DNA 甲基化在肺癌診治中的研究進(jìn)展△

徐晗，蔡志平，高揚(yáng)，邵國，時(shí)靜華，張穎寧

1內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060

2內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸科，內(nèi)蒙古 包頭 014060

3深圳市龍崗區(qū)第三人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，廣東 深圳 518100

肺癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率均居第一位的惡性腫瘤[1-2]。肺癌按組織病理類型可分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中發(fā)病率最高的是NSCLC 中的腺癌，約有70%的患者診斷時(shí)即為晚期[3]。影響腫瘤發(fā)生的因素有許多，長(zhǎng)期處于化學(xué)有害物質(zhì)的環(huán)境中容易誘發(fā)腫瘤的發(fā)生[4-5]。吸煙和空氣中的細(xì)顆粒物污染是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的主要因素[6-7]。研究表明，在女性NSCLC患者中，從未吸煙的原發(fā)性肺癌患者也占據(jù)了很大一部分，但有吸煙史的患者預(yù)后更差[8-10]。對(duì)于肺癌的診斷，以病理學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，由于大部分肺癌診斷時(shí)即為中晚期，故患者的5 年生存率較低[11]。隨著分子診斷學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，表觀遺傳學(xué)的發(fā)展為肺癌的診斷打開了新的思路。表觀遺傳學(xué)是指DNA 序列不改變，而其表型發(fā)生了變化，并且將這種變化穩(wěn)定地遺傳至細(xì)胞發(fā)育和增殖過程中。DNA 甲基化作為表觀遺傳學(xué)中的一種常見修飾方式，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展方面有著重要作用[12]。在已知研究的基礎(chǔ)上，本文就DNA 甲基化在肺癌診斷和治療中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 DNA 甲基化機(jī)制

DNA 甲基化是DNA 修飾的一種形式，可以在不改變DNA 序列的前提下，改變生物的遺傳學(xué)表現(xiàn)。DNA 甲基化能夠引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA 構(gòu)象、DNA 穩(wěn)定性以及DNA 與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因的表達(dá)。一般研究的DNA甲基化主要是指發(fā)生在胞嘧啶磷酸-鳥嘌呤（cytosine phosphate-guanine，CpG）二核苷酸中胞嘧啶上第5 位碳原子的甲基化，即在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，使DNA基因組中CpG 二核苷酸中胞嘧啶上的第5 位碳原子和以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）為甲基供體的兩部分相結(jié)合，產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶甲基基團(tuán)，并遺傳至后代的過程[13]。CpG 在DNA 中的分布不一，一部分以甲基化的狀態(tài)散在DNA 中，其分布密度較低，另一部分集中分布于0.5～4.0 kb 區(qū)域中，密度較高，稱作CpG 島，多以非甲基化的形式處于基因啟動(dòng)子區(qū)域上，影響相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[14]。存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的CpG 二核苷酸處于穩(wěn)定的非甲基化狀態(tài)，這種狀態(tài)使基因的轉(zhuǎn)錄處于開放狀態(tài)，異常的甲基化會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過程異常，從而影響基因的正常表達(dá)[15]。如在轉(zhuǎn)錄起始階段，啟動(dòng)子發(fā)生甲基化則會(huì)沉默啟動(dòng)子的表達(dá)，進(jìn)而沉默整段基因的轉(zhuǎn)錄。

在哺乳動(dòng)物的胚胎早期，DNA 甲基化會(huì)逐漸發(fā)生改變，隨著胚胎的發(fā)育完成，甲基化的形勢(shì)趨于穩(wěn)定。而腫瘤細(xì)胞中的DNA 甲基化模式并不處于穩(wěn)定狀態(tài)。腫瘤的發(fā)生與基因組整體甲基化水平降低和部分啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化密切相關(guān)，基因組整體低甲基化可以使原本處于沉默狀態(tài)下的人體自身的原癌基因活化，而部分啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化使得抑癌基因失活，增加了腫瘤的發(fā)生率[16-17]。

2 DNA 甲基化與肺癌的關(guān)系

2.1 DNA 甲基化與肺癌的早期診斷

肺癌患者的早期表現(xiàn)多樣，且相應(yīng)的臨床癥狀并不明顯，為肺癌的早期診斷、篩查帶來困難。檢測(cè)與診斷肺癌常用的方法包括肺部影像學(xué)檢查、痰細(xì)胞學(xué)檢查和組織活檢。但由于肺癌的早期癥狀不典型，在診斷時(shí)患者分期已經(jīng)較高，使得肺癌患者的5 年生存率不足20%[18]。因此提高肺癌的早診早治率，成為提高患者生存率的關(guān)鍵[19]。DNA甲基化輔助診斷肺癌的方法主要有肺泡灌洗液、痰液、血液和呼出氣體的采集檢查等幾種方法[20]。現(xiàn)在已有很多廠家推出比較成熟的商業(yè)化試劑盒，可以很方便地檢測(cè)DNA 甲基化，包括亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒、甲基化DNA 定量檢測(cè)試劑盒、甲基化DNA 免疫沉淀試劑盒和甲基化DNA 擴(kuò)增試劑盒，例如BisulFlash DNA Modification Kit 可檢測(cè)的DNA 片段大小一般為250 bp，MethylFlash Global DNA Methylation（5-mC）ELISA Easy Kit（colorimetric）采用比色法測(cè)定DNA 中的5-甲基胞嘧啶，以及EpiQuik Tissue Methylated DNA immunoprecipitation Kit 和Methylamp MS-qPCR Fast Kit 等。用生物標(biāo)記DNA 甲基化可以檢測(cè)細(xì)胞的異常變化，在肺癌發(fā)生的初期階段，DNA 甲基化的發(fā)生頻率很高，整體DNA 甲基化可以作為肺癌早期診斷的生物標(biāo)志物。目前，采用肺癌患者的外周血樣本，檢測(cè)早期至中期的異常甲基化位點(diǎn)是較有效的檢測(cè)方式，檢測(cè)肺癌患者血漿鈣黏蛋白13（cadherin 13，CDH13）、脆性組氨酸三聯(lián)體二腺苷三磷酸酶（fragile histidine triad diadenosine triphosphatase，F(xiàn)HIT）、p16、視黃酸受體β（retinoic acid receptor β，RARβ）和Ras 相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族成員1A（Ras association domain family member 1A，RASSF1A）基因中任意兩者的甲基化，診斷肺癌的靈敏度和特異度均可達(dá)73%以上，可作為NSCLC 早期診斷的潛在標(biāo)志物[21]。Richter 等[22]在研究中發(fā)現(xiàn)，受精卵阻滯基因1（zygote arrest 1，ZAR1）在正常肺組織中表達(dá)，但是在肺癌組織中被啟動(dòng)子甲基化滅活。通過抑制DNMT 的表達(dá)可以恢復(fù)ZAR1 在肺癌中的表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道，在NSCLC 中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B 的表達(dá)增加，并與腫瘤抑制基因如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）、FHIT和RARβ的基因沉默相關(guān)[23]。NSCLC 組織中的死亡相關(guān)蛋白激酶1（death associated protein kinase 1，DAPK1）啟動(dòng)子和WNT 信號(hào)通路抑制因子-1（WNT inhibitory factor-1，WIF-1）基因啟動(dòng)子的甲基化頻率高于正常肺組織[24-25]。基于人類客觀生活環(huán)境的影響，吸煙是造成肺癌高發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵因素，煙霧中的致癌物質(zhì)可導(dǎo)致細(xì)胞中的抑癌基因啟動(dòng)高甲基化模式，導(dǎo)致抑癌基因失活，造成腫瘤發(fā)生。對(duì)于有吸煙史的患者，可檢測(cè)7 個(gè)高甲基化基因[CDKN2A、RASSF1、O-6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O-6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）、RARβ、DAPK、WIF-1和FHIT]，對(duì)肺癌患者進(jìn)行早期篩查診斷[26]。

進(jìn)行痰標(biāo)本檢查，利用支氣管肺泡灌洗是另外一種選擇。腫瘤細(xì)胞可以通過不典型的細(xì)胞形態(tài)來識(shí)別，運(yùn)用痰細(xì)胞學(xué)檢查，可以較準(zhǔn)確地識(shí)別診斷原發(fā)性肺癌。對(duì)痰標(biāo)本中RASSF1A 結(jié)合硫酸乙酰肝素-氨基葡萄糖3-O-磺基轉(zhuǎn)移酶2（3-O-sulphotransferase 2，3OST2）啟動(dòng)子甲基化的分析表明，該方法診斷肺癌的靈敏度為85%，特異度為74%，同時(shí)，研究人員觀察到55%的Ⅰ期和Ⅱ期患者的腫瘤樣本中mutL 同源物1（mutL homolog 1，MLH1）啟動(dòng)子高甲基化[27]。若使用幾種不同基因組合，可以使痰細(xì)胞學(xué)檢查的靈敏度和特異度分別達(dá)到98%和71%，而血漿的靈敏度和特異度分別達(dá)到93%和62%[28]。Liu 等[29]通過大樣本（2238 例肺癌患者和2563 例健康者）和多基因（32 個(gè)基因）的Meta 分析表明，甲基化的SRY 盒轉(zhuǎn)錄因子17（SRY-box transcription factor 17，SOX17）、半胱氨酸雙加氧酶1（cysteine dioxygenase type 1，CDO1）、鋅指蛋白42（zinc finger protein 42，ZFP42）、速激肽前體1（tachykinin precursor 1，TAC1）、TAFA 趨化因子樣家族成員4（TAFA chemokine like family member 4，F(xiàn)AM19A4）、FHIT、MGMT、p16和RASSF1A是篩選和輔助檢測(cè)肺癌的潛在生物標(biāo)志物。在基因聯(lián)合檢測(cè)方法中，運(yùn)用SHOX 同源盒2（SHOX homeobox 2，SHOX2）與RASSF1A基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)，可以提高NSCLC 患者的早期檢出率[30-31]。

采用低劑量CT（low-dose CT，LDCT）檢測(cè)早期肺癌有較高識(shí)別率，但不能區(qū)分惡性腫瘤和良性孤立性肺結(jié)節(jié)，而采用亞硝酸鹽測(cè)序進(jìn)行甲基化分析可以很好地彌補(bǔ)這一不足[32]。運(yùn)用超靈敏方法和肺癌特異性基因結(jié)合來檢測(cè)痰液和血漿中的DNA 甲基化，可以提高CT 檢測(cè)早期肺癌的準(zhǔn)確度[28]。血漿中的游離DNA 甲基化檢測(cè)采用實(shí)時(shí)定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)，可以發(fā)現(xiàn)肺癌患者降鈣素相關(guān)多肽α（calcitonin related polypeptide alpha，CALCA）、RASSF1A、CDKN2A、纖毛和鞭毛相關(guān)蛋白1（ciliary and flagella-associated protein 1，DLEC1）、CDH13、配對(duì)樣同源域2（paired like homeodomain 2，PITX2）、同源框A9（homeobox A9，HOXA9）和WT1 轉(zhuǎn)錄因子（WT1 transcription factor，WT1）基因的甲基化水平均較非肺癌患者高[33]。由此可以推斷，檢測(cè)血液中的DNA 甲基化水平，可以有效提高肺癌診斷陽性率。

2.2 DNA 甲基化與肺癌的治療

肺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括手術(shù)治療、含鉑方案化療、放療、免疫治療和靶向治療。此外，基于腫瘤細(xì)胞DNA 甲基化改變而采取的不同治療方法，亦可以作為腫瘤的潛在治療方法。治療NSCLC 的藥物順鉑如受到hMLH1啟動(dòng)子甲基化影響，藥物的敏感性會(huì)降低，影響患者的治療效果，故hMLH1 可成為NSCLC 患者個(gè)體化治療時(shí)的生物標(biāo)志物[34]。與傳統(tǒng)遺傳學(xué)不同，表觀遺傳學(xué)的改變是一個(gè)可逆的過程，對(duì)某些因高甲基化誘導(dǎo)的癌基因活化所引起的腫瘤，臨床上已開始嘗試使用去甲基化療法治療。去甲基化治療是指通過去甲基化藥物靶向改變腫瘤中相關(guān)基因的異常高甲基化，還可增加細(xì)胞對(duì)治療的敏感性[35-36]。由于啟動(dòng)子區(qū)的甲基化而導(dǎo)致重要抑癌基因失活，是人體大多數(shù)腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制之一，而甲基化催化過程中起關(guān)鍵作用的是DNMT。因此，可使用DNMT 抑制劑降低DNMT 的活性，以此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化，從而達(dá)到對(duì)腫瘤的治療[37]。地西他濱和5-氮胞苷均為甲基化抑制劑，已應(yīng)用于血液系統(tǒng)腫瘤、急性粒細(xì)胞白血病和骨髓異常綜合征的治療中[38-39]。一些非腺苷類DNMT抑制劑主要抑制DNMT 活性，包括普魯卡因、普魯卡因胺和肼屈嗪等。?；撬嵘险{(diào)基因1（taurine-upregulated gene 1，TUG1）在NSCLC 組織中表達(dá)下調(diào)，而在胃癌、膀胱癌和骨肉瘤中卻過表達(dá)，表明該基因具有組織特異性[40]。p53基因與TUG1啟動(dòng)子區(qū)相互作用，直接調(diào)控TUG1 的表達(dá)，而TUG1 能夠與多梳抑制復(fù)合物2（Polycomb repressive complex 2，PRC2）結(jié)合調(diào)節(jié)生物活性，PRC2 的重要組分zeste 2 多梳抑制復(fù)合體2 亞基增強(qiáng)子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）能靶向結(jié)合HOXB7的啟動(dòng)子區(qū)，使HOXB7 的組蛋白H3 第27位賴氨酸H3K27 甲基化，HOXB7 通過激活促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，敲低TUG1后，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，故p53/TUG1/PRC2/HOXB7 之間的相互作用也許可作為NSCLC 診斷和治療的靶點(diǎn)[40-42]。

研究表明，SOX 家族蛋白對(duì)很多腫瘤都有很大的影響，在NSCLC 中，該家族蛋白影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。SOX 在胚胎發(fā)育的各個(gè)階段都有表達(dá)，發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄因子的作用，SOX30 轉(zhuǎn)錄因子可以促使NSCLC 細(xì)胞凋亡，在正常肺細(xì)胞中SOX18蛋白低表達(dá)，因此，可以推測(cè)肺癌患者的SOX18蛋白水平增高，可作為肺癌患者病程發(fā)展的監(jiān)測(cè)手段[43]。此外，Nehme 等[44]指出，T-BOX 轉(zhuǎn)錄因子2亞家族在人NSCLC中顯著下調(diào)，對(duì)肺惡性腫瘤發(fā)揮抑制作用，同時(shí)其甲基化狀態(tài)可以作為NSCLC對(duì)抗腫瘤藥物5-氮胞苷臨床反應(yīng)的指標(biāo)。微小RNA（microRNA，miRNA）在腫瘤治療方面的作用近年來受到了更多的關(guān)注。Wei等[45]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-9可以抑制NSCLC 細(xì)胞的遷移，增加腫瘤放射敏感性，其效應(yīng)受到基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的調(diào)控。

2.3 DNA 甲基化與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系

腫瘤患者的預(yù)后主要與腫瘤的類型、分期、治療手段和治療方案有關(guān)。研究表明，在肺癌的不同分期，DNA 甲基化程度有明顯的變化，尤其在NSCLC 中，DNA 甲基化程度可以很明顯地反映腫瘤的進(jìn)展情況[46-47]。不同階段的甲基化狀態(tài)可以揭示相同組織學(xué)類型肺癌患者的預(yù)后，而相同的甲基化狀態(tài)也可以揭示不同肺癌患者的預(yù)后[48]。Liu等[49]的研究指出，跨膜蛋白196（transmembrane protein 196，TMEM196）的高甲基化狀態(tài)可以作為早期肺癌的診斷標(biāo)志物，也是肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后指標(biāo)。不同位點(diǎn)的甲基化可以作為特異性生物標(biāo)志物，反映肺癌細(xì)胞的變化，如配對(duì)盒6（paired box 6，PAX6）可能是NSCLC 預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物；腫瘤抑制因子RASSF1A 可以確定為與細(xì)胞外基質(zhì)機(jī)械特性相關(guān)的臨床生物標(biāo)志物，增加了肺腺癌的腫瘤干性和轉(zhuǎn)移性進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)[50]。由此就可以針對(duì)性地依據(jù)患者個(gè)體生物標(biāo)志物的不同，采用相應(yīng)的治療手段，從而更加準(zhǔn)確地判斷患者的預(yù)后情況，提高肺癌患者的生存率。

3 小結(jié)與展望

對(duì)于不同類型和分期的肺癌，其傳統(tǒng)診斷與治療已有了較完整的體系。肺癌的早診早治可以提高患者的生存率和治愈率。DNA 甲基化在基因?qū)用嬗绊懥四[瘤發(fā)生和發(fā)展的全過程，使得患者的個(gè)體化表現(xiàn)更加明顯，使治療具有針對(duì)性，是對(duì)傳統(tǒng)的肺癌診療方法的補(bǔ)充。隨著更多肺癌相關(guān)的DNA 甲基化位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，其在肺癌領(lǐng)域的研究和應(yīng)用與日俱增，與之相關(guān)的DNMT 及其DNMT 抑制劑在肺癌診治及預(yù)后評(píng)估中的作用更加顯著。隨著表觀遺傳學(xué)的進(jìn)步，有關(guān)DNA 甲基化的相關(guān)研究加深了人們對(duì)于腫瘤細(xì)胞的認(rèn)知，更深入了解了DNA 甲基化對(duì)于基因的調(diào)節(jié)模式，幫助臨床對(duì)肺癌進(jìn)行診治，提高早診早治率，也為未來阻斷肺癌的發(fā)生提供新的思路。