水解碳青霉烯類OXA型β-內(nèi)酰胺酶的研究進展

姜雪琪,李 娟

(中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所細菌耐藥控制室,傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室,北京 102206)

β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生、進化與傳播是革蘭陰性菌對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的最主要機制[1-2]。根據(jù)不同底物譜可將β-內(nèi)酰胺酶分為青霉素酶、頭孢菌素酶和碳青霉烯酶。碳青霉烯酶是一類能夠?qū)μ记嗝瓜╊愃幬锂a(chǎn)生水解作用的β-內(nèi)酰胺酶,主要包括Ambler分子結(jié)構(gòu)分類法中的A類、B類、D類,其中A類酶和D類酶利用絲氨酸殘基發(fā)揮水解作用,按功能分別屬于Bush分類法中的2f和2d亞組;而B類酶利用金屬離子才具有活性,屬于Bush分類法中第3組[3](見表1);D類β-內(nèi)酰胺酶有14個亞家族,其中OXA型種類最為豐富,并不斷發(fā)現(xiàn)新的變體[4]。截至2022年9月,已有1 144種OXA酶被β-內(nèi)酰胺酶數(shù)據(jù)庫(http://www.bldb.eu/BLDB.php?prot=D#OXA)收錄,其中水解碳青霉烯類藥物的OXA型酶數(shù)量增加較多,給全球公共衛(wèi)生帶來嚴重威脅。

表1 碳青霉烯酶分類及功能特點

1 OXA酶的來源及特點

苯唑西林酶(oxacillinase, OXA酶)是最早報道的β-內(nèi)酰胺酶之一,因其對苯唑西林和氯唑西林的水解率高于青霉素而命名[5]。早期發(fā)現(xiàn)的OXA酶僅對青霉素類藥物有活性,隨著變體的不斷出現(xiàn),其底物譜不斷擴大,部分OXA酶變體不僅表現(xiàn)出對頭孢菌素類抗生素具有水解能力,甚至對碳青霉烯類抗生素也產(chǎn)生一定的水解活性,其活性不受克拉維酸、他唑巴坦、舒巴坦等酶抑制劑的抑制[6]。

1976年,Sykes等[7]通過基因序列分析首次發(fā)現(xiàn)并命名OXA酶:OXA-1～OXA-3,并以其共有的保守序列作為后續(xù)OXA酶分類的基礎(chǔ),此后根據(jù)發(fā)現(xiàn)時間進行數(shù)字編號命名OXA酶(OXA酶的種類及分類見表2)。隨著OXA酶家族成員的增加,BLDB數(shù)據(jù)庫將氨基酸同源性高、底物譜相似的酶以首個命名的OXA酶的亞家族來命名,稱為OXA-X-like酶,如OXA-48-like酶、OXA-23-like酶。OXA酶根據(jù)來源不同可分為獲得性及內(nèi)源性兩大類,blaOXA基因既可由質(zhì)粒攜帶也可由染色體攜帶[5]。鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌中染色體攜帶blaOXA基因較多,肺炎克雷伯菌中質(zhì)粒攜帶則更為常見。近年來,全球范圍內(nèi)陸續(xù)報道了革蘭陰性腸桿菌中具有碳青霉烯酶活性的新型OXA酶,這顯示細菌耐藥形勢日益嚴峻。

表2 OXA型β-內(nèi)酰胺酶種類及來源

2 OXA酶的流行分布

目前,OXA酶宿主菌范圍不斷擴大,從最初發(fā)現(xiàn)的鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌,到目前發(fā)現(xiàn)的肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌以及其他腸桿菌[8-10]。

不動桿菌中幾乎所有OXA酶都具有碳青霉烯酶活性,聯(lián)合外排泵過表達機制可介導(dǎo)對碳青霉烯類抗生素高水平耐藥。中東和北非等地區(qū)耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(CRAB)分離率超過70%[11]。鮑曼不動桿菌攜帶染色體固有OXA-51-like酶,該家族已發(fā)現(xiàn)363個變種,是造成鮑曼不動桿菌耐藥的首要因素。OXA-23是鮑曼不動桿菌中常見的獲得性O(shè)XA酶,最初在蘇格蘭發(fā)現(xiàn)的CRAB菌株中分離并命名,現(xiàn)已報道發(fā)現(xiàn)44個變體,主要在歐美地區(qū)流行[12-14]。OXA-24/40首次在西班牙分離出的CRAB中發(fā)現(xiàn),此后陸續(xù)衍生出11個變體,在中國、美國、埃及、土耳其及伊朗等國家均有流行[15-17]。2003年在法國圖盧茲發(fā)現(xiàn)的1株CRAB中檢測出OXA-58,其與其他OXA家族同源性低,被列為OXA新的亞家族,該家族現(xiàn)已衍生出7個變種,主要通過質(zhì)粒傳播,在歐洲、亞洲及拉美地區(qū)引起醫(yī)院感染暴發(fā)[18-20]。

OXA-48-like酶由于主要在腸桿菌目細菌中傳播而備受關(guān)注。自2001年在土耳其伊斯坦布爾分離的肺炎克雷伯菌中首次檢出水解碳青霉烯類活性的OXA-48以來,其變體在歐洲、亞洲、北非、中東地區(qū)的腸桿菌目細菌中廣泛傳播[21-22]。截至2022年6月,世界范圍內(nèi)已確認和命名45個OXA-48-like酶。我國主要以O(shè)XA-181及OXA-232兩大變體為主,兩者僅存在1個氨基酸差異。自印度1株肺炎克雷伯菌分離出OXA-181后,在其他腸桿菌中也被分離出來,呈現(xiàn)出世界范圍內(nèi)流行的態(tài)勢[23-25]。2013年,法國1株肺炎克雷伯菌中首次檢出OXA-232,而后在我國江浙滬地區(qū)相繼檢出,主要通過質(zhì)粒進行菌株間水平轉(zhuǎn)移[26-28]。OXA-50-like酶為假單胞菌所特有,現(xiàn)已衍生出43個變體,其與外排泵過表達、外膜蛋白減少或丟失等機制共同作用,是造成假單胞菌多重耐藥的重要原因[29]。Nitz等[30]首次在臨床分離的銅綠假單胞菌中檢測出OXA-23和OXA-51,該菌株存在高水平多重耐藥。變形桿菌具有攜帶多種類型水解碳青霉烯類OXA酶的特征。Bonnin等[31]發(fā)現(xiàn)OXA-23、OXA-24及OXA-58在法國和比利時地區(qū)分離的變形桿菌中流行。我國也在奇異變形桿菌中檢出了blaOXA-23和blaOXA-48基因[32]。

轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動元件介導(dǎo)的耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致耐藥基因在不同種屬之間傳播的重要機制[33]。此外,插入元件中的調(diào)控序列能夠促進基因的過表達,例如鮑曼不動桿菌中常見的插入序列ISAba1,隸屬于IS4家族,能夠提供強啟動子以增強其下游blaOXA-23、blaOXA-27等基因的表達,也可形成轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)blaOXA基因的轉(zhuǎn)移。接合型質(zhì)粒攜帶的基因可隨質(zhì)粒轉(zhuǎn)移,更易造成耐藥性的傳播[34]。

3 OXA酶功能研究

不同OXA酶具有不同的底物譜,Bush-Jacoby分類法[35]根據(jù)酶的功能和表型,將OXA酶分為2d、2de、2df和2def四個功能組。OXA酶對氯唑西林或苯唑西林水解活性高于對青霉素的50%,則被歸為2d功能組,其中大部分屬于窄譜酶(OXA-1-like酶、OXA-50-like酶),其僅對青霉素類藥物有明顯的水解活性,對頭孢菌素類抗生素作用微弱,且活性不會被克拉維酸抑制。近年來,部分窄譜酶因單一或多個氨基酸位點突變而發(fā)生底物譜變化,使得某些OXA酶具有廣譜性質(zhì),被歸為2de亞組ESBLs,主要為OXA-2-like酶及OXA-10-like酶。土耳其分離的1株銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的OXA-15是由OXA-2發(fā)生單一氨基酸突變形成的超廣譜OXA酶,對頭孢他啶有較高的水解活性。OXA-10-like酶中具有廣譜水解活性的變體較多。與OXA-10相比,OXA-11有兩個氨基酸差異,增加了其對三代頭孢的水解能力。OXA-145是OXA-10的另一個變體,第165位氨基酸的缺失擴大該酶家族的底物譜,減弱了對青霉素類藥物的水解活性。Bonnin等[36]在法國1株銅綠假單胞菌中檢出OXA-198,被歸為一個新的D類酶亞組,blaOXA-198位于IncP型質(zhì)粒攜帶的Ⅰ類整合子上,顯著降低對碳青霉烯類抗生素的敏感性。Kotsakis等[37]在醫(yī)院污水分離的腸桿菌中發(fā)現(xiàn)同樣定位于Ⅰ類整合子上的blaOXA-655和blaOXA-656,均為OXA-10的新變體,這些變體具有更強的碳青霉烯類水解能力,存在水平傳播的風(fēng)險。

目前,關(guān)注較多的是由于活性位點變化而產(chǎn)生碳青霉烯類水解能力的2df亞組OXA酶。OXA-23是第一個被確認水解碳青霉烯類的OXA酶,其對亞胺培南的水解活性顯著提高,而對廣譜頭孢菌素類抗生素及氨曲南水解能力弱[38]。與OXA-23相比,OXA-27有兩個氨基酸差異,同樣表現(xiàn)出對碳青霉烯類抗生素的水解活性。此外,我國報道了單個氨基酸突變產(chǎn)生的新變種OXA-423,同樣具有碳青霉烯類抗生素的水解活性,但對克拉維酸、他唑巴坦等酶抑制劑敏感[39]。blaOXA-51基因編碼一種弱的碳青霉烯酶,多為內(nèi)源性攜帶,也可由質(zhì)粒攜帶,質(zhì)粒相鄰的ISAba1可促使該基因過表達,表現(xiàn)出對碳青霉烯類藥物的高水平耐藥[40]。OXA-58由質(zhì)粒攜帶,對青霉素類和碳青霉烯類抗生素水解活性較弱,而對廣譜頭孢菌素類抗生素活性較差,多個ISs協(xié)同轉(zhuǎn)座可能是其傳播的重要方式[41]。

腸桿菌中最常見的碳青霉烯酶為OXA-48,IS1999及多種質(zhì)粒的高效轉(zhuǎn)移加速了blaOXA-48基因在細菌間的水平傳播[42]。OXA-181是分布最為廣泛的OXA-48-like酶家族成員,其與OXA-48有四個氨基酸差異,且表現(xiàn)出極為相似的水解特征。Aertker等[43]證明單一氨基酸替換能夠使OXA-48-like酶對碳青霉烯類抗生素表現(xiàn)出不同的水解活性。OXA-162與OXA-48僅有一個氨基酸差異,同樣能夠介導(dǎo)腸桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥。Sommer等[44]在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒攜帶的blaOXA-484基因,OXA-484與OXA-181存在1個氨基酸替換,其對碳青霉烯類抗生素的水解能力略低于OXA-48及OXA-181。比利時分離出的1株肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了OXA-519,其與OXA-48有1個氨基酸差異,表現(xiàn)出對哌拉西林/他唑巴坦耐藥和對亞胺培南敏感性降低[45]。然而,并不是所有的OXA-48變體都對碳青霉烯類抗生素有水解活性。OXA-405與OXA-48具有相似的主體結(jié)構(gòu),blaOXA-405位于轉(zhuǎn)座子Tn1999上,IS1R插入替代了保守序列缺失的4個氨基酸,使得OXA-405對碳青霉烯類幾乎完全失去水解活性,僅表現(xiàn)出ESBL活性[46]。Poirel等[47]在腸桿菌中發(fā)現(xiàn)OXA-163,與OXA-48相比有5個氨基酸變化,能夠水解青霉素類、第三代頭孢菌素類以及碳青霉烯類抗生素,被分類為兼具頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素水解活性的2def亞組。Gomez等[48]從阿根廷1例白血病患者體內(nèi)分離出攜帶OXA-163的肺炎克雷伯菌,治療后又在其體內(nèi)分離出攜帶OXA-247的肺炎克雷伯菌,OXA-247是OXA-163的新變體,兩者有相似的底物譜,但對廣譜頭孢菌素類抗生素的水解活性減弱。

20世紀70年代β-內(nèi)酰胺酶抑制劑應(yīng)用于臨床,常見的酶抑制劑包括克拉維酸、他唑巴坦和舒巴坦等,能夠?qū)XA酶產(chǎn)生不同程度的抑制作用,他唑巴坦對OXA-1僅表現(xiàn)弱抑制作用;對于同一家族成員,他唑巴坦對OXA-32表現(xiàn)強抑制作用,克拉維酸則相對較弱,而OXA-53對后者更加敏感[49]。研究[50-51]顯示,頭孢他啶/阿維巴坦、亞胺培南/西司他丁等新型酶抑制劑復(fù)合制劑對某些產(chǎn)D類酶的腸桿菌有一定殺滅作用。

4 OXA酶與希瓦氏菌的關(guān)系研究

希瓦氏菌是一種水體環(huán)境生存的革蘭陰性菌,早期認為該類菌僅存在于腐敗變質(zhì)的高蛋白水產(chǎn)食品中。近年研究[52-53]顯示,希瓦氏菌的部分種屬與人類感染密切相關(guān),易感人群可通過接觸或食用含有希瓦氏菌的水、海產(chǎn)、食品等引起腹瀉、溶血性反應(yīng)以及軟組織感染等疾病。臨床常見的希瓦氏菌包括廈門希瓦氏菌、海藻希瓦氏菌和腐敗希瓦氏菌。

希瓦氏菌染色體固有攜帶blaOXA-48-like基因,在報道的OXA-48-like酶中有26個與希瓦氏菌固有攜帶的OXA高度同源,說明希瓦氏菌屬可能是OXA-48-like酶的起源,并在blaOXA-48基因的傳播中發(fā)揮重要作用[54]。Poirel等[55]首次在奧奈達湖希瓦氏菌中發(fā)現(xiàn)染色體定位的blaOXA-54基因,OXA-54與OXA-48同源性為92%,可以顯著水解苯唑西林,常見的酶抑制劑僅對其有弱抑制作用。廈門希瓦氏菌與奧奈達湖希瓦氏菌親緣關(guān)系接近,分離自我國福建廈門近海沉積物中。Dabos等[56]和Jousset等[57]在廈門希瓦氏菌中報道了染色體固有攜帶blaOXA-535,OXA-535與OXA-48同源性為91.3%,對多種β-內(nèi)酰胺類藥物有高效水解作用。在沼澤植物[54]、河水[58-59]、淡水[60]、養(yǎng)殖場廢水[61-62]以及醫(yī)院污水[63-64]等環(huán)境來源的廈門希瓦氏菌中不斷檢出OXA-48-like酶相關(guān)基因。因此,希瓦氏菌被認為是自然環(huán)境中耐藥基因的重要載體和儲存庫,通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)耐藥基因快速轉(zhuǎn)移和傳播,對人類及動物的健康造成潛在威脅。

5 總結(jié)與展望

OXA酶是革蘭陰性菌中種類繁多、分布廣泛的一類β-內(nèi)酰胺酶,可由質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等多種可移動元件攜帶并轉(zhuǎn)移,實現(xiàn)OXA酶在不同菌株間的快速傳播。近年來,可以水解碳青霉烯類抗生素的OXA酶新變體不斷出現(xiàn),并在人群、動物及環(huán)境中傳播,對公共衛(wèi)生造成潛在的、巨大的威脅[10]。意大利、西班牙等南歐國家產(chǎn)OXA-48-like酶耐碳青霉烯類腸桿菌(carbapenem-resistant Enterobacterales, CRE)占比超過產(chǎn)KPC、NDM等碳青霉烯酶CRE,是CRE的主要耐藥機制[65]。在我國,盡管具有碳青霉烯類藥物水解功能的OXA酶在CRE中占比較低,但不斷有OXA-181、OXA-232、OXA-427、OXA-484、OXA-546、OXA-894和OXA-913等新的具有碳青霉烯類藥物水解活性的亞型被檢出,提示需高度關(guān)注OXA酶的流行和進化。環(huán)境、動物及人群中blaOXA的檢測、OXA酶功能研究和持續(xù)監(jiān)測,對掌握OXA酶的分布特征和流行趨勢,保障食品安全,減慢或抑制耐藥基因在菌株間的傳播和擴散,最大限度減少耐藥菌的危害具有重要意義。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。