SNHG17 通過(guò)調(diào)節(jié)miR-23b-3p 和ZHX1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性表型的調(diào)控作用研究

葛北海 周 偉 韋檸琳 張 獻(xiàn) 莫 云 蘇 州 秦光平 徐國(guó)龍

1.廣西壯族自治區(qū)腦科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西柳州 545005；2.廣西壯族自治區(qū)腦科醫(yī)院神經(jīng)外科，廣西柳州 545005

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤之一，膠質(zhì)瘤尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）具有細(xì)胞增殖和侵襲能力強(qiáng)、惡性程度高、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)、5 年生存率僅5%[1]。臨床上一直在探索膠質(zhì)瘤的有效治療方法，其中靶向治療越來(lái)越引起學(xué)者的重視[2]。研究GBM 的發(fā)病機(jī)制，尋找其分子診斷標(biāo)記和分子靶點(diǎn)，對(duì)于改善膠質(zhì)瘤預(yù)后具有積極意義。小核仁RNA 宿主基因17（small nucleolar RNA host gene 17，SNHG17）是一個(gè)含1 186 個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，屬于SNHG 家族，位于人類染色體20q11.23 上。既往的研究報(bào)道，SNHG17 在多種腫瘤中異常高表達(dá)，其通過(guò)充當(dāng)內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA）或直接結(jié)合蛋白質(zhì)發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、血管生成、細(xì)胞周期及凋亡的功能[3-7]。然而，SNHG17 在GBM 中的表達(dá)特征和功能還未得到完全闡明。本研究旨在探究SNHG17 是否通過(guò)miR-23b-3p/ZHX1 軸調(diào)控GBM 惡性表型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例標(biāo)本 選取2020 年1 月至2022 年11 月廣西壯族自治區(qū)腦科醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）神經(jīng)外科診斷為GBM 的33 例患者，其中男21 例，女12 例；年齡11～56 歲，平均（26.0±6.5）歲。收集患者的手術(shù)標(biāo)本，包括其GBM 樣本和癌旁正常組織，所有樣本經(jīng)廣西柳州市工人醫(yī)院病理科醫(yī)生確認(rèn)。手術(shù)過(guò)程中獲得樣本后，立即將所有組織在液氮中冷凍儲(chǔ)存直至使用。納入標(biāo)準(zhǔn)：①在我院神經(jīng)外科行手術(shù)治療；②年齡≥18 歲；③首次診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)腫瘤；②術(shù)前采用放射療法或化學(xué)療法；③孕婦。本研究得到了我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（2020-21），且已獲得所有參與患者的書面知情同意。

1.1.2 細(xì)胞 人源GBM 細(xì)胞系A(chǔ)172 和DK-MG 購(gòu)自American Type Culture Collection。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞系均置于含有10%FBS、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。在GBM 細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，使用Lipofectamine2000（Invitrogen，11668，美國(guó)）進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染36 h 后，使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞分為si-NC 組、si-SNHG17#1 組和si-SNHG17#2 組；繼續(xù)轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞分為si-NC 組、si-SNHG17 組（選擇轉(zhuǎn)染效率更高的si-SNHG17#2）及si-SNHG17+miR-23b-3p inhibitor 組，所有材料均購(gòu)自蘇州吉瑪基因股份有限公司。

1.2.2 qRT-PCR 檢測(cè)基因表達(dá)水平 使用TRIzol 試劑盒（Invitrogen，15596-026，美國(guó)）分離并提取細(xì)胞和組織中的總RNA。使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit（TaKaRa，rr047a，日本）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。之后以cDNA 為模板，使用SYBR Green PCR Master Mix（QPK-201，日本）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，使用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)。PCR 擴(kuò)增條件：預(yù)變性（95℃，2 min）；變性（95℃，30 s），退火（60℃，30 s）；延伸（70℃，1 min），共40 個(gè)循環(huán)；最后延伸（70℃，5 min）。PCR 反應(yīng)體系為cDNA 4 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、2×SYBR Green qPCR Master Mix 12.5 μl 及雙蒸水6.5 μl。引物（深圳華大基因股份有限公司）序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒將細(xì)胞以2×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96 孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)0、24、48 及72 h。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每孔加入10 μl CCK-8 溶液并孵育1 h。之后使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處觀察光密度值，僅含有培養(yǎng)基的孔為對(duì)照孔。

1.2.4 EdU 法檢測(cè)細(xì)胞增殖接種細(xì)胞于24 孔板，每組3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)細(xì)胞直至細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，更換培養(yǎng)基，按照EdU 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明，每孔加入EdU 試劑，孵育2 h。使用PBS清洗細(xì)胞及4%多聚甲醛固定細(xì)胞，之后滴加0.5%TritonX-100，置于搖床上進(jìn)行破膜。再次PBS 清洗后加入Click-It 反應(yīng)物染色，加入Hoechst 在暗室內(nèi)孵育、復(fù)染DNA。使用PBS 再次清洗后置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。其中，藍(lán)色熒光為細(xì)胞總數(shù)，紅色熒光為增殖的細(xì)胞，細(xì)胞增殖率（%）=紅色熒光細(xì)胞數(shù)/藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 Transwell 法檢測(cè)遷移和侵襲能力 使用胰酶消化細(xì)胞后，用不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種于上室中，下室添加500 μl 含10%FBS 的DMEM培養(yǎng)基。每組3 個(gè)復(fù)孔，之后將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后清理上室中未遷移或侵襲的細(xì)胞，用4%多聚甲醇固定遷移或侵襲的細(xì)胞30 min，再用結(jié)晶紫染色30 min。之后使用PBS 去除浮色，隨后使用倒置顯微鏡（×100）用于計(jì)數(shù)遷移或侵襲的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6 Western blot 實(shí)驗(yàn) 用RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）從細(xì)胞中提取總蛋白，之后將蛋白樣本與上樣緩沖液按5∶1 比例混合，在沸水中加熱10 min 使蛋白變性。之后通過(guò)聚丙十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣本，將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF 膜1 h后，隨后用對(duì)應(yīng)的一抗anti-ZHX1（1∶1 000）和anti-GAPDH（1∶2 000）在4℃條件下孵育過(guò)夜。次日加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶3 000）于室溫孵育1 h。使用洗膜緩沖液清洗PVDF 膜3 次后使用ECL 試劑盒進(jìn)行顯色成像?？贵w均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，最后通過(guò)Image J 軟件（NIH，美國(guó)）掃描并確定蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。使用t 檢驗(yàn)或單因素方差分析（one-way ANOVA）評(píng)估兩組或多組數(shù)據(jù)之間的差異。使用Pearson 相關(guān)分析評(píng)估SNHG17、miR-23b-3p 及ZHX1 之間的表達(dá)相關(guān)性。組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG17、miR-23b-3p 和ZHX1 在GBM 組織中異常表達(dá)

qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果提示，GBM 組織中SNHG17的表達(dá)高于癌旁組織，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1A；GBM 組織中miR-23b-3p 的表達(dá)低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1B；GBM 組織中ZHX1 高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1C。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示：在GBM 組織中，SNHG17 和miR-23b-3p 之間的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.711，P＜0.001），見圖1D；SNHG17 和ZHX1 之間的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.648，P＜0.001），見圖1E；miR-23b-3p 和ZH X1 之間的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.637，P＜0.001），見圖1F。

圖1 SNHG17、miR-23b-3p 和ZHX1 在GBM 組織中的表達(dá)（n=3）

2.2 敲低SNHG17 抑制GBM 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力

敲低SNHG17 后，qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果提示，在A172 和DK-MG 細(xì)胞中，si-SNGH17#1 組和SNGH17#2 組中的SNGH17 表達(dá)均低于si-NC 組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2A。CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)A172 和DK-MG 細(xì)胞72 h 時(shí)，si-SNHG17#1、si-SNHG17#2 組的細(xì)胞增殖能力均低于si-NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2B。EdU 及Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，在A172 和DK-MG 細(xì)胞中，si-SNHG17#1、si-SNHG17#2 組的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均低于si-NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2C～E。

圖2 敲低SNHG17 抑制GBM 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲（n=3）

2.3 SNHG17 通過(guò)調(diào)節(jié)miR-23b-3p 影響GBM 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移

qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果提示，在A172 和DK-MG 細(xì)胞中，si-SNHG17 組中的miR-23b-3p 表達(dá)高于si-NC 組，但si-SNHG17+miR-23b-3p inhibitor 組中miR-23b-3p 表達(dá)低于si-SNHG17 組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3A。CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)A172 和DK-MG 細(xì)胞72 h 時(shí)，si-SNHG17 組的細(xì)胞增殖能力均低于si-NC 組，而si-SNHG17+miR-23b-3p inhibitor 組的細(xì)胞增殖能力均高于si-SNHG17 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3B。EdU 及Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，在A172 和DK-MG 細(xì)胞中，si-SNHG17 組的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均低于si-NC 組，而si-SNHG17+miR-23b-3p inhibitor 組的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均高于si-SNHG17 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3C～E。

圖3 SNHG17 調(diào)節(jié)miR-23b-3p 促進(jìn)GBM 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲（n=3）

2.4 ZHX1 表達(dá)受SNHG17 和miR-23b-3p 調(diào)控

在A172 和DK-MG 細(xì)胞中，si-SNHG17 組 的ZHX1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著低于si-NC 組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而si-SNHG17+miR-23b-3p inhibitor 組中的ZHX1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平高于si-SNHG17 組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖4A～B。

圖4 SNHG17 和miR-23b-3p 在GBM 細(xì)胞中調(diào)控ZHX1 的表達(dá)（n=3）

3 討論

SNHG17 相繼被發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌、肝細(xì)胞癌及骨肉瘤等腫瘤中過(guò)表達(dá)[6，8]。SNHG17 可以與DNA、蛋白質(zhì)及RNA 相互作用，如果位于細(xì)胞核內(nèi)，它可與蛋白質(zhì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因表達(dá)；如果其位于細(xì)胞質(zhì)中，它可充當(dāng)ceRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的功能[7]。SNHG17 可作為分子海綿與mRNA 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，進(jìn)而影響多種癌基因如ZHX1 發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)進(jìn)程[6]。本研究探索了膠質(zhì)瘤增殖和轉(zhuǎn)移的新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，即SNHG17、miR-23-3p 和ZHX1。

miRNA 是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)直接的堿基配對(duì)作用于mRNA 的3’端非翻譯區(qū)中的靶向位點(diǎn)[9]。近年來(lái)有多項(xiàng)研究[10-14]表明，失調(diào)的miRNA 在衰老、心血管疾病，尤其在腫瘤的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。lncRNA 可以發(fā)揮ceRNA 的作用，作為分子海綿與mRNA 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，在GBM 中，SNHG17可作為miR-23b-3p 的分子海綿抑制其表達(dá)水平；此外，miR-23b-3p 可逆轉(zhuǎn)SNHG17 對(duì)A172 和DK-MG細(xì)胞惡性表型的促進(jìn)作用。研究結(jié)果提示，SNHG17/miR-23b-3p 軸是GBM 進(jìn)展中的關(guān)鍵調(diào)控通路。

ZHX 家族由3 種蛋白質(zhì)組成，即ZHX1、ZHX2 和ZHX3。該家族的所有成員都包含兩個(gè)Cys2-His2 鋅指基序和5 個(gè)同源框DNA 結(jié)合域[15]。既往的研究報(bào)道，ZHX 蛋白與腎小球疾病、造血細(xì)胞分化和肝細(xì)胞癌相關(guān)[16-18]。ZHX1 可與NF-YA、BS69 和DNMT3B 的激活域相互作用[19-21]，先前的研究也報(bào)道，ZHX1 在不同腫瘤中發(fā)揮不同生物學(xué)功能：如ZHX1 可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[22]，而促進(jìn)肝細(xì)胞癌、乳腺癌和膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性表型[18，23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，在GBM 細(xì)胞系A(chǔ)172 和DK-MG 中，ZHX1 是miR-23b-3p 的一個(gè)靶基因，且可被SNHG17 調(diào)控。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)GBM 組織中SNHG17 和ZHX1的表達(dá)顯著高于癌旁組織，而miR-23b-3p 的表達(dá)較癌旁組織顯著下調(diào)，且三者之間存在調(diào)控關(guān)系。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SNHG17 通過(guò)靶向下調(diào)miR-23b-3p 繼而上調(diào)ZHX1 進(jìn)而促進(jìn)GBM 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究揭示了SNHG17/miR-23b-3p/ZHX1 軸可能是GBM 進(jìn)展過(guò)程中一個(gè)重要的功能網(wǎng)絡(luò)，為膠質(zhì)瘤診斷與治療提供了一個(gè)新分子靶點(diǎn)。