牛源TAK1基因慢病毒載體構(gòu)建及其在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)

張 帆,姜坤生,王禹淳,馬金柱,于立權(quán),宋佰芬,2*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,中國(guó)大慶 163319;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,中國(guó)北京 100093)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β激活蛋白1(transforming growth factor-beta activator protein 1,TAK1)是一種絲氨酸/酪氨酸激酶,最初被鑒定為絲氨酸/酪氨酸蛋白激酶(MAPKKK)家族的成員,因是最早發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β或骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP-4)反應(yīng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)[1]而得名。有研究表明,TAK1在腫瘤壞死因子受體(TNFR)、白介素1受體I(IL-1RI)和Toll樣受體(TLRs)介導(dǎo)的核因子κB (NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的活化中起著至關(guān)重要的作用[2]。此外,TAK1通過(guò)介導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞受體信號(hào)在獲得性免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-4]。在所有這些途徑中,TAK1被認(rèn)為是NF-κB和MAPKs的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,它在將上游信號(hào)從所指示的受體復(fù)合體傳遞到下游信號(hào)小體中起著至關(guān)重要的作用[5]。另一方面,TAK1被各種應(yīng)激激活,包括DNA損傷和滲透沖擊,表明TAK1參與應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)[6-7]。因此,TAK1不僅參與免疫和炎癥反應(yīng)的發(fā)生,還可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而發(fā)揮多種生物學(xué)作用[8]。越來(lái)越多的證據(jù)已經(jīng)指出了TAK1作為一種多功能激酶的重要性,它可以應(yīng)對(duì)各種刺激。

實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出一個(gè)表達(dá)量差異顯著且新組裝的lncRNA-MSTRG.16919.1,為進(jìn)一步研究lncRNA-MSTRG.16919.1的功能,將其沉默后再行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,結(jié)果顯示該lncRNA可能與TAK1介導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān),為了進(jìn)一步確認(rèn)該結(jié)果需要將TAK1基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)。因此,基于以上研究背景構(gòu)建TAK1基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體,篩選TAK1基因過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,為深入研究TAK1在lncRNA-MSTRG.16919.1參與的作用中以及BHV-1感染中機(jī)制的研究提供有效的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和載體 pCDH-CMV-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro質(zhì)粒購(gòu)自上海漢恒生物科技有限公司,感受態(tài)EscherichiacoliDH5α、293T細(xì)胞系、MDBK細(xì)胞系均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑 EndoFree Plasmid Mini Kit,Omega公司產(chǎn)品;15 kb DNA Ladder、MiniBEST Agarose Gel Extraction kit Ver.4,Takara公司產(chǎn)品;限制性內(nèi)切酶BamHI-HF、EcoRI-HF,NEB公司產(chǎn)品;DMEM培養(yǎng)基,美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;聚凝胺,中國(guó)百?？萍脊井a(chǎn)品;嘌呤霉素,美國(guó)MCE公司產(chǎn)品;羊抗兔IgG-HRP抗體、Beta Actin Antibody,中國(guó)博奧森公司產(chǎn)品;ECL顯色液,德國(guó)默克公司產(chǎn)品;預(yù)染蛋白質(zhì)Marker、BCA定量試劑盒,中國(guó)Biosharp公司產(chǎn)品;RIPA裂解液,中國(guó)索萊寶公司產(chǎn)品;TAK1抗體,中國(guó)親科生物公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 電恒溫水浴鍋,上海博訊公司產(chǎn)品;Nanodrop 2000、高速離心機(jī)、低溫恒溫器和熒光顯微鏡,美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品;PCR擴(kuò)增儀、蛋白凝膠電泳儀、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、ChemiDoc XRS+紫外凝膠成像系統(tǒng),美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品;細(xì)菌搖床,華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡,廣州明美光電技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 pCDH-CMV-TAK1-EF1-turboRFP-T2A-Puro載體構(gòu)建 根據(jù)GenBank中牛源TAK1基因的全長(zhǎng)序列(登錄號(hào):NM-001081595.1),設(shè)計(jì)并合成引物,序列如下:TAK1-F:GAATTCATGTCTACAGCCTCCGC;TAK1-R:GGATCCTGAAGTGCCTTGTCG。其中EcoRⅠ和BamHⅠ的酶切位點(diǎn)分別添加在正向與反向引物的兩端。

以牛全基因組為模板擴(kuò)增TAK1基因,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收。在37℃水浴中用EcoRⅠ和BamHⅠ兩種酶分別對(duì)質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro和PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切,將得到的大分子量基因片段與TAK1酶切產(chǎn)物通過(guò)DNA ligase進(jìn)行重組連接。根據(jù)文獻(xiàn)制備化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞[9],并進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化獲取陽(yáng)性表達(dá)載體,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 慢病毒包裝 轉(zhuǎn)染24 h前,取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293 T細(xì)胞于15 mL培養(yǎng)皿進(jìn)行傳代培養(yǎng),待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。在試驗(yàn)前1～2 h需更換新鮮培養(yǎng)液,以減少對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的影響。使用無(wú)菌的1.5 mL EP管進(jìn)行試驗(yàn),轉(zhuǎn)染體系如下:A管成分穿梭質(zhì)粒15 μg,包裝質(zhì)粒復(fù)合物15 μg,P3000 30 μg,Opti-MEM 750 μg; B管成分Lipo3000 45 μg,Opti-MEM 750 μg。將A、B兩管試劑充分混合后轉(zhuǎn)移至提前準(zhǔn)備好的細(xì)胞中,放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)6 h后,換液繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后,收集細(xì)胞上清液,以4℃、1 600 r/min離心5 min,并通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾上清液,最后再96 000 r/min離心90 min,丟棄上上清液,收集沉淀即為病毒濃縮液。將其分裝保存于-80℃中。

1.2.3 慢病毒滴度測(cè)定 將HEK293T細(xì)胞在合適的條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,培養(yǎng)結(jié)束后對(duì)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),并將其轉(zhuǎn)移到96孔板中,每孔8 000個(gè)細(xì)胞,在37℃條件下培養(yǎng)12 h左右,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%時(shí)符合轉(zhuǎn)染試驗(yàn)要求。在轉(zhuǎn)染試驗(yàn)開(kāi)始前,將保存在-80℃的病毒液在冰盒上緩慢融化,以減少病毒的損失。將狀態(tài)良好的細(xì)胞接種在96孔板中,對(duì)制備的慢病毒進(jìn)行滴度測(cè)試。將不同梯度病毒稀釋液加至孔板中,過(guò)夜培養(yǎng);培養(yǎng)到第3天,棄去細(xì)胞孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液,換成100 μL新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng);培養(yǎng)至第5、第6天時(shí),借助熒光顯微鏡觀察96孔板中各病毒梯度處理的細(xì)胞熒光含量情況,通過(guò)統(tǒng)計(jì)表現(xiàn)熒光的細(xì)胞數(shù)量除以病毒稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度。

1.2.4 TAK1最佳轉(zhuǎn)染濃度篩選與過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建 對(duì)MDBK細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),為后續(xù)試驗(yàn)準(zhǔn)備。過(guò)表達(dá)試驗(yàn)分為慢病毒TAK1組、空病毒NC組、MDBK只加轉(zhuǎn)染試劑組、MDBK不做任何處理組。

感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)是細(xì)胞在感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值,通常MOI越高,整合到染色體上的病毒數(shù)量越多。MOI過(guò)低則達(dá)不到過(guò)表達(dá)效果,而MOI過(guò)高則會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài),因此探索合適的MOI對(duì)后續(xù)試驗(yàn)是十分重要的。將MDBK細(xì)胞接種在96孔板中,過(guò)夜培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到50%左右時(shí),換液加入1/2體積預(yù)混合適濃度的Polybrene培養(yǎng)基。根據(jù)公式MOI值=病毒滴度×病毒體積(mL)/細(xì)胞個(gè)數(shù),算出應(yīng)該加多少慢病毒。慢病毒和空載體對(duì)照病毒NC按照MOI為0、60、120、180、240、300分別進(jìn)行添加,慢病毒滴度為1×108TU/mL,加入慢病毒的體積分別為0、24、48、72、96、120 μL;空病毒滴度為5×108TU/mL,加入空病毒的體積分別為0、4.8、9.6、14.4、19.2、24 μL,混合均勻,試驗(yàn)重復(fù)3次,并且在37℃體積分?jǐn)?shù)為5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),4 h后添加余下培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),從加入病毒的時(shí)間開(kāi)始計(jì)算,24 h后換為含有1/2體積(50 μL)含有5 mg/L聚酰胺的培養(yǎng)基。感染病毒72 h后,借助熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞熒光表達(dá)效果進(jìn)行評(píng)判,達(dá)到80%比例的樣品對(duì)應(yīng)的MOI為最佳MOI值。

將MDBK細(xì)胞按照1×106個(gè)/孔接種至6孔板,待匯合率達(dá)到30%～50%時(shí),更換1/2體積含有5 μg/mL聚酰胺的完全培養(yǎng)基,按照MOI為180加入病毒進(jìn)行培養(yǎng),4 h后加入另一半培養(yǎng)基,24 h后對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行換液。感染72 h后,通過(guò)熒光顯微鏡統(tǒng)計(jì)熒光表達(dá)率,衡量目的基因的表達(dá)情況。確定熒光表達(dá)后,向穩(wěn)定表達(dá)目的基因的試驗(yàn)組和未作任何處理的對(duì)照組細(xì)胞株中添加3 μg/mL的嘌呤霉素,觀察到對(duì)照組細(xì)胞裂解完畢后,用含有3 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基對(duì)試驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行篩選。培養(yǎng)1～2周后,細(xì)胞幾乎無(wú)死亡現(xiàn)象,且在熒光顯微鏡下可觀察到試驗(yàn)組與對(duì)照組均有紅色熒光表達(dá),對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并保藏。隨后對(duì)保存的細(xì)胞進(jìn)行再次復(fù)蘇進(jìn)行培養(yǎng),傳至3～5代后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光觀察。重復(fù)上述試驗(yàn)3～5次,依舊在顯微鏡下可觀察到明顯的熒光表達(dá),且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,無(wú)明顯的形態(tài)學(xué)變化,則表明TAK1過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株制備成功。

1.2.5 Western blot檢測(cè)TAK1蛋白表達(dá)情況 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理,制備蛋白樣品。通過(guò)高效RIPA細(xì)胞裂解液對(duì)樣品進(jìn)行裂解,樣品在冰上裂解30 min,每5 min輕輕敲打一次,將處理的樣品收集到無(wú)菌離心管中。經(jīng)離心后,對(duì)樣品分裝保存,同時(shí)進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。根據(jù)文獻(xiàn)[10]使用標(biāo)簽蛋白MYC抗體及TAK1蛋白抗體分別對(duì)TAK1表達(dá)量進(jìn)行Western blot檢測(cè),通過(guò)AI600成像系統(tǒng)拍攝圖像,并用Image J圖像分析軟件對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 pCDH-CMV-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro載體表達(dá)的構(gòu)建

將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化后,挑取單克隆在37℃以220 r/min的條件下培養(yǎng)14 h后,提取質(zhì)粒,用BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定(圖1),構(gòu)建的重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果有兩個(gè)條帶,一條為1 790 bp,另一條為8 101 bp,與預(yù)計(jì)片段大小一致。然后將雙酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序(圖2),測(cè)序結(jié)果與參考序列一致,證明重組過(guò)表達(dá)載體pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro構(gòu)建成功。

圖2 目的基因測(cè)序結(jié)果

2.2 慢病毒制備及病毒滴度測(cè)定

將pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A- Puro質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,24 h后收集樣品,收獲含有TAK1基因的慢病毒。通過(guò)逐孔稀釋法對(duì)所獲得的病毒進(jìn)行滴度檢測(cè)。根據(jù)公式:病毒滴度=熒光細(xì)胞數(shù)目/相應(yīng)稀釋倍數(shù),計(jì)算得到TAK1過(guò)表達(dá)陽(yáng)性病毒滴度為1.0×108TU/mL,陰性對(duì)照病毒的滴度5.0×108TU/mL。

2.3 TAK1過(guò)表達(dá)最佳轉(zhuǎn)染濃度確定及MDBK穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株制備

TAK1過(guò)表達(dá)慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒分別以MOI量為60、120、180、240和300的劑量轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞,72 h后通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察紅色熒光的強(qiáng)度,結(jié)果顯示(圖3),MOI劑量為180時(shí)有較強(qiáng)的紅色熒光表達(dá),轉(zhuǎn)染效率可達(dá)80%以上,而當(dāng)MOI為240時(shí),熒光強(qiáng)度變?nèi)?可能是由于病毒量過(guò)大對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定影響。因此,選擇MOI為180的劑量作為轉(zhuǎn)染劑量,進(jìn)而篩選穩(wěn)定過(guò)表達(dá)TAK1的細(xì)胞株。用慢病毒感染狀態(tài)良好的MDBK細(xì)胞,病毒感染72 h后,加嘌呤霉素進(jìn)行篩選,以空白對(duì)照組所有細(xì)胞死亡為準(zhǔn)。經(jīng)嘌呤霉素篩選且反復(fù)凍存復(fù)蘇3～5次后,細(xì)胞生長(zhǎng)良好,無(wú)明顯形態(tài)學(xué)改變,能穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)紅色熒光的細(xì)胞則為TAK1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(圖4)。

圖3 不同MOI病毒轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞后熒光圖片(100×)

圖4 TAK1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株熒光圖片(100×)

2.4 TAK1蛋白表達(dá)檢測(cè)

用Western blot方法對(duì)3組細(xì)胞樣本進(jìn)行TAK1蛋白水平檢測(cè)(圖5),MYC標(biāo)簽抗體檢測(cè)TAK1蛋白(a)顯示過(guò)表達(dá)組在70 ku有一目的條帶,而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組中未檢測(cè)到該蛋白的表達(dá)。TAK1多克隆抗體檢測(cè)結(jié)果(b)顯示陰性對(duì)照組與空白組TAK1蛋白表達(dá)水平基本一致,而過(guò)表達(dá)組中TAK1蛋白表達(dá)量顯著上調(diào),由此表明TAK1過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功,且表達(dá)的蛋白能與購(gòu)買的多克隆抗體結(jié)合,說(shuō)明該蛋白具有良好的活性。

TAK1-MYC為TAK1基因過(guò)表達(dá)組,TAK1-NC為過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組;Blank為未作任何處理的MDBK細(xì)胞組;(a).MYC標(biāo)簽抗體檢測(cè)結(jié)果;(b).TAK1多克隆抗體檢測(cè)結(jié)果;(c).圖(b)的定量分析圖

3 討論

TAK1是一種高度保守的MAPK激酶,受到多種水平的修飾[11]。多種病毒都可以激活TAK1。如HIV1的VPR蛋白和糖蛋白gp41與TAK1結(jié)合并誘導(dǎo)TAK1磷酸化和激活[12]。在艾滋病患者體內(nèi),人類免疫缺陷病毒1型激活TAK1是NF-κB和有效復(fù)制病毒所必需的[13]。TAK1是EB病毒蛋白潛伏膜蛋白1(LMP1)誘導(dǎo)的JNK1激活所必需的,但對(duì)于NF-κB的激活是必不可少的[14]。人參皂苷Rg3通過(guò)降解TRAF6和TAK1以及通過(guò)阻斷HepG2細(xì)胞中JNK的激活來(lái)抑制乙型肝炎病毒復(fù)制[15]。其他研究表明,TAK1在單純皰疹病毒、仙臺(tái)病毒和RSV37-39激活NF-κB、p38和JNK過(guò)程中是必不可少的[16]。

另一方面,TAK1可以介導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子的多種細(xì)胞內(nèi)作用,如腫瘤壞死因子-α和白介素1-β(IL-1β)[17]。TAK1在上游信號(hào)從受體復(fù)合體到下游信號(hào)分子的通訊中是必不可少的[18]。如IL-1β與其受體IL-1R的結(jié)合導(dǎo)致與接頭蛋白MyD88的相互作用[19]。MyD88招募IRAK家族成員,進(jìn)而激活泛素E3連接酶TRAF6。泛素化的TRAF6與TAB和TAK1結(jié)合形成復(fù)合體,導(dǎo)致TAK1的激活。一旦激活,TAK1啟動(dòng)了一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),包括IKK復(fù)合體的激活,IκB的磷酸化和泛素化,以及NF-κB到核的移位[20]。

LncRNA-MSTRG.16919.1是在BHV-1感染MDBK細(xì)胞中經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出的新組裝的lncRNA,關(guān)于它的功能還知之甚少,并且在lncRNA-MSTRG.16919.1功能發(fā)揮的過(guò)程中TAK1是否參與其中也未見(jiàn)報(bào)道。為了探究TAK1在這一過(guò)程中發(fā)揮的作用,通過(guò)過(guò)表達(dá)TAK1基因的方式進(jìn)行探究。本文采用的pCDH-CMV-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro載體為慢病毒載體,其優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率較高,對(duì)細(xì)胞損傷較小,更有利于下游的試驗(yàn),在載體上選擇了帶有turboRFP紅色熒光標(biāo)簽和嘌呤霉素抗性雙重標(biāo)記的載體,通過(guò)紅色熒光的表達(dá)情況,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)情況判斷轉(zhuǎn)染是否成功,然后又通過(guò)嘌呤霉素抗性進(jìn)一步篩選表達(dá)有TAK1蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,達(dá)到最終的試驗(yàn)?zāi)康?。在?yàn)證TAK1是否表達(dá)方面,采用MYC標(biāo)簽抗體和TAK1抗體雙重驗(yàn)證TAK1蛋白的表達(dá),結(jié)果均顯示TAK1蛋白被成功表達(dá)。

綜上所述,TAK1慢病毒載體的構(gòu)建成功,篩選出TAK1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,并且TAK1蛋白成功表達(dá),為后續(xù)研究lncRNA-MSTRG.16919.1在BHV-1感染MDBK過(guò)程中的機(jī)制提供基礎(chǔ),并且為進(jìn)一步探究lncRNA、病毒及宿主之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。