查看Gene Ontology項(xiàng)下的細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)、生物過(guò)程(Biological Process,BP)進(jìn)行GO富集分析;依據(jù)P-Value和通路基因富集數(shù)進(jìn)行KEGG富集分析。

1.2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證 從RCSB PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)獲取核心靶點(diǎn)度值最大的2個(gè)靶點(diǎn)INS(PDB ID:1TYL)、AKT1(PDB ID:3BDY)的3D結(jié)構(gòu)及自帶配體,選取物種為“Homo sapiens”;收集75個(gè)活性成分的3D結(jié)構(gòu),使用MOE對(duì)接軟件對(duì)靶蛋白預(yù)處理,分子對(duì)接后通過(guò)打分值評(píng)價(jià)活性成分、自帶配體與靶點(diǎn)結(jié)合活性大小,驗(yàn)證上述網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果。

1.3 實(shí)驗(yàn)分析

1.3.1 分組與模型制備 將30只SD大鼠通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表分成空白組、模型組、香砂枳術(shù)丸組和多潘立酮組,每組6只。除空白組外,其余各組采用不規(guī)則喂養(yǎng)和夾尾刺激法建立FD大鼠模型:大鼠正常飲水,隔日禁食,每天用長(zhǎng)海綿鉗夾大鼠尾部遠(yuǎn)端約1/3處,0.5 h/次,每隔3 h刺激1次,4次/d,連續(xù)7 d。造模結(jié)束后,恢復(fù)正常的飲食和飲水。

1.3.2 給藥方法 各給藥組分別灌胃相應(yīng)香砂枳術(shù)丸(7.2 g/kg)與多潘立酮混懸液(9×10-3g/kg),空白組和模型組灌胃等體積(3 mL)生理鹽水,2次/d,連續(xù)14 d。

1.3.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 一般行為學(xué)觀察:對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組大鼠的食物攝入量、飲水量、體質(zhì)量、活動(dòng)度、毛發(fā)、糞便等進(jìn)行觀察和評(píng)估。

炭末推進(jìn)實(shí)驗(yàn):大鼠最后1次給藥后,禁食不禁水后灌胃炭末液,30 min后腹主動(dòng)脈取血處死,用直尺測(cè)量小腸全長(zhǎng)以及炭末達(dá)最前端的距離,計(jì)算大鼠小腸炭末推進(jìn)率(炭末推進(jìn)距離/小腸全長(zhǎng)×100%)。

大鼠血清IL-6、VIP以及5-HT含量檢測(cè):大鼠腹主動(dòng)脈取血后,靜置20 min,離心機(jī)以3 500 r/min,離心半徑10 cm,離心15 min取上層血清,按照試劑盒說(shuō)明書中步驟使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)測(cè)定上述藥效學(xué)指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果 TCMSP和BATMAN-TCM共篩得活性成分75個(gè),其中白術(shù)中化合物7個(gè);砂仁中化合物24個(gè),枳實(shí)中化合物33個(gè);木香中化合物9個(gè);共有成分有2個(gè);共得到靶點(diǎn)292個(gè)。見表1。

2.2 FD疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果 共篩選得到FD疾病靶點(diǎn)666個(gè)。見表2。

表2 香砂枳術(shù)丸對(duì)大鼠體質(zhì)量增量的影響

表2 疾病靶點(diǎn)統(tǒng)計(jì)(個(gè))

2.3 “中藥復(fù)方-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 構(gòu)建的“中藥復(fù)方-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)共包括371個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)和1 353條邊,在篩選得到的292個(gè)靶點(diǎn)中,60%以上的靶點(diǎn)至少與2個(gè)化合物發(fā)生相互作用,而且不同的活性成分也作用于相同的靶點(diǎn)。此外,前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase 2,PTGS2)基因、孕酮受體(Progesterone Receptor,PGR)基因、雌激素受體1(Estrogen Receptor 1,ESR 1)基因在此網(wǎng)絡(luò)中是度值前3的靶點(diǎn),與20個(gè)以上的化合物發(fā)生相互作用。PTGS2,又稱之為環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase,COX)在網(wǎng)絡(luò)中度值最高。見圖1。

圖1 “中藥復(fù)方-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 活性成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)獲得節(jié)點(diǎn)288個(gè),PPI網(wǎng)絡(luò)邊有3 400條;疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)獲得節(jié)點(diǎn)587個(gè),PPI網(wǎng)絡(luò)邊有16 922條,用于下一步核心靶點(diǎn)的選擇。

2.5 核心靶點(diǎn)篩選結(jié)果 絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果表明BC和CC的中位數(shù)值分別為0.002和0.491,故使用BC>0.002和CC>0.491為篩選條件獲取核心靶點(diǎn),最終獲取核心靶點(diǎn)90個(gè)。隨著度值增大,節(jié)點(diǎn)的大小與顏色逐漸加深,位于中心的節(jié)點(diǎn)為度值最大的節(jié)點(diǎn)。見圖2～3。

圖2 核心靶點(diǎn)篩選流程及結(jié)果

圖3 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.6 生物信息學(xué)分析結(jié)果 香砂枳術(shù)丸在治療FD的分子功能主要涉及一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控(Positive Regulation of Nitric Oxide Biosynthetic Process)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(Positive Regulation of Transcription from RNA Polymerase Ⅱ Promoter)、基因表達(dá)正調(diào)控(Positive Regulation of Gene Expression)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控(Negative Regulation of Apoptotic Process)、DNA轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(Positive Regulation of Transcription,DNA-templated)等。生物過(guò)程主要富集在同源蛋白結(jié)合(Identical Protein Binding)、酶結(jié)合(Enzyme Binding)、蛋白結(jié)合(Protein Binding)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(Transcription Factor Binding)、生長(zhǎng)因子活性(Growth Factor Activity)等。細(xì)胞組分主要位于細(xì)胞外空間(Extracellular Space)、胞外區(qū)(Extracellular Region)、細(xì)胞溶質(zhì)(Cytosol)、蛋白復(fù)合體(Protein Complex)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)(Perinuclear Region of Cytoplasm)等。

香砂枳術(shù)丸治療FD的藥理作用機(jī)制主要涉及癌癥通路(Pathways in Cancer)、細(xì)胞凋亡通路、炎癥通路等,如PI3K-AKT信號(hào)通路(PI3K-AKT Pathway)、缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF-1)信號(hào)通路、叉頭盒O(Forkhead box O,FoxO)蛋白信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)信號(hào)通路等。

2.7 分子對(duì)接 對(duì)接分?jǐn)?shù)顯示,75個(gè)活性成分中有90%以上的成分與INS、AKT1對(duì)接分?jǐn)?shù)大于陽(yáng)性參照物。見圖4～5。

圖4 INS與MS-2分子對(duì)接

圖5 AKT1與MS-1分子對(duì)接

2.8 大鼠一般情況 通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn),與空白組比較,模型組大鼠普遍出現(xiàn)活動(dòng)減緩,活躍度降低,毛發(fā)少亂,枯黃,易怒和打斗,進(jìn)食量和進(jìn)水量逐漸減少,大便變干,可認(rèn)定造模成功。香砂枳術(shù)丸組和多潘立酮組大鼠的體質(zhì)量增量顯著高于模型組大鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且與空白組大鼠增長(zhǎng)幅度接近。見表2。

2.9 香砂枳術(shù)丸對(duì)大鼠炭末推進(jìn)率的影響 與空白組比較,模型組的炭末推進(jìn)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,香砂枳術(shù)丸組與多潘立酮組的炭末推進(jìn)率有所上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 香砂枳術(shù)丸對(duì)大鼠炭末推進(jìn)率的影響

2.10 香砂枳術(shù)丸對(duì)大鼠血清IL-6、VIP以及5-HT的影響 與空白組比較,模型組大鼠血清IL-6和VIP含量顯著升高,血清中5-HT含量下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與模型組比較,香砂枳術(shù)丸組與多潘立酮組大鼠血清的IL-6和VIP含量顯著下降,血清中5-HT含量顯著提高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖6～8。

圖6 香砂枳術(shù)丸對(duì)大鼠血清IL-6的影響

圖7 香砂枳術(shù)丸對(duì)大鼠血清VIP的影響

圖8 香砂枳術(shù)丸對(duì)大鼠血清5-HT的影響

3 討論

DAVID是一個(gè)基于基因本體(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)的高通量生物信息平臺(tái),整合了各種生物學(xué)數(shù)據(jù)(如大量的基因序列和蛋白列表)和分析工具,可以系統(tǒng)全面地提供生物學(xué)信息[15]。

“中藥復(fù)方-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建表明中藥復(fù)方在治療疾病方面具有多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同治療作用,而不是僅僅作用于某一個(gè)靶蛋白,符合中醫(yī)藥整體觀的治療原則。此外,前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthase 2,PTGS2)基因、孕酮受體(Progesterone Receptor,PGR)基因、雌激素受體1(Estrogen Receptor 1,ESR 1)基因在此網(wǎng)絡(luò)中是度值前3的靶點(diǎn),與20個(gè)以上的化合物發(fā)生相互作用[16]。表明其結(jié)合活性良好,也證明此次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的預(yù)測(cè)結(jié)果具有可靠性,可為日后的分子生物學(xué)研究提供有價(jià)值的參考。

本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,探究了香砂枳術(shù)丸治療FD的作用機(jī)制。首先分析了復(fù)方的活性成分,并使用Cyctoscape構(gòu)建了活性成分與靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖,證明此復(fù)方協(xié)同治療作用。同時(shí)選取了此網(wǎng)絡(luò)度值最高的3個(gè)靶點(diǎn),認(rèn)為這些節(jié)點(diǎn)在治療FD中具有重要作用。經(jīng)多次篩選得出核心靶點(diǎn)后,這3個(gè)靶點(diǎn)仍涵蓋其中,且度值較高,也證明其治療疾病時(shí)的重要性。借助GO和KEGG分析,從生物信息學(xué)的角度對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行富集研究。最后使用分子對(duì)接,對(duì)本研究的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

白術(shù)作為補(bǔ)氣健脾第一要藥,臨床多用于治療胃腸道疾病,實(shí)驗(yàn)證明白術(shù)炮制后,白術(shù)內(nèi)酯含量出現(xiàn)顯著升高,而其含有的揮發(fā)油成分,如蒼術(shù)酮,與生品比較有所下降[17-18]。藥理研究表明,白術(shù)的水煎液對(duì)于大鼠胃腸道具有雙向調(diào)節(jié)作用,馬曉松等[19]以實(shí)驗(yàn)豚鼠為研究對(duì)象,初步研究了不同濃度白術(shù)水煎液對(duì)于動(dòng)物胃腸運(yùn)動(dòng)的影響,為白術(shù)對(duì)于便秘以及泄瀉的治療提供了理論基礎(chǔ)。白術(shù)所含的內(nèi)酯類成分還可以對(duì)抗炎癥介質(zhì),抑制IL-6、TNF的表達(dá),能減輕胃黏膜損傷[20]。

生品枳實(shí),具有很強(qiáng)的破氣作用,藥理研究表明,其有效成分辛弗林、新橙皮苷以及柚皮苷對(duì)于脾虛大鼠胃腸道有顯著的促進(jìn)作用,具體機(jī)制與促進(jìn)胃腸道激素分泌有關(guān)[21]。另有研究證明,枳實(shí)的水提取液可通過(guò)上調(diào)5-HT受體4以及神經(jīng)絲蛋白H促進(jìn)神經(jīng)叢修復(fù),進(jìn)而緩解慢性傳輸型便秘[22]。麩炒后可增加柚皮苷等黃酮類化合物的溶解度和脂溶性,進(jìn)而能使藥物利于透過(guò)細(xì)胞膜增加藥物吸收,增加對(duì)于胃腸道的作用[23]。木香,用于脘腹脹痛、食積不消等癥狀,具有代表性的成分如木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯[24]。研究證實(shí),木香顯著改善乙醇所導(dǎo)致的小鼠胃潰瘍的形成,其作用機(jī)制與改善細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞的增殖有關(guān),此研究為木香作為胃腸道保護(hù)藥提供了新的理論基礎(chǔ)[25]。砂仁多含有揮發(fā)油成分如異龍腦、樟腦,研究證明,揮發(fā)油成分是對(duì)胃黏膜保護(hù)的主要成分[26]。

根據(jù)最新的羅馬Ⅳ標(biāo)準(zhǔn),FD癥狀起源于胃、十二指腸,主要癥狀表現(xiàn)為早飽感、餐后腹脹,上腹痛及上腹部燒灼感。根據(jù)不同臨床表現(xiàn),具體可以分為上腹痛綜合征和餐后不適綜合征2種[27]。我國(guó)各種來(lái)源的經(jīng)典古籍之中并沒(méi)有關(guān)于FD的記載,但可以根據(jù)臨床表現(xiàn)將其歸為痞滿?！捌M”一詞,首見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》:“心胃生寒,胸膈不利,心痛痞滿,頭痛善悲?！敝嗅t(yī)認(rèn)為FD多在肝脾不和,導(dǎo)致肝氣郁結(jié)、脾胃虛弱,故治療關(guān)鍵在于健脾開胃,行氣消痞,此疾病的發(fā)病原因在于幽門螺桿菌導(dǎo)致感染、腦-腸軸紊亂、胃腸動(dòng)力異常、內(nèi)臟高敏感性等[28-29]。

PI3K-AKT信號(hào)通路是一類較為經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,可以調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞功能,例如細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、存活以及合成等方面發(fā)揮著重要的作用[30]。此通路與胃黏膜細(xì)胞具有很強(qiáng)關(guān)聯(lián)性,可以參與上皮細(xì)胞的生長(zhǎng),與上皮細(xì)胞存活直接相關(guān)[31]。在FD病情中,會(huì)出現(xiàn)腹部疼痛的癥狀,這與胃酸異常分泌損傷胃黏膜上皮細(xì)胞有關(guān),而胃黏膜具有抑制胃液中氫離子滲透的作用[32]。在PI3K-AKT信號(hào)通路上,通過(guò)生長(zhǎng)因子或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物激活PI3K,產(chǎn)生信使磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(Phosphatidyl-inositol,3,4,5 Triphosphate,PIP3),逐步使本通路的核心分子AKT被激活,進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游靶點(diǎn)在胃組織的表達(dá),促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞再生。與PI3K-AKT信號(hào)通路類似,FoxO信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮了較為重要的作用,FoxO在細(xì)胞質(zhì)中合成,后進(jìn)入細(xì)胞核中誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。近期有研究表明,FoxO信號(hào)通路與幽門螺桿菌所致的胃黏膜細(xì)胞凋亡有關(guān),具體作用機(jī)制可能是通過(guò)此通路對(duì)胃黏膜上的細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控[33]。

核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路雖未出現(xiàn)在所展示富集基因數(shù)更多的通路中,但是也具有很高的顯著性(P<0.01)。作為PI3K-AKT下游通路,通過(guò)TNF、IL等細(xì)胞因子激活后,可在細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)等方面發(fā)揮重要作用。目前有研究表明,NF-κB信號(hào)通路的激活與幽門螺桿菌感染的發(fā)生具有相關(guān)性,當(dāng)胃腸道感染幽門螺桿菌后,會(huì)損傷胃黏膜,嚴(yán)重者還會(huì)誘發(fā)癌癥的發(fā)生,通過(guò)分析關(guān)鍵靶點(diǎn)及其在通路的富集情況,推測(cè)機(jī)制可能通過(guò)調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor,EGF),IL-6進(jìn)而抑制幽門螺桿菌感染,減輕炎癥反應(yīng)。

在關(guān)于FD的靶點(diǎn)中,腦-腸軸一直被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵治療靶點(diǎn),其在人體代謝中也發(fā)揮著一定的作用,例如糖尿病以及肥胖的發(fā)生[34]。腦-腸神經(jīng)細(xì)胞受到來(lái)自中樞、腸道、自主神經(jīng)的調(diào)節(jié),通過(guò)釋放相關(guān)腦-腸肽(胃腸道激素)進(jìn)而維持其穩(wěn)定健康運(yùn)行,相關(guān)腦-腸肽激素水平的異常升高或者降低都是引發(fā)功能性消化不良的主要誘因之一[35-37]。從中醫(yī)角度來(lái)說(shuō),肝氣犯胃,引起腹痛、腹脹以及便秘等胃腸道相關(guān)的不良反應(yīng),相應(yīng)的治療方案即為行氣健脾開胃,證明中醫(yī)在很早就對(duì)腦-腸軸這一概念有所研究。本復(fù)方中的白術(shù)、枳實(shí)、木香的水提液均可以起到一定的行氣作用。從通路的角度來(lái)看,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路(Neurotrophin Signaling Pathway)是一類與神經(jīng)細(xì)胞分化和存活有關(guān)的營(yíng)養(yǎng)因子的通路,家族中包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve Growth Factor,NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Neurotrophin,NT)-3和NT-4。此通路可以連接多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián),包括MAPK通路、PI3K-AKT信號(hào)通路。FD患者可以通過(guò)激活此通路,將本來(lái)異常的腸神經(jīng)系統(tǒng)以腦-腸軸的作用機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié),降低腸道的高敏感性,使得神經(jīng)因子恢復(fù)為正常的狀態(tài)。與此同時(shí),抑制NF-κB信號(hào)通路,減少炎癥介質(zhì)的釋放,進(jìn)一步調(diào)節(jié)患者的心理因素,二者發(fā)揮協(xié)同作用達(dá)到神經(jīng)調(diào)節(jié)的效果[34]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明,香砂枳術(shù)丸可以顯著調(diào)節(jié)FD大鼠體內(nèi)IL-6、VIP以及5-HT的含量,顯示其可以通過(guò)影響NF-κB、NT等通路上的關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮藥效,也從一定程度上證明了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的可靠性,可為日后的深入藥效學(xué)研究提供研究思路。

值得注意的是,除了富集這些通路外,關(guān)鍵靶點(diǎn)還富集到癌癥通路。FD的其中一個(gè)重要病因即為幽門螺桿菌的感染,現(xiàn)已有研究表明,幽門螺桿菌是胃癌的重要啟動(dòng)子,與癌癥某些基因的表達(dá)有顯著相關(guān)性,并且是造成胃癌的重要原因之一[38]。癌癥通路的富集,推測(cè)此復(fù)方具有降低幽門螺桿菌誘發(fā)胃癌發(fā)病率的潛力。

綜上所述,本研究認(rèn)為,香砂枳術(shù)丸治療FD的作用機(jī)制主要在于PI3K-AKT信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、NT信號(hào)通路這4條通路,分別對(duì)體內(nèi)幽門螺桿菌導(dǎo)致感染、腦-腸軸紊亂以及內(nèi)臟高敏感性進(jìn)行調(diào)控,以達(dá)到治愈功能性消化不良的目的。

利益沖突聲明:無(wú)。