支氣管肺泡灌洗液結(jié)核分子生物學(xué)檢測與外周血T 細(xì)胞斑點試驗對痰涂片陰性肺結(jié)核患者的診斷價值

張 艷 王 華 侯 婧 王 慶

1.安徽省胸科醫(yī)院結(jié)核三科，安徽合肥 230022；2.安徽省胸科醫(yī)院結(jié)核八科，安徽合肥 230022

肺結(jié)核（pulmonary tuberculosis，PTB）目前仍是威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題，根據(jù)世界衛(wèi)生組織報告數(shù)據(jù)顯示，2020 年全球新增約987 萬例PTB患者，發(fā)病率為127/10 萬，與2018 年的59.27/10 萬及2019年的55.55/10 萬比較，仍呈明顯上升趨勢[1-2]。造成我國PTB 發(fā)病率居高的主要原因有以下兩點：一方面，PTB 患者早期缺乏典型的臨床癥狀及體征，臨床診斷率相對較低、缺乏診斷效能高的診斷方法，延誤患者的診斷和治療；另一方面，作為診斷PTB 金標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)需要周期長，難以滿足早期PTB 的診療需要，從而引起PTB 社區(qū)傳播的概率增加[3-4]。因此，如何在早期快速確診PTB 對其防控具有十分重要的意義。因目前臨床中痰涂片陰性PTB 患者的早期診斷缺乏病原學(xué)依據(jù)，僅根據(jù)患者癥狀、體征及胸部CT、結(jié)核菌素試驗、血結(jié)核抗體等進行診斷有局限性。隨著實驗室檢查技術(shù)的發(fā)展，經(jīng)氣管鏡取局部支氣管肺泡灌洗液行結(jié)核分子生物學(xué)檢測結(jié)合免疫學(xué)的T 細(xì)胞斑點試驗可以在一定程度上提高PTB 的診斷率，因此本研究分析通過支氣管肺泡灌洗液結(jié)核?。╰uberculosis，TB）-DNA、TB-RNA、Xpert MTB/RIF 檢測及外周血T 細(xì)胞斑點試驗在痰涂片陰性PTB 中的臨床診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020 年1 月至2021 年4 月在安徽省胸科醫(yī)院（以下簡稱“我院”）住院的疑似PTB 患者198例，年齡14～81 歲，平均（40.7±18.4）歲；男137例，女61例?；颊哂械蜔?、盜汗、乏力、咳嗽、咯血等癥狀或無明顯臨床癥狀，但體檢經(jīng)影像學(xué)檢查提示有PTB 可能。納入標(biāo)準(zhǔn)：①胸部CT 和臨床癥狀疑似PTB；②痰涂片陰性；③認(rèn)知正常，能配合完成相關(guān)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：①拒絕支氣管鏡檢查或合并有支氣管檢查禁忌證；②合并有心臟、肝臟、腎臟等重要臟器嚴(yán)重功能障礙；③人類免疫缺陷病毒感染、免疫功能嚴(yán)重低下等。

1.2 研究方法

以中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)肺結(jié)核診斷（WS 288—2017）[5]為金標(biāo)準(zhǔn)：①呼吸道分泌物病原學(xué)陽性，包括細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)。②病理學(xué)陽性。③免疫學(xué)檢查陽性。④PTB 可疑癥狀、體征。⑤影像學(xué)檢查符合PTB 改變。臨床診斷需符合⑤及至少合并有①②③④項中任意一項（其中非病原學(xué)與病理學(xué)診斷病例需專家會診確定）。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過（K2021-018）。對入選患者進行常規(guī)檢測后行支氣管鏡檢查，根據(jù)胸部CT 提示肺部病灶位置取局部支氣管肺泡灌洗液，進行TB-DNA、TB-RNA、Xpert MTB/RIF 檢測及外周血T 細(xì)胞斑點試驗。

1.2.1 TB-DNA 檢測設(shè)備由迪澳公司提供的核酸擴增熒光檢測儀（Deaou-16P），試劑采用廣州迪澳生物科技公司的結(jié)核分枝桿菌核酸擴增熒光制劑（Deaou-1016）。結(jié)果判別：樣本檢測時Tt≤45 判定為陽性，無Tt 時判定為陰性，Tt 為熒光強度變化函數(shù)的二階導(dǎo)數(shù)＞0 且首次出現(xiàn)熒光強度≥閾值，該采集點對應(yīng)的為閾值時間。

1.2.2 TB-RNA 檢測設(shè)備采用瑞士生產(chǎn)的羅氏熒光定量PCR 檢測儀（LightCycler 480 Ⅱ），試劑由上海仁度生物科技公司提供的結(jié)核分枝桿菌核酸擴增熒光制劑（RNA03）。結(jié)果判別：Dt≤35 判定為陽性；35＜Dt＜40 的樣本建議重新檢測；Dt＜40 判定陽性；Dt 無數(shù)值或等于40 時結(jié)果判為陰性。Dt 為陽性判定值，指樣本曲線與閾值交點的橫坐標(biāo)讀數(shù)。

1.2.3 Xpert MTB/RIF 檢測 Xpert MTB/RIF 檢測是結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)，檢測系統(tǒng)采用美國Cepheid 公司生產(chǎn)的Xpert MTB/RIF 檢測儀（16 模塊）；試劑是由賽沛公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌rpoB 基因突變檢測試劑（GXMTB/RIF-CN-50）。支氣管肺泡灌洗液樣品以2∶1的比例加入樣品處理試劑，振搖10～20 次，室溫靜置15 min，待樣本液化完全后，用無菌移液管取出2 ml緩慢加入檢測匣中，然后使用檢測系統(tǒng)進行檢測。約2 h 后儀器自動判讀結(jié)果高、中、低、非常低及陰性結(jié)果。Ct 值與結(jié)核分枝桿菌載量的對應(yīng)關(guān)系如下，Ct值＜16 為高；16≤Ct 值＜22 為中；22≤Ct 值≤28 為低；Ct 值＞28 為極低，檢測到rpoB 基因突變報告為利福平耐藥，未檢測到rpoB 基因報告利福平耐藥陰性。未檢測到結(jié)核分枝桿菌目標(biāo)DNA 為陰性。

1.2.4 外周血T 細(xì)胞斑點試驗 采用SPOT.TB 酶聯(lián)免疫熒光斑點分析儀（AID ELISPOT Reader）（德國AID公司），試劑盒（英國Oxford Immunotec Ltd 公司，130100594），嚴(yán)格按照儀器及產(chǎn)品說明書操作。結(jié)果判斷[6]：①陰性對照孔斑點數(shù)＜6 個時，抗原A 孔或抗原B 孔的斑點數(shù)-陰性對照孔斑點數(shù)≥6 個；②陰性對照孔斑點數(shù)≥6 個時，抗原A 孔或抗原B 孔的斑點數(shù)≥2×陰性對照孔斑點數(shù)。滿足以上任意一條為陽性，否則為陰性。

1.2.5 聯(lián)合診斷 支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 檢測與外周血T 細(xì)胞斑點試驗聯(lián)合判定：任意一項陽性判定為陽性，兩項均陰性判定為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，采用Kappa 系數(shù)分析一致性，Kappa 值為＜0.40、0.40～0.75、＞0.75 的情況下分別代表為一致性較差、一般、較好。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同診斷方法與金標(biāo)準(zhǔn)對痰涂片陰性患者PTB診斷的一致性檢驗

198 例患者中確診PTB 者153 例，支氣管肺泡灌洗液TB-DNA、支氣管肺泡灌洗液TB-RNA、支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 檢測、外周血T 細(xì)胞斑點試驗及支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 檢測聯(lián)合外周血T細(xì)胞斑點試驗檢查與金標(biāo)準(zhǔn)具有一定的一致性（Kappa=0.512、0.449、0.327、0.373、0.793，P ＜0.001）。見 表1～5。

表1 支氣管肺泡灌洗液TB-DNA 與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性比較（例）

表2 支氣管肺泡灌洗液TB-RNA 法與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性比較（例）

表3 支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 檢測與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性比較（例）

表4 外周血T 細(xì)胞斑點試驗診斷與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性比較（例）

表5 支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 檢測聯(lián)合外周血T 細(xì)胞斑點試驗與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性比較（例）

2.2 不同檢測方法對痰涂片陰性患者PTB 的臨床診斷價值

痰涂片陰性PTB 患者支氣管肺泡灌洗液TB-DNA、TB-RNA、Xpert MTB/RIF 檢測及外周血T細(xì)胞斑點試驗的診斷效能見表6。

表6 不同檢測方法對痰涂片陰性患者PTB 的臨床診斷價值（%）

3 討論

在臨床就診的疑似PTB 患者多數(shù)痰涂片結(jié)果為陰性，由于這部分患者臨床表現(xiàn)不一、病情輕重各異，甚至部分患者系體檢發(fā)現(xiàn)，肺部影像學(xué)檢查呈多樣性而缺乏特異性改變，從而給PTB 快速診斷造成一定難度[7-9]。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)作為診斷TB 的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法一般需4～6 周后才獲得檢測結(jié)果，不利早期診斷[10]。痰涂片檢查簡單、經(jīng)濟、快速，當(dāng)天檢測結(jié)果即可獲得，但靈敏度偏低（22%～82%），假陰性報告率為17.6%～78.0%，且不能檢出耐藥性[11]，這可能導(dǎo)致部分PTB 患者無法在第一時間得到精準(zhǔn)治療，延誤病情。但結(jié)核病的病原學(xué)檢查仍是發(fā)現(xiàn)PTB傳染源的主要檢測方法，并為TB 確診和治療提供重要依據(jù)[12-13]。由于結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)大多處于潛伏感染狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，結(jié)核分枝桿菌可能會在激活前持續(xù)潛伏多年，感染和激活之間的時間間隔未知，因此很難追蹤感染來源，導(dǎo)致疾病傳播情況很難推斷[14-15]。近些年來，結(jié)核分子生物學(xué)及免疫學(xué)檢查的推廣普及可將TB 的診斷從數(shù)周的時間降低到數(shù)天甚至數(shù)小時，臨床比較常見的結(jié)核分枝桿菌分子生物學(xué)及免疫學(xué)檢查為TB-DNA、TB-RNA、Xpert MTB/RIF、T 細(xì)胞斑點試驗等。

TB-DNA 檢測是一種實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)法檢測技術(shù)，此方法通過PCR 檢測結(jié)核分枝桿菌DNA。除活菌DNA 外，即使是死菌DNA 在體內(nèi)也可以存在很長時間[16-18]，可通過PCR 檢測出，故對初治PTB 的敏感性較高，已有曹翌明等[19]研究提示TB-DNA 檢測與分枝桿菌培養(yǎng)的結(jié)果完全一致。TB-RNA 檢測是以結(jié)核分枝桿菌RNA 為擴增靶向起點，產(chǎn)物RNA 為檢測靶標(biāo)，由于RNA 只存在于活的結(jié)核分枝桿菌中，結(jié)核分枝桿菌死亡后菌內(nèi)RNA 就會很快被降解，故在臨床TB-RNA 檢測可以用于活動性PTB 的診斷及治療效果評估。且TB-RNA 方法快速、簡單，操作過程中交叉污染少[20]。在本研究中，支氣管肺泡灌洗液TB-DNA 與TB-RNA 檢測靈敏度較低，可能與樣本量較小有關(guān)。

Xpert MTB/RIF 檢測在本研究中的靈敏度一般，特異度較好，該技術(shù)是一種集樣本自動制備、DNA 提取、定量PCR 擴增、結(jié)核分枝桿菌特異性核酸檢測及利福平耐藥基因rpo 突變等于一體的快速診斷TB 的方法，同時操作步驟簡單，密閉環(huán)境檢測除可避免實驗室人員操作水平及樣本結(jié)核分枝桿菌菌量少等因素造成的影響外，還可同時檢出非結(jié)核分枝桿菌的特異度也較高，在一定程度上可提高痰涂片陰性PTB患者的診斷水平[21-23]。此外，劉揚等[24]研究證實，Xpert MTB/RIF 技術(shù)應(yīng)用后TB 的確診率高于傳統(tǒng)的診斷方法，并且可以更早、更好地檢測患者是否存在利福平耐藥，對PTB 治療有一定指導(dǎo)作用。

T 細(xì)胞斑點試驗是運用特異性抗原ESAT-6 及CFP 10，采用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)平臺檢測患者機體內(nèi)是否有針對結(jié)核分枝桿菌反應(yīng)的效應(yīng)T 細(xì)胞，由此診斷該患者是否存在結(jié)核分枝桿菌感染[25-26]。T 細(xì)胞斑點試驗不僅靈敏度和特異性較高[27-29]，而且送檢時間短，且基本不受機體免疫狀況的影響[25]。T 細(xì)胞斑點試驗除靈敏度較高、標(biāo)本易獲得外，其不受非結(jié)核分枝桿菌及其他細(xì)菌感染影響，可作為是否有結(jié)核感染的鑒別診斷方法，但由于此法不能區(qū)分TB 是活動性或潛伏性，臨床存在一定的假陰性[25]。本研究結(jié)果提示其不能完全替代病原學(xué)檢測診斷PTB，但本研究中將外周血T 細(xì)胞斑點試驗與支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF 檢測進行聯(lián)合診斷，其靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均較好，與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性較好，提示聯(lián)合診斷方法真實有效，具有很好的可靠性。

綜上所述，每一項檢測方法都具有各自的優(yōu)勢和缺點。其中運用經(jīng)支氣管鏡進行局部肺泡灌洗液送檢Xpert MTB/RIF 聯(lián)合外周血T 細(xì)胞斑點試驗在痰涂片陰性PTB 診斷中具有重要的臨床價值。