紫錐菊提取物菊苣酸對低氧環(huán)境下H9c2大鼠心肌細胞增殖的影響

武小慶,吳 華,陳鑫磊,沈 童,李金銘,王 碩,行倩文,劉 波,舒美玲,曾雨薇,張志軒

(青海大學 農(nóng)牧學院,青海 西寧810016)

菊苣酸(cichoric acid,CA)于1958年首次在菊苣葉中被發(fā)現(xiàn)[1]。CA是一種天然的酚類化合物,常見于菊苣、紫錐菊、蒲公英等植物中,具有抗病毒、抗氧化、抑制癌癥、緩解炎癥、調(diào)節(jié)糖脂代謝等功能[2]。丁輝等[3]研究表明CA能夠有效上調(diào)Nrf2介導的抗氧化信號通路。田新等[4]研究表明,CA可通過調(diào)控炎癥相關基因和通路的激活來降低促炎因子的表達水平,從而實現(xiàn)抗炎作用。PARK等[5]研究發(fā)現(xiàn)CA可以通過控制NK細胞活性進而改善機體免疫反應。有研究表明,低氧會損傷心肌細胞[6]。本試驗前期研究表明:CA能夠促進牦牛外周血單核細胞的增殖[7];能夠增強大鼠對低氧環(huán)境適應能力,且存在濃度差異[8]。然而,目前對低氧條件下CA對H9c2 大鼠心肌細胞增殖的影響尚未見報道,本試驗擬以H9c2 大鼠心肌細胞為研究對象,探究低氧條件下,CA對H9c2 大鼠心肌細胞增殖的影響,旨在為CA作為新型植物源低氧保護性飼料添加劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料H9c2 大鼠心肌細胞購自中國科學院上海細胞庫;CA購自西安銳博生物科技有限公司(CA含量4%:2.0%～2.2%CA,1.0%～1.5%咖啡酸,0.5%～1.0%綠原酸,0.3%～0.5%紫錐菊甙,黃綠色精細粉末)。

1.2 細胞的常規(guī)培養(yǎng)復蘇:將H9c2 大鼠心肌細胞從液氮中取出,迅速置于37℃水浴中,待凍存液體全部溶化后,加入含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液,混勻,1 000 r/min 室溫離心5 min;棄上清,加入1 mL 培養(yǎng)液,混勻,然后將細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,于飽和濕度、37℃、5% CO2中培養(yǎng)12 h 后,換液除去未貼壁細胞,以后每隔48 h 換液。傳代:當細胞生長密度達到約90%時,丟棄舊培養(yǎng)液,用PBS 輕緩洗滌細胞,再加入2 mL預熱的0.25%胰酶(含0.02% EDTA)進行消化;將培養(yǎng)瓶放至培養(yǎng)箱進行消化,以便使貼壁細胞盡快脫落,約5 min 后在顯微鏡下進行觀察,若細胞完全脫落時,立即加入3 mL 完全培養(yǎng)液終止消化,輕緩吹打細胞,使其全部懸浮(盡量成為單細胞狀態(tài));隨后1 000 r/min 離心5 min,棄上清,加入適量的完全培養(yǎng)液,吹打均勻后,按1∶4的比例鋪于新培養(yǎng)瓶,置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。凍存:擴大培養(yǎng)后,可將多余的細胞凍存?zhèn)溆谩⒓毎? mL預熱至37℃的胰酶消化后,1 200 r/min離心3 min,棄上清液,加入55%的培養(yǎng)基、40%的胎牛血清和5%的二甲基亞砜,分裝,4℃放置20 min,-20℃放置20 min,然后轉(zhuǎn)移至-80℃過夜,最后將細胞置于液氮中長期保存。

1.3 構(gòu)建H9c2 大鼠心肌細胞低氧模型H9c2 大鼠心肌細胞生長密度約60%時,將細胞分為常氧組和低氧組。將低氧組細胞置于細胞低氧培養(yǎng)裝置(O2=1%)中作低氧誘導24 h,常氧組細胞進行常規(guī)培養(yǎng)。據(jù)課題組前期篩選確定CA和紅景天苷的濃度,設常氧組、低氧組、低氧+CA組(60 mg/L CA)和低氧+紅景天苷組(100 μmol/L紅景天苷)。

1.4 流式細胞術檢測CA對H9c2 大鼠心肌細胞增殖的影響將 H9c2 大鼠心肌細胞以 1×106個/mL 的密度接種于 6 孔板中(每孔 1 mL),待細胞貼壁24 h后,對細胞進行誘導。用1 mL 37℃的胰酶消化細胞,離心并用預冷的PBS 離心沖洗2次,按試劑盒說明書用體積分數(shù)為70%的乙醇于4℃固定過夜,用預冷PBS離心清洗2次后加入染色液(PI∶RNase=1∶9)重懸,避光孵育30 min后用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.5 qRT-PCR檢測相關基因在mRNA水平的表達細胞培養(yǎng)和分組同1.2。TRIzol法提取總RNA,分別通過凝膠電泳和微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA樣品的完整性和濃度。引物見表1 。

表1 引物信息

1.6 Western blot檢測相關基因在蛋白水平的表達細胞培養(yǎng)和分組同1.2,1.3。提取細胞總蛋白通過BCA 法蛋白質(zhì)定量,而后進行SDS-PAGE 電泳,將分離好的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF(polyvinylidenefluo-ride)膜上, 37℃,封閉 1～2 h后,用PBST緩慢洗滌PVDF膜3 min,重復5次。將一抗按合適比例稀釋,4℃孵育過夜;從一抗中取出PVDF膜,PBST 緩慢洗滌10 min,重復5次后,回收一抗,繼續(xù)加入稀釋過的二抗,37℃孵育1 h后,回收二抗,PBST 緩慢洗滌30 min,重復3次。將ECL發(fā)光劑滴到PVDF膜上,暗室中靜置1～2 min,用 Bio-Rad 凝膠成像儀對 PVDF進行掃描成像,用Bio-Rad圖像分析軟件(QuantityOne)對所得條帶進行分析,記錄條帶相應的D值。

2 結(jié)果

2.1 CA對H9c2 大鼠心肌細胞增殖周期的影響由圖1可知,與常氧組相比,低氧組G0/G1期細胞數(shù)顯著增加(P<0.05),S期和G2/M期細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)。與低氧組相比,低氧+CA組G0/G1期細胞數(shù)顯著降低(P<0.05),G2/M期細胞數(shù)均顯著增加(P<0.05);低氧+紅景天苷組G0/G1期細胞數(shù)顯著降低(P<0.05),S期和G2/M期細胞數(shù)均顯著增加(P<0.05)。

同行數(shù)據(jù)肩標相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05),不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 CA對H9c2 大鼠心肌細胞增殖相關因子mRNA水平表達的影響圖2結(jié)果顯示,與常氧組相比,低氧組可極顯著下調(diào)周期蛋白T2(CCNT2)、周期蛋白依賴性激酶9(CDK9)和叉頭盒蛋白1(FOXP1)的mRNA表達(P<0.01)。與低氧組相比,低氧+CA組可顯著上調(diào)CCNT2的mRNA表達(P<0.01),極顯著上調(diào)CDK9和FOXP1的mRNA表達(P<0.01);低氧+紅景天苷可極顯著上調(diào)CCNT2、CDK9和FOXP1的mRNA表達(P<0.01)。

*.表示差異顯著,P<0.05;**.表示差異極顯著,P<0.01;無標注表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.3 CA對H9c2 大鼠心肌細胞增殖相關因子蛋白水平表達的影響由圖3可見,與常氧組相比,低氧組可極顯著下調(diào)CCNT2、CDK9和FOXP1的蛋白表達(P<0.01)。與低氧組相比,低氧+CA可顯著上調(diào)CDK9和FOXP1的蛋白表達(P<0.05);低氧+紅景天苷均可顯著上調(diào)CCNT2和CDK9的蛋白表達(P<0.05),極顯著上調(diào)FOXP1的蛋白表達(P<0.01)。

圖3 H9c2 大鼠心肌細胞增殖關鍵因子在蛋白水平的表達

3 討論

氧氣是動物賴以生存的基礎,當動物機體缺氧,代償能力不足時,易引起機體系統(tǒng)損傷,嚴重時會引起心臟、腦等重要臟器缺氧缺血性死亡[8]。于細胞而言,低氧會導致心肌細胞的不可逆損傷[9],影響其形態(tài)結(jié)構(gòu)和能量代謝等過程[10]。紅景天苷是紅景天主要的有效活性成分之一[11],是天然的抗氧化劑,能夠緩解高原反應,具有抗氧化應激、抗心肌細胞凋亡、調(diào)節(jié)細胞免疫功能等作用[11-14]。已有研究表明,紅景天苷可通過降低相關因子表達,增強心肌缺血再灌注損傷的大鼠心肌細胞增殖活性,拮抗細胞凋亡;其對心肌組織的保護效果極佳[15],故選取紅景天苷作為本試驗的陽性對照。CA作為一種免疫活性物質(zhì),具有抗炎、抗氧化、調(diào)控細胞生長等多種生理功能[4,16]。李依玲[17]研究證明,CA可以抑制由LPS引起的心肌細胞凋亡,緩解對心肌細胞的損害。孫曉麗等[18]研究表明,CA可以抑制胃癌細胞的增殖并刺激細胞凋亡,促進Caspase-3和PARP的降解。JIA等[19]研究表明,CA通過影響p38 MAPK、c-Jun和Akt的信號通路,進而對大鼠腦缺血再灌注損傷進行保護。WANG等[20]證實CA可增加細胞活性,促進高原低氧環(huán)境下牦牛PBMC細胞增殖,抑制細胞凋亡,也就是說CA對細胞具有較好的低氧保護性。

細胞增殖是動物機體生存所必需的重要生理過程,而調(diào)控細胞周期進程對細胞增殖、凋亡及維持動物機體正常生長發(fā)育均有重要意義[21]。細胞增殖周期可分為間期和分裂期兩個周期,其中細胞分裂間期又分為G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)和G2期(DNA合成后期),其活動中心是進行DNA分子復制有關的各項活動。M期細胞進行有絲分裂。整個細胞周期被劃分為G1-S-M-G2-G1期,其特點是S期DNA含量介于G1、G2期之間,增加至兩倍量。M期與S期之間存在G1期,老化細胞較生長旺盛細胞的G1期長[22],而G0期的細胞停止分裂,但是仍具有分裂的能力。本試驗結(jié)果顯示,與常氧組相比,低氧組G0/G1期細胞數(shù)顯著增加,S期和G2/M期細胞數(shù)顯著降低。與低氧組相比,低氧+CA組和低氧+紅景天苷組G0/G1期細胞數(shù)顯著降低,G2/M期細胞數(shù)均顯著增加。研究表明,低氧會導致細胞停滯在G0/G1期,增加G0/G1期細胞數(shù),減少S期和G2/M期細胞數(shù),從而抑制細胞DNA合成,進而抑制細胞增殖。添加CA或紅景天苷后,可通過降低G0/G1期細胞數(shù),增加G2/M期細胞數(shù),緩解低氧造成的細胞周期阻滯促進細胞周期進程,進而促進H9c2 大鼠心肌細胞增殖。

CCNT2是一種蛋白質(zhì)編碼基因,其可以識別并結(jié)合特定的CDK表現(xiàn)該CDK激酶的活性[23],在許多疾病中通過調(diào)控細胞周期進展發(fā)揮作用[24]。KE等[25]研究表明,下調(diào)CCNT2在哺乳動物細胞中的表達,能停滯G0/G1期細胞周期,進而抑制細胞增殖。CDK9編碼蛋白CDK族的成員,是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可通過激活相關酶,促進轉(zhuǎn)錄并調(diào)控周期進程[26]。有研究發(fā)現(xiàn),抑制CDK9的表達會抑制心肌細胞增殖[27]。FOXP1是叉頭盒(FOX)轉(zhuǎn)錄因子家族P亞科的一種,在調(diào)控衰老、細胞增殖分化及細胞周期進展等多種生物學過程中均具有重要意義[28]。本試驗結(jié)果顯示,與常氧組相比,低氧組極顯著下調(diào)CCNT2、CDK9和FOXP1的表達,與低氧組相比,低氧+CA組和低氧+紅景天苷組均可上調(diào)CCNT2、CDK9和FOXP1的表達。研究表明,低氧會通過下調(diào)CCNT2、CDK9和FOXP1的表達,進而停滯G0/G1期細胞周期,增加G0/G1期細胞數(shù),減少S期和G2/M期細胞數(shù),進而抑制細胞增殖。添加CA或紅景天苷后可通過上調(diào) H9c2 大鼠心肌細胞增殖相關因子CCNT2、CDK9和FOXP1的表達,進而可有效緩解低氧誘導的細胞周期阻滯現(xiàn)象,促進細胞周期進程,進而促進低氧誘導的 H9c2 大鼠心肌細胞的增殖。

CA可通過促進增殖相關因子CCNT2、CDK9、FOXP1的表達緩解低氧誘導的H9c2 大鼠心肌細胞周期阻滯現(xiàn)象,減少G0/G1期細胞數(shù),增加S期和G2/M期細胞數(shù),進而促進H9c2 大鼠心肌細胞增殖,為CA作為低氧保護劑和畜牧業(yè)新型植物源低氧保護性飼料添加劑的開發(fā)利用提供理論參考。