祛瘀清熱方對尿酸鈉誘導的痛風性關節(jié)炎大鼠NLRP6/Caspase-1/IL-1β信號通路的影響

鐘秋生，楊巧玉，邵潔琦，黃歡歡，陳博，王昱

東莞市松山湖中心醫(yī)院，廣東 東莞 523326

痛風性關節(jié)炎（GA）是一種異質性疾病，通常伴有尿酸鈉結晶體的沉積，其沉積部位多位于關節(jié)及其周圍處。流行病學表明，GA 的發(fā)病率高，隨著社會經濟的發(fā)展，本病呈現出明顯的上升勢頭，GA 可累及多個臟器，對人類的健康構成嚴重威脅。GA 的發(fā)病機制與炎癥反應密切相關。炎性細胞因子直接或間接參與GA 的炎癥反應，炎癥因子的釋放受到多種相關信號通路的調節(jié)，免疫細胞也參與調控。NLRP6 是一種新的NLR 家族成員，在不同的細胞類型中，發(fā)揮不同的角色，并參與多個信號通路的調控，如核因子-κB（NF-κB）和MAPK 信號等的轉導。本研究團隊應用祛瘀清熱方治療GA，取得較好的臨床療效，研究發(fā)現，其可明顯降低血尿酸水平、中醫(yī)證候積分和炎性反應指標如C-反應蛋白、血沉[1]。本研究擬通過動物實驗，觀察祛瘀清熱方對尿酸鈉誘導的GA 大鼠踝關節(jié)腫脹度影響、血清白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的變化，探討祛瘀清熱方對NLRP6/Caspase-1/IL-1β 信號通路的調控作用。

1 材料

1.1 動物選取雄性大鼠，SPF 級SD，60 只，體質量180～200 g，全部從南方醫(yī)科大學購買，大鼠隨機分空白組、模型組、秋水仙堿組、祛瘀清熱高劑量組、祛瘀清熱中劑量組和祛瘀清熱低劑量組，共6 組，每組各10 只。

1.2 藥物祛瘀清熱方處方：當歸、澤蘭、桃仁、澤瀉、地龍各10 g，益母草、白茅根、車前子、秦艽各15 g，薏苡仁20 g。生藥由東莞市松山湖中心醫(yī)院中藥房提供，并協(xié)助煎煮，100 ℃水浴，濃縮至200%，相當于生藥2 g/mL，4 ℃保存，備用。秋水仙堿0.5 mg×20 片/盒，由云南植物藥業(yè)有限公司（國藥準字H53020166）提供，切磨成粉狀，保存，備用。應用方法：造模后60 min，開始給藥。秋水仙堿組：秋水仙堿9 mg/kg，每天1 次，灌胃，連續(xù)7 d；祛瘀清熱方高、中、低劑量治療組：分別給予祛瘀清熱方100 mg/kg、50 mg/kg、20 mg/kg，灌胃，連續(xù)7 d；空白組和模型組：每組大鼠予等容量蒸餾水灌胃，連續(xù)7 d。各組大鼠，均每天上午9 時灌胃，每天1 次。

1.3 試劑IL-1β、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號均為202104。NLRP6、Caspase-1 Western Blot 購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.4 儀器電子天平、雙目顯微鏡、石蠟切片機、雙重純水蒸餾器、不銹鋼水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、醫(yī)用微波爐和顯微攝像系統(tǒng)。

2 方法

2.1 分組與造模60 只SD 大鼠，隨機分為6 組，每組10 只。造模方法，采用黨榮敏等[2]尿酸鈉溶液注射關節(jié)腔內的方法。

2.2 觀察指標及監(jiān)測方法觀察大鼠關節(jié)的腫脹度：選取大鼠踝關節(jié)，測其周長、腫脹度，監(jiān)測時間分別為造模前1 h、造模后1 d、2 d 和1 周。

2.3 病理組織形態(tài)觀察取滑膜組織，固定，脫水，石蠟包埋處理，放在干凈載玻片上，在恒溫箱中孵化，脫蠟后，染色，流水沖洗，乙醇分化，蒸餾水沖洗，伊紅染色，二甲苯透明，封固，觀察滑膜的病理情況。

2.4 血清中IL-1β、TNF-α 測定檢測血清中的細胞因子TNF-α、IL-1β 選股動脈，采血，在真空采血管中，血靜置0.5 h 后，離心15 min，血清采集，保存。

2.5 Western Blot 檢測滑膜組織NLRP6、Caspase-1表達水平試劑批號為380625，選取組織樣本100 mg，剪碎后，加用裂解液勻漿，進行充分的裂解，使用BCA 法，行蛋白的定量，計算上樣量，電泳及電轉化，恒流200 mA，1 h，在5%脫脂奶粉溶液中，進行PVDF 膜置，封閉，在室溫下1 h，TBST洗膜，抗稀釋液4 ℃，孵育，過1 夜，第2 天，TBST 10 min，洗3 次，置二抗稀釋液4 ℃中，孵育1 h，后進行TBST 10 min，洗3 次，行顯影，應用ECL 液行發(fā)光與條帶分析。

2.6 統(tǒng)計學方法數據符合正態(tài)分布和方差齊性，使用SPSS22.0 統(tǒng)計學軟件分析，測量數據以均數±標準差（±s）表示計量資料，以單因素方差分析，進行指標計量資料比較，以LSD-t檢驗行組間兩兩比較，取P＜0.05 作為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠受試踝關節(jié)腫脹度比較見表1。與正常組比較，其余各組造模之后，在不同時間點上，受試大鼠踝關節(jié)腫脹度有增加（P＜0.05）。與模型組比較，祛瘀清熱方低、中、高劑量組及秋水仙堿組大鼠，在造模后各時間節(jié)點，大鼠踝關節(jié)腫脹度降低（P＜0.05）。與秋水仙堿組比較，祛瘀清熱方低、中、高劑量組受試大鼠，在造模后各時間節(jié)點，大鼠踝關節(jié)腫脹度增加（P＜0.05）。

表1 各組大鼠受試踝關節(jié)腫脹度比較（±s）cm

表1 各組大鼠受試踝關節(jié)腫脹度比較（±s）cm

注：①與正常組同時間點比較，P＜0.05；②與模型組同時間點比較，P＜0.05；③與秋水仙堿組同時間點比較，P＜0.05

造模后168h 0.030±0.002 0.302±0.039①0.114±0.039①②0.211±0.051①②③0.196±0.038①②③0.139±0.058①②③組 別正常組模型組秋水仙堿組祛瘀清熱方低劑量組祛瘀清熱方中劑量組祛瘀清熱方高劑量組鼠數10 10 10 10 10 10造模前1h 0.031±0.002 0.131±0.036①0.065±0.026①②0.122±0.025①②③0.111±0.041①②③0.093±0.036①②③造模后24h 0.030±0.007 0.335±0.041①0.143±0.036①②0.215±0.039①②③0.198±0.056①②③0.162±0.063①②③造模后48h 0.029±0.005 0.318±0.040①0.162±0.043①②0.255±0.046①②③0.241±0.063①②③0.186±0.062①②③

3.2 各組大鼠血清中IL-1β 及TNF-α 含量比較見表2。模型組中大鼠血清IL-1β、TNF-α 水平較正常組上升（P＜0.05）。與模型組比較，在祛瘀清熱方低、中、高3 個劑量組及秋水仙堿組中，大鼠血清IL-1β、TNF-α 的水平降低（P＜0.05）。與秋水仙堿組比較，祛瘀清熱方低、中、高劑量組IL-1β、TNF-α 水平增加（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清中IL-1β 及TNF-α 含量比較（±s）pg/mL

表2 各組大鼠血清中IL-1β 及TNF-α 含量比較（±s）pg/mL

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05；③與秋水仙堿組比較，P＜0.05

TNF-α 41.35±4.92 162.3±8.96①69.86±4.68①②145.93±8.68①②③104.15±6.81①②③84.53±7.59①②③組 別正常組模型組秋水仙堿組祛瘀清熱低劑量組祛瘀清熱中劑量組祛瘀清熱高劑量組鼠數10 10 10 10 10 10 IL-1β 52.48±5.75 132.95±9.56①62.80±7.58①②126.32±7.89①②③101.12±6.31①②③88.21±6.35①②③

3.3 各組大鼠滑膜組織中NLRP6、Caspase-1 含量比較見圖1、見表3。與正常組比較，模型組及祛瘀清熱中、高劑量組滑膜組織NLRP6 蛋白表達下調（P＜0.05），模型組Caspase-1 蛋白表達上調（P＜0.05）。與模型組比較，祛瘀清熱高劑量組滑膜組織NLRP6 蛋白表達上調（P＜0.05），Caspase-1 蛋白表達下調（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠踝關節(jié)組織NLRP6、Caspase-1相關蛋白表達電泳圖

表3 各組大鼠滑膜組織中NLRP6、Caspase-1 含量比較（±s）

表3 各組大鼠滑膜組織中NLRP6、Caspase-1 含量比較（±s）

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

Caspase-1 0.92±0.06 1.08±0.07①0.94±0.08 0.93±0.05 0.91±0.06 0.78±0.04②組 別正常組模型組秋水仙堿組祛瘀清熱低劑量組祛瘀清熱中劑量組祛瘀清熱高劑量組鼠數10 10 10 10 10 10 NLRP6 1.00±0.09 0.82±0.05①0.90±0.07 0.86±0.06 0.89±0.08①0.99±0.09①②

4 討論

中醫(yī)藥治療GA，頗具特色，有用單一的中藥治療，有予中藥提取物治療，其治療GA 有多成分、多通道、多靶點的作用特點[3-4]，已取得了一系列成果，如青藤堿能有效降低GA 大鼠滑膜中TNF-α、IL-1β 水平，抑制炎性細胞因子，從而對GA 起到治療作用[4]?！吨嗅t(yī)病證診斷療效標準》明確將GA 證型分為4 型，并就相應證型提出了詳盡治療原則和方藥[5]。一般認為，臨床常見的GA 證型，多為濕熱蘊結與瘀熱阻滯，故祛瘀清熱法成為GA 的常用治法之一。研究團隊成員曾較系統(tǒng)應用祛瘀清熱湯治療GA，取得較好的療效[6]。

諸多國外指南指出，快速緩解患者關節(jié)疼痛，控制關節(jié)炎，是GA 急性期發(fā)作治療的主要目標，或選非甾體抗炎藥，或用激素，或口服秋水仙堿，旨在快速抗炎鎮(zhèn)痛，說明GA 致病機制與炎癥反應有較高程度的相關性，GA 致病特點通常有以下幾點，一是嘌呤代謝或排泄障礙，二是血尿酸異常升高，三是關節(jié)或其周圍可析出尿酸鈉結晶，四是誘導關節(jié)炎癥，出現關節(jié)紅腫熱痛癥狀。上述過程中，在多種相關信號通路的調控下，免疫細胞參與調節(jié)[7-8]?？梢?，在GA 的發(fā)病機制中，部分炎性因子起著重要作用，NLRP6 是NLR 家族的一員，具有調節(jié)炎癥的功能。NLRP6 參與NF-κB 的轉導[9]。NLRP6 在不同細胞中，取決于不同的途徑激活。如NLRP6 可與Caspase-1 寡聚化結合，從而成為NLRP6 炎癥小體，有助于組織的修復，同時抑制病理性增殖，參與機體免疫應答[10-11]。NLRP6 受體蛋白，可以被外源或內源性信號水解，這個過程中，經過Caspase-1 的參與，分泌IL-1β 等炎性因子，導致炎癥的發(fā)生或細胞壞死[12]。在一些情況下，NLRP6 存在時，可抑制NF-κB 信號通路的活化，抑制炎性反應，起到分子開關功效[13]。故本研究應用中，把NLRP6 作為祛瘀清熱方治療GA 的觀測指標。轉錄因子NF-κB，在調節(jié)應激與免疫反應中，在細胞的凋亡和分化過程中，發(fā)揮了重要作用。NF-κB 可被多種刺激激活，從而導致諸多轉錄程序[14]。依賴NF-κB 的轉錄，不但受到某些調控機制的控制，而且與其他信號通路關系，也有極為密切的關聯(lián)[15]。在這種多樣而復雜的關系中，NF-κB 成為某些特定的細胞反應的關鍵分子[16]，NF-κB 有著多種生物學功能。TNF-α主要由中性粒細胞和單核巨噬細胞產生，其在尿酸鈉晶體性關節(jié)炎過程中，具有重要地位，表達升高，可導致炎性因子水平升高，促使其他炎性介質釋放。有研究表明，尿酸鈉結晶可以直接或間接誘導，促使滑膜細胞釋放一些炎性介質，激活NF-κB因子，啟動和調節(jié)炎性介質的表達[17-18]。本實驗顯示，模型組血IL-1β、TNF-α 上升，滑膜組織NLRP6表達下調，Caspase-1 表達上調。

祛瘀清熱方由當歸、桃仁、澤蘭、地龍、澤瀉、秦艽、車前子、薏苡仁等組成，方中地龍、桃仁、當歸、澤蘭，活血散瘀，通絡止痛，是為君藥。臣以澤瀉、秦艽、車前子、薏苡仁，清熱除濕，健脾祛濕。佐以益母草，祛瘀生新，活血利水，白茅根清熱養(yǎng)陰，且益母草、白茅根兩藥，氣血雙調，涼血止痛，清熱散瘀，活血利水，消腫且不傷陰。全方共奏祛瘀清熱、涼血消腫之功。本課題組人員多年前就已對GA 具有一定程度的研究[19-21]，本研究結果提示，祛瘀清熱方對尿酸鈉誘導的GA 大鼠，具有較好的消腫鎮(zhèn)痛作用，其作用機制可能與兩方面有關，一是降低大鼠血清中IL-1β、TNF-α 含量，二是升高大鼠滑膜組織NLRP6 蛋白表達和下調大鼠滑膜組織Caspase-1 蛋白表達。

本研究目的，旨在利用NLRP6/Caspase-1/IL-1β信號通路及TNF-α 相關炎癥因子的研究，為臨床GA 治療提供新的實驗依據，然而，GA 的發(fā)生與多因素密切關聯(lián)，本項研究僅關注信號通路、相關炎癥因子，未來可在GA 相關的年齡、性別、環(huán)境、遺傳和高嘌呤飲食等方面進一步探討。