外源糖對‘媚麗’葡萄酒發(fā)酵品質(zhì)的影響

謝琦，何媛，王婉妮，房玉林,2，鞠延侖*

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)合陽葡萄試驗示范站，陜西合陽 715300）

糖作為酒精產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)，與葡萄酒的感官品質(zhì)及其風(fēng)味有著密切關(guān)系[1]，添加不同種類和含量的外源發(fā)酵糖對葡萄酒的感官品質(zhì)和風(fēng)味有著不同程度的影響[2-3]。有研究表明，糖類的添加有助于乳酸菌進行同型乳酸發(fā)酵，以降低制品的pH，增加乳酸產(chǎn)量[4]。糖類還具有一定的護色作用，有利于促進紅色的生成，并降低亞硝酸鹽的殘余量，促使制品形成良好風(fēng)味[4]。不同種類糖用作培養(yǎng)基的發(fā)酵試驗說明，葡萄糖和果糖在進行發(fā)酵時能產(chǎn)生更多的揮發(fā)性物質(zhì)，從而產(chǎn)生更多風(fēng)味[5]。在葡萄酒發(fā)酵過程中葡萄糖的添加可改善植物香和果香，果糖和蔗糖的添加可改善青草香、花香、甜香和果香[6]。

葡萄果實中含有葡萄糖、果糖和少量的其他糖類物質(zhì)[7]，其中葡萄糖與果糖比值接近1∶1[8]。在葡萄酒發(fā)酵過程中，葡萄糖不僅作為釀酒酵母的碳源，也是酵母生長代謝的重要調(diào)節(jié)因子。在酒精發(fā)酵過程中，酵母細胞優(yōu)先利用葡萄糖，導(dǎo)致葡萄糖含量快速減少，葡萄糖/果糖的比值急劇下降，發(fā)酵結(jié)束時果糖含量遠高于葡萄糖。有研究表明，當(dāng)葡萄糖與果糖比值低于0.1時，發(fā)酵進程緩慢甚至終止[9]。

近年來，國內(nèi)外對于葡萄酒發(fā)酵中糖利用的研究多與提高酵母菌對果糖的利用率和添加不同外源糖對葡萄酒品質(zhì)影響有關(guān)，但是關(guān)于不同外源糖添加比例對酒體影響的研究未見報道。因此，本研究以西北農(nóng)林科技大學(xué)自育葡萄品種‘媚麗’為對象，于同一外界條件和釀造工藝下，在酒精發(fā)酵期間添加不同比例的葡萄糖和果糖，探究不同比例外源糖處理對葡萄酒品質(zhì)的影響。根據(jù)其理化指標(biāo)對不同處理組葡萄酒進行對比分析，優(yōu)選利于葡萄酒品質(zhì)的外源糖添加比例，為后續(xù)外源發(fā)酵糖的添加研究奠定理論基礎(chǔ)和提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料為‘媚麗’葡萄，2020年9月5日采摘于陜西省楊凌區(qū)曹新莊葡萄試驗園內(nèi)，總糖含量為199.5 g·L-1。

葡萄糖（D-Glucose 分析純）、蔗糖（食品級）購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；果糖（D-Fructose）購自北京索萊寶科技有限公司；CVE-7葡萄酒活性干酵母購自安琪酵母股份有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、乙酸乙酯、酒石酸鉀鈉、鄰苯二甲酸氫鉀等均為分析純，購自天津天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀為Agilent 7890 GC，質(zhì)譜儀選用Agilent 5975C Inert MSD（Agilent, Santa Clara, CA,USA）；Agilent 1100高效液相色譜儀（HPLC），美國安捷倫公司；UPLC I-Class儀、AP-9901S真空抽濾器，美國Autoscience公司；AS3120B超聲波脫氣機，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；R206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；5804R低溫冷凍離心機，北京酶阿查生物控股有限公司。

1.3 原酒發(fā)酵

原料進行分選與除梗破碎后，等量均勻地加入6個10 L的試驗用發(fā)酵罐中。補充43.5 g·L-1蔗糖調(diào)整原料至目標(biāo)酒度13.5%（Vol ）。按表1所示在發(fā)酵啟動后向各罐分別添加相應(yīng)的葡萄糖與果糖，其余所需糖量用蔗糖補齊，保持各罐總外源糖量為40 g （以葡萄糖計）。酒樣6作為對照組（CK）除蔗糖外不再加其他可發(fā)酵糖。分別向各罐內(nèi)添加SO260 mg·L-1，果膠酶40 mg·L-1。取部分葡萄汁加入活性干酵母在35 ℃活化后按200 mg·L-1接入發(fā)酵罐中?？刂茰囟仍?2～25 ℃進行浸漬發(fā)酵，每天進行溫度比重測量并壓帽3次。待比重穩(wěn)定至0.999以下時進行皮渣分離，自發(fā)啟動蘋果酸-乳酸發(fā)酵，待比重穩(wěn)定至0.994～0.996，還原糖降至4 g·L-1以下結(jié)束發(fā)酵，倒罐清除酒泥，添加60 mg·L-1SO2抑制有害菌的滋生，滿罐密封至冷庫進行儲存。

表1 酒樣品添加葡萄糖果糖量及比例Table 1 Proportion of added sugars in wine samples

1.4 理化指標(biāo)測定

酒精發(fā)酵期間，進行溫度、比重的測量，直至發(fā)酵終止。發(fā)酵啟動后的0、12、24、48、72 h五個時間節(jié)點取樣，參考《葡萄酒分析檢驗》[10]斐林試劑熱滴定法測量還原糖含量，酒精計法測量酒度。發(fā)酵結(jié)束后，按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中所描述的測定葡萄酒中酒精度、殘?zhí)橇俊]發(fā)酸（以醋酸計）、游離SO2等基本理化指標(biāo)。

1.5 單體酚測定

單體酚的測定參照前人的研究方法[11-14]并略作修改。吸取2 mL酒樣于離心管中，加入2 mL乙酸乙酯（分析純），漩渦振蕩30 s，4 ℃ 3500 r·min-1離心10 min，取上清液，重復(fù)萃取3次，合并上清液并于離心濃縮儀中蒸干后用2 mL甲醇溶解殘渣。0.22 μm過濾膜處理后置于-20 ℃的環(huán)境下保存，留作色譜分析。使用Agilent 1100高效液相色譜儀（HPLC）對樣品進行測定，每處理組取兩次平行，以去離子水做空白對照，分別精準(zhǔn)配制不同濃度梯度的14種單體酚混合標(biāo)樣，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品含量。

色譜柱條件如下：每次取樣量10 μL；Agilent 1100高效液相色譜儀（HPLC）色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；二極管陣列檢測器檢測波長280 nm；流速0.2 mL·min-1；柱溫30 ℃；波長為210～400 nm；流動相中A相為1%乙酸（1∶99，Vol）水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫程序：0～3 min，3%～6%B；3～7 min，6%～15%B；7～11 min，15%～30%B；11～13 min，30%B；13～15 min，30%～3%B。

1.6 花色苷測定

單體花色苷的測定參考前人的研究方法[15-16]并稍作修改。濾徑為0.22 μm的有機微孔濾膜對待測葡萄酒樣進行過濾，在高效液相色譜儀中直接進樣并檢測。精準(zhǔn)配制不同濃度梯度的8種單體花色苷標(biāo)樣，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品含量。單體花色苷的含量以二甲花翠素-3-葡萄糖苷計。

色譜條件：色譜柱采用BEH C18反相色譜柱（50 mm×2.1 mm，7 μm），柱溫為30 ℃。A流動相的體積比為甲酸∶水=10∶90；B流動相的體積比為乙腈∶甲酸=90∶10。洗脫程序：3%B，0～1 min；3%～15%B，1～12 min；15%～25%B，12～14 min；25%～30%B，24～28 min；30%～4%B，28～32 min；4%B，32～40 min；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長520 nm。

1.7 香氣物質(zhì)的測定

參考趙婷等[17]的研究方法，并稍作修改。準(zhǔn)確稱取1.00 g NaCl，加入5 mL待測酒樣品于15 mL 的樣品瓶中，加入磁力攪拌子（1 cm），室溫條件下萃取。之后加入10 μL內(nèi)標(biāo)物質(zhì)4-甲基-2-戊醇（4M2P，1.0083 g·L-1），迅速用隔熱蓋子擰緊，每個酒樣兩次重復(fù)。將樣品瓶放在磁力加熱攪拌臺上，40 ℃的平衡振動30 min（轉(zhuǎn)速1100 r·min-1），再將已經(jīng)活化好的萃取頭插入樣品的頂空部分，在40 ℃的條件下萃取30 min，然后去除萃取頭插入GC進樣口，在進樣口解析8 min，按照中國農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄與葡萄酒研究中心建立的葡萄酒香氣檢測方法進行檢測，每樣品兩個技術(shù)重復(fù)。

定性定量：未知化合物與NIST2014數(shù)據(jù)庫進行檢索匹配定性，用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)4-甲基-2-戊醇半定量計算各化合物含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019對所得數(shù)據(jù)進行整理，用SPSS 26.0進行方差分析及多重比較（P≤0.05），使用Graphpad 8.0.2 進行繪圖，并使用Origin 2021進行PCA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外源糖比例對發(fā)酵過程的影響

酒樣發(fā)酵周期為5 d，圖1為發(fā)酵啟動后5 d內(nèi)不同酒樣溫度、比重、還原糖、酒度變化情況。各酒樣在發(fā)酵期間均保持在22～27 ℃。在發(fā)酵中期（2～4 d），酒樣4、5溫度變化最為明顯，酒樣1、2溫度變化相對較小。發(fā)酵末期溫度變化順序為酒樣3＞酒樣4＞酒樣5。在啟酵后的12 h內(nèi)，還原糖下降速率基本持平。在所有酒樣中，下降速率由快到慢為：酒樣1（酒樣4）＞酒樣2（酒樣5）＞酒樣3（CK），各酒樣還原糖均在48 h降為0。

圖1 不同外源糖酒樣發(fā)酵期間的溫度、比重、還原糖、酒度變化Figure 1 Changes of temperature, specific gravity, reducing sugar and alcohol content during fermentation of different exogenous sugar wine samples

比重變化可反應(yīng)發(fā)酵進程。所有酒樣均在在啟酵后1～3 d內(nèi)比重變化最明顯，呈大幅度下降趨勢。在各酒樣中，在發(fā)酵前中期（1～4 d）酒樣1比重下降最快，酒樣5比重下降最慢，表明酒樣1中酒精生成速率最快，反之酒樣5酒精生成速率最慢。比重下降速率酒樣3＞酒樣4＞酒樣5，即在同等條件下，果糖比例越高發(fā)酵速率越慢。酒度變化規(guī)律與比重變化規(guī)律一致，即比重下降越快，酒度升高越快。綜上所述，葡萄糖含量越高則酒精發(fā)酵速率越快；果糖含量越高則對酵母菌抑制越大，從而導(dǎo)致酒精發(fā)酵速率減緩。

2.2 不同外源糖比例對葡萄酒理化指標(biāo)的影響

表2可知，酒樣1中還原糖顯著高于其他酒樣；隨著酒樣中葡萄糖/果糖比例不斷降低，揮發(fā)酸含量則隨之升高，酒樣5中揮發(fā)酸含量顯著高于其他酒樣；外源添加葡萄糖大于等于果糖的酒樣1～3最終酒度高于其他組。酒樣2和酒樣6中的游離硫顯著低于其他組，酒樣5中的總硫顯著高于其他組。造成此結(jié)果的原因可能與酵母菌對葡萄糖和果糖的利用率不同和酒樣中發(fā)酵糖的濃度有關(guān)。

表2 酒樣理化指標(biāo)Table 2 Physical and chemical indexes of wine samples

2.3 不同外源糖比例對酒中單體酚含量的影響

表3顯示，所有酒樣共檢測出黃烷-3-醇4種，酚酸6種，黃酮醇2種。在6組酒樣中，原花青素B1是主要的黃烷-3-醇物質(zhì)，顯著高于其他3種物質(zhì)，且以酒樣4含量最高，酒樣3含量最低；所有酒樣中的原花青素B2、兒茶素和表兒茶素含量的差異均不顯著。在黃烷-3-醇總含量中，酒樣4高于其他酒樣，酒樣3低于其他酒樣。

在所有酚酸物質(zhì)中，含量最高的分別是龍膽酸和沒食子酸。酒樣2酚酸總含量最高，酒樣5酚酸總含量最低。在酒樣1、2、4、5 和 CK中，酚酸物質(zhì)含量最高的均為沒食子酸，其中酒樣2沒食子酸含量最高，酒樣3沒食子酸含量最低；酒樣3中含有最多的酚酸物質(zhì)為龍膽酸。酒樣5中咖啡酸、原兒茶酸含量均為最低。酒樣4中咖啡酸、沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、反式阿魏酸均不同程度地高于CK，而龍膽酸含量略低于CK。

酒樣1與3、酒樣2與5中黃酮醇總含量無較大差距；酒樣3黃酮醇總含量最低，CK總含量最高。兩種黃酮醇物質(zhì)中，酒樣4中槲皮素含量最高，酒樣3中槲皮素含量最低。酒樣1、5和CK槲皮素含量無較大差距。CK蘆丁含量最高，酒樣1蘆丁含量最低，相比對照組下降69%。經(jīng)添加不同葡萄糖與果糖處理，各酒樣蘆丁含量以及黃酮醇總含量均較CK有所減少。

2.4 不同外源糖比例對葡萄酒花色苷含量的影響

6個酒樣中主要檢測出8種花色苷，分別為二甲花翠素-3-葡萄糖苷、花青素-3-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-葡萄糖苷、甲基花青素-3-葡萄糖苷、甲基花青素-3-(6-乙酰)-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-(6-乙酰)-葡萄糖苷、甲基花青素-3-(6-反式對香豆酰)-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-(6-反式對香豆酰)-葡萄糖苷。由圖2得出，與CK相比，各處理組酒樣花色苷含量均發(fā)生不同程度的上升。酒樣1花色苷含量變化最顯著，二甲花翠素-3-葡萄糖苷、花青素-3-葡萄糖苷、甲基花青素-3-葡萄糖苷的含量變化最為顯著。其中二甲花翠素-3-葡萄糖苷和甲基花青素-3-葡萄糖苷的含量增幅最大，分別為75.79%和92.89%。

圖2 不同葡萄糖/果糖比例影響下花色苷含量變化Figure 2 Anthocyanin content under different glucose/fructose ratio

本試驗表明，添加不同比例的葡萄糖/果糖對同一工藝下的葡萄酒中花色苷的含量產(chǎn)生影響。隨著葡萄糖含量的逐漸降低，酒樣1、2、3中花色苷總含量逐漸下降，由此表明葡萄糖對葡萄酒花色苷形成具有一定影響，葡萄糖含量越高，花色苷總含量越多。

2.5 不同外源糖比例對葡萄酒香氣物質(zhì)的影響

如表4中數(shù)據(jù)顯示，隨著原酒中果糖含量的逐漸增加，酒樣3～5中酯類物質(zhì)含量逐漸增加。酒樣2、3的醇類物質(zhì)含量顯著低于CK，即前兩者香氣復(fù)雜性小于CK[18]。在酒樣1～3中，隨著外源添加葡萄糖比例逐漸降低，所產(chǎn)生的醇類、烯類、醛類和酮類物質(zhì)總含量逐漸降低。在所有酒樣中，酒樣5中酯類、酸類、醛類和酮類物質(zhì)含量均明顯高于其他酒樣。酒樣5中的果糖含量最為豐富，說明果糖含量有利于葡萄酒中酯類、酸類、醛類、酮類物質(zhì)的生成。據(jù)香氣物質(zhì)檢出種類數(shù)可知，酒樣5各類香氣物質(zhì)種類數(shù)（64種）明顯多于CK（55種）與其他酒樣，更高的果糖比例可使葡萄酒含有更多種類呈香物質(zhì)，香氣更加豐富。

表4 不同葡萄糖/果糖處理下不同酒樣香氣物質(zhì)含量Table 4 The content of aroma substances in different wine samples under different glucose/fructose treatments

2.6 不同外源糖比例對葡萄酒影響的主成分分析

為了進一步描述添加不同葡萄糖與果糖比例對葡萄酒的影響，選取基本理化指標(biāo)、單體酚、花色苷和香氣物質(zhì)進行主成分分析（PCA），結(jié)果如圖3和圖4。主成分分析所得的前兩個主成分分別解釋了整體方差的32.1%（PCA1）和19.8%（PCA2），共描述了數(shù)據(jù)51.9%的差異性。不同組別較為分散，其中PCA2較好的區(qū)分外源糖添加比例，說明外源糖添加比例對于葡萄酒的影響具有顯著性。同一組別較為集中，實驗重復(fù)性良好。綜合PCA成分載荷圖和結(jié)果圖發(fā)現(xiàn)，與其他酒樣相比，酒樣5有機酸含量更加豐富，酒樣6（CK） 中蘆丁含量更加豐富，酒樣2含有更多的兒茶素和沒食子酸 。

3 討論

通過對發(fā)酵罐中酒樣的溫度、比重、還原糖和酒度的檢測發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖與果糖含量呈規(guī)律性變化的同時，其發(fā)酵進程和酒度生成情況也呈現(xiàn)一定規(guī)律。發(fā)酵末期溫度隨果糖比例增高而下降，可能為果糖和葡萄糖共用一套膜運輸和酶催化體系所致[19]，但果糖對膜運輸和酶的親和力均小于葡萄糖，因而酵母往往偏向利用葡萄糖[20-21]，對果糖的利用更為困難，故果糖比例越高，酵母細胞在發(fā)酵后期越不活躍。通過發(fā)酵監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖和果糖含量呈規(guī)律性變化的同時，酒樣的發(fā)酵進程和酒度生成也表現(xiàn)出一定的規(guī)律性。添加葡萄糖最多的酒樣糖度消耗最快，溫度上升速度及比重下降均為最快；反之，添加果糖最多的酒樣糖度消耗、溫度變化以及比重變化情況最慢。這是由于酵母菌利用葡萄糖的能力大于果糖，當(dāng)酒樣中葡萄糖濃度較高時，酵母菌活性增強，對糖度消耗速率加大，自身產(chǎn)能加快，因此發(fā)酵罐內(nèi)的溫度便會在短時間內(nèi)快速上升，酒精生成速率也隨之加快；由于酵母菌自身攝取果糖困難，在高果糖濃度的環(huán)境下，酵母菌攝食能力受到抑制，脅迫因素被放大，因此酵母菌產(chǎn)能效率急速下降。

酚類物質(zhì)是葡萄酒中最重要成分之一，其含量多少對葡萄酒的品質(zhì)有很大影響，其中黃烷-3-醇、酚酸和黃酮醇是酚類物質(zhì)的重要構(gòu)成成分，對葡萄酒的品質(zhì)起決定性作用。添加不同比例的葡萄糖/果糖對葡萄酒樣中黃烷-3-醇、酚酸和黃酮醇的含量存在一定影響。在葡萄酒味覺感官中，苦味主要來源于黃烷-3-醇[22]，本試驗中酒樣4的黃烷-3-醇含量明顯高于其他酒樣。已有研究表明，酚類物質(zhì)含量與葡萄酒的干澀強度呈正相關(guān)，其包括原花青素和兒茶素[23]，因此推測試驗酒樣3和酒樣5的干澀口感相對較弱。添加不同比例的葡萄糖-果糖的酒樣，黃烷-3-醇、酚酸和黃酮醇含量均發(fā)生不同程度的變化，酒樣4中酚類物質(zhì)的總含量、黃烷-3-醇含量最高，酒樣2中酚酸和沒食子酸含量最高，而對照酒樣中黃酮醇含量最高。葡萄酒中黃酮醇是花青素的輔色素，與苯乙烯酸以及黃烷醇均具有抗氧化、穩(wěn)定葡萄酒顏色的作用[24]，因此不加外源糖的酒樣較其他酒樣有更好的顏色穩(wěn)定性。

通過GC-MS對添加不同比例發(fā)酵糖的酒樣揮發(fā)性香氣物質(zhì)進行檢測，共檢測出64種揮發(fā)性物質(zhì)，其中包括酯類物質(zhì)45種，醇類物質(zhì)9種，酸類物質(zhì)4種，萜烯類物質(zhì)2種，醛類和酮類物質(zhì)各2種。分析表明，添加果糖量越多的酒樣中所產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物種類越多，且酯類、酸類、化合物種類均多于對照組。果糖含量越多，越有利于酯類、酸類、烯類、醛類、酮類物質(zhì)的形成。在所有酒樣中，酒樣5的果糖含量最高，產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物種類最多，多達62種。其中酯類、酸類、醛類、酮類物質(zhì)的含量均高于其他試驗組。表明添加不同比例葡萄糖與果糖對葡萄酒中香氣物質(zhì)的形成有很大影響，果糖含量越高，產(chǎn)生的風(fēng)味越復(fù)雜。果糖的存在能促進葡萄酒形成更加濃郁的風(fēng)味，這與趙旭[25]的研究相符合。

主成分分析基本理化指標(biāo)、單體酚、花色苷和香氣物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，不同的外源糖添加比例對于葡萄酒的影響具有顯著性。其中有機酸、蘆丁、兒茶素和沒食子酸含量對不同酒樣的區(qū)分貢獻較大，說明葡萄糖果糖添加比例對其有很大影響。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，葡萄酒中葡萄糖和果糖含量直接影響啟酵時間和發(fā)酵速度，較高的葡萄糖含量會加快酵母菌的代謝，而較高的果糖含量則會抑制酵母菌的生長活性。葡萄酒中的葡萄糖與果糖含量會影響葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)及非揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生，添加不同比例的葡萄糖與果糖對葡萄酒中黃烷-3-醇、酚酸和黃酮醇的含量存在一定影響。葡萄糖含量越高，花色苷總含量越高。果糖含量與葡萄酒中風(fēng)味物質(zhì)的形成有密切聯(lián)系，果糖含量越高，產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)種類及含量越豐富。當(dāng)添加葡萄糖與果糖比例為1∶3時，在降低葡萄酒苦澀口感的同時能提高花色苷含量，并產(chǎn)生更加復(fù)雜的香氣，對葡萄酒整體品質(zhì)的提高具有顯著作用。