叉頭框蛋白P3 陽(yáng)性調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和程序性死亡受體1/ 程序性死亡受體配體1 通路在早期胃癌中的表達(dá)及相關(guān)性分析

秦玉翠 夏 蕓

1.南京市浦口區(qū)中醫(yī)院健康管理中心，江蘇南京 211800；2.南京市浦口區(qū)中醫(yī)院脾胃科，江蘇南京 211800

胃癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1-2]，一般的早期胃癌患者無(wú)明顯癥狀，而當(dāng)患者出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)多為進(jìn)展期胃癌，其惡性程度較高，且往往伴有轉(zhuǎn)移傾向。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）是一類(lèi)控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T 細(xì)胞亞群[3]，也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。叉頭框蛋白P3（forkhead box protein P3，F(xiàn)OXP3）是目前檢測(cè)Tregs 表達(dá)及功能的精準(zhǔn)分子之一，在免疫抑制方面起重要作用[4]。有研究顯示，在胃癌患者外周血中Tregs 數(shù)目顯著增加[5]，提示靶向Tregs 可能是未來(lái)治療胃癌的新策略[6]。程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）是一種抑制免疫應(yīng)答激活的關(guān)鍵分子。PD-1 與其配體（programmed death-ligand 1，PD-L1）相互作用能夠?qū)е录せ畹腡細(xì)胞發(fā)生凋亡從而發(fā)揮自生免疫抑制效應(yīng)[7]。PD-1 在卵巢癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)[8-10]。目前，PD-1/PD-L1與FOXP3+Tregs 在早期胃癌組織中的表達(dá)情況尚少見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究主要針對(duì)PD-1/PD-L1 與FOXP3+Tregs 在早期胃癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行考察，為臨床胃癌的早期診斷和抗腫瘤免疫治療策略提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020 年10 月至2022 年6 月南京市浦口區(qū)中醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）收治的胃癌初治患者10例為早期胃癌組，均無(wú)自身免疫性疾病和任何抗癌治療史，所有納入患者均經(jīng)病史、臨床特征、胃鏡檢查和組織病理學(xué)檢查確診為早期胃癌。另選取我院10 例慢性胃炎患者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床、病理等相關(guān)資料完整；②病理檢查證實(shí)為早期胃癌或慢性胃炎。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前曾接受過(guò)化學(xué)藥物治療；②術(shù)后病理證實(shí)為多灶性病變；③殘胃癌。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20220082）。

1.2 主要試劑與儀器

FOXP3 抗體購(gòu)自Invitrogen 公司（貨號(hào)：13-4776-82）；PD-1 抗體購(gòu)自CellSignalingTechnology 公司（貨號(hào)：86163）；PD-L1 抗體均購(gòu)自abcam 生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：ab279292）；熒光二抗均購(gòu)自Proteintech 生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：SA00003-11、SA00009-2、SA00007-1）；病理切片機(jī)購(gòu)自徠卡公司（型號(hào)：LeiCA RM2016）；熒光全掃儀購(gòu)自匈牙利3DHISTECH Lt 公司（型號(hào)：Pannoramic MIDI）。

1.3 組織免疫熒光染色

采用4%的多聚甲醛對(duì)樣本進(jìn)行固定，兩組胃黏膜組織經(jīng)石蠟包埋后切片，將石蠟切片置于68℃的烘箱中加熱20 min；脫蠟脫水：二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，3%H2O2，37℃孵育10 min，蒸餾水沖洗3 次?？乖迯?fù)：將切片置于含EDTA 的抗原修復(fù)緩沖液中于微波爐內(nèi)，中火加熱8 min 后冷卻8 min，再次中低火加熱7 min，冷卻后置于PBS 中洗滌3 次。封閉：滴加3%的BSA 孵育30 min；滴加適量一抗（稀釋倍數(shù)：FOXP3 為1∶150；PD-1 為1∶250 稀釋?zhuān)籔D-L1 為1∶200）于濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜；滴加適量二抗（稀釋倍數(shù)：1∶200），室溫避光孵育50 min；DAPI 染核：滴加適量DAPI 溶液，室溫孵育10 min；將玻片用抗熒光淬滅封片劑封片，4℃避光保存待測(cè)或直接上機(jī)檢測(cè)。

1.4 組織免疫熒光染色結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)胞漿、細(xì)胞核和/或細(xì)胞膜出現(xiàn)綠色（FOXP3+Tregs）/粉色（PD-1）/紅色（PD-L1）即判定為陽(yáng)性。采用PANNORAMIC 全景切片掃描儀對(duì)切片進(jìn)行拍攝，通過(guò)CaseViewer 2.4 軟件，在100～400 任意倍數(shù)下進(jìn)行觀察，通過(guò)計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)面積與組織面積的占比得出FOXP3+Tregs、PD-1 和PD-L1 的陽(yáng)性表達(dá)率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組胃黏膜組織FOXP3+Tregs 表達(dá)情況比較

對(duì)照組胃黏膜組織中幾乎無(wú)綠色熒光，而早期胃癌組存在明顯綠色熒光。早期胃癌組Foxp3+Tregs 表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組胃黏膜組織FOXP3+Tregs 表達(dá)情況比較

2.2 兩組胃黏膜組織PD-1/PD-L1 表達(dá)情況比較

對(duì)照組胃黏膜組織中幾乎無(wú)粉色或紅色熒光，而早期胃癌組存在明顯粉色或紅色熒光。早期胃癌組PD-1、PD-L1 表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 兩組胃黏膜組織PD-1/PD-L1 表達(dá)情況比較

2.3 早期胃癌患者胃黏膜組織中FOXP3+Tregs 與PD1/PDL1 表達(dá)的相關(guān)性

早期胃癌患者胃黏膜組織中FOXP3+Tregs 與PD-1（r=0.841 3，P=0.002）、PD-L1（r=0.995 2，P＜0.001）表達(dá)水平呈正相關(guān)。見(jiàn)圖3。

圖3 早期胃癌患者胃黏膜組織中FOXP3+Tregs 與PD1/PDL1 表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

3.1 FOXP3+Tregs 在早期胃癌患者組織中的表達(dá)及意義

目前，治療胃癌的手段主要以手術(shù)、放化療、靶向藥和免疫療法為主，雖然在一定程度上可緩解患者的疾病進(jìn)程，但病死率仍居高不下[11-14]，這可能與胃癌初期患者無(wú)明顯癥狀，易誤診為上消化道潰瘍相關(guān)。因此，在臨床上尋找早期胃癌的生物標(biāo)志物，阻遏胃癌的進(jìn)一步惡化，提升患者的生存率具有重要意義。

FOXP3 是Tregs 的標(biāo)記分子，對(duì)其發(fā)育、分化和功能維持具有重要作用[15]。FOXP3+Tregs 數(shù)目及比例在腫瘤患者中明顯升高，其升高可導(dǎo)致患者自身免疫效應(yīng)T 細(xì)胞對(duì)腫瘤產(chǎn)生免疫耐受，預(yù)后不良[16]。在腫瘤的進(jìn)程中，大量活化的Tregs 可增加機(jī)體過(guò)度的免疫應(yīng)答，從而為腫瘤的免疫逃逸提供便利條件[17]。研究顯示，胃癌患者外周血中Tregs 比例顯著增高，將原發(fā)性腫瘤切除后，患者機(jī)體內(nèi)Tregs 數(shù)目明顯下降[18]。當(dāng)腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)，Tregs 數(shù)目及比例明顯上調(diào)[19-20]，提示Tregs 比例對(duì)胃癌病程及預(yù)后的判斷具有重要意義。目前，在早期胃癌患者中Tregs 數(shù)目的變化尚少見(jiàn)報(bào)道，本研究顯示，在早期胃癌患者Tregs 數(shù)目就已明顯增加，提示其可作為早期胃癌患者診斷的生物學(xué)指標(biāo)。

3.2 PD-1/PD-L1 通路在早期胃癌患者組織中的表達(dá)及意義

PD-L1 可誘導(dǎo)能誘導(dǎo)幼稚CD4+T 細(xì)胞向Tregs分化，從而發(fā)揮抑制T 細(xì)胞的增殖、分化及分泌細(xì)胞因子等效應(yīng)[21-22]。對(duì)PD-1 或PD-L1 進(jìn)行沉默或干擾后，效應(yīng)T 細(xì)胞的抗腫瘤效果明顯提升，這可能與抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用相關(guān)[17，23-24]。研究顯示，在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌及腎癌患者中采用PD-1 抗體間歇性治療均表現(xiàn)出較好的抗腫瘤效應(yīng)[25-28]。本研究結(jié)果顯示，PD-1/PD-L1 在早期胃癌組織中即已呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，提示在胃癌的早期階段對(duì)PD-1/PD-L1 通路進(jìn)行阻斷，可能是一種有效的抗腫瘤免疫治療手段。

PD-1/PD-L1 通路活化后能夠誘導(dǎo)FOXP3 的表達(dá)，而阻斷PD-1/PD-L1 信號(hào)后FOXP3+Tregs 的增殖作用明顯被抑制[29-30]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP3+Tregs數(shù)目及比例和PD-1/PD-L1 的蛋白表達(dá)在早期胃癌組織中均顯著升高，且兩者呈正相關(guān)，提示早期胃癌組織中PD-1/PD-L1 通路活化可能參與調(diào)節(jié)FOXP3+Tregs 的分化和負(fù)向調(diào)控免疫功能。

綜上所述，早期胃癌組織中存在FOXP3+Tregs 和PD-1/PD-L1 共同表達(dá)，提示聯(lián)合二者可為臨床早期胃癌患者結(jié)果的判定提供重要參考。然而，腫瘤微環(huán)境中PD-1/PD-L1 通路對(duì)FOXP3+Tregs 調(diào)節(jié)的作用機(jī)制尚未明確，PD-1/PD-L1 信號(hào)是否直接介導(dǎo)FOXP3的表達(dá)仍有待進(jìn)一步研究。