禽腺病毒血清2 型分離鑒定及感染SPF 雞發(fā)病模型建立

胡鑫宇，孫敏華，曾慶航，謝梓民，袁朝霞，廖 明

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽流感等家禽重大疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）屬于腺病毒科（Adenoviridae）禽腺病毒屬（Aviadenovirus），是一種無囊膜的雙股DNA病毒。禽腺病毒屬Ⅰ群可根據(jù)病毒結(jié)構(gòu)特征分為5 個(gè)種（以A～E 表示），根據(jù)血清交叉中和反應(yīng)可分為12 種血清型（FAdV1～7、8a、8b、9～11）［1］。禽腺病毒Ⅰ群所有血清型均可引發(fā)包涵體肝炎（Inclusion body hepatitis，IBH）［2］，其中FAdV-4 被認(rèn)為是引發(fā)心包積液-肝炎綜合征（Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS）的特定病原，發(fā)病禽可見明顯的心包積液和肝炎、腎炎，致死率高，其流行給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大損失［3］。目前接種疫苗仍是FAdV 防控的有效手段［4］，但禽腺病毒Ⅰ群血清型較多，且不同血清型之間沒有或只有微弱的的交叉保護(hù)力［5］。FAdV-4 能夠中和FAdV-11，但不能中和 FAdV-8a 和FAdV-8b，F(xiàn)AdV-8a 和FAdV-8b 不能交叉中和，F(xiàn)AdV-8b 和FAdV-11 能夠相互中和［6］。研究FAdV 不同血清型的致病性可以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)禽腺病毒的危害，為科學(xué)有效防控奠定基礎(chǔ)。

【前人研究進(jìn)展】2007—2018 年調(diào)查表明，我國(guó)占據(jù)主導(dǎo)地位的禽腺病毒流行型為FAdV-4，其次為FAdV-8a、-8b、-11。近年來，同屬于FAdV-D 的FAdV-2、-8a、-8b、-11 在我國(guó)南方省份被分離發(fā)現(xiàn)的占比不斷上升［7-8］，其中FAdV-2 的分離率逐年上升。FAdV-2 已在中國(guó)、加拿大［9］、日本［10］和波蘭［11］等許多國(guó)家檢出，主要感染3～5 周齡肉雞，導(dǎo)致嚴(yán)重的IBH，平均死亡率為5%～10%［12］。目前，有關(guān)FAdV-2 的致病性尚不清楚，發(fā)病禽的病理變化等仍不明確。

【本研究切入點(diǎn)】通過對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)雞群健康狀況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，免疫過雞新城疫、禽流感（H9 亞型）、禽腺病毒病（I 群FAdV-4）三聯(lián)滅活疫苗的雞群出現(xiàn)死亡，剖檢可見典型的HHS 癥狀。該情況說明除FAdV-4 外可能還存在同樣能引發(fā)HHS 的病毒，因此對(duì)該病死雞的組織樣品進(jìn)行病毒分離鑒定，明確疑似腺病毒的血清型，并通過動(dòng)物回歸試驗(yàn)建立發(fā)病模型。

【擬解決的關(guān)鍵問題】FAdV-4 被認(rèn)為是導(dǎo)致HHS 癥狀的主要病原，其發(fā)病模型穩(wěn)定。為建立穩(wěn)定的FAdV-2 發(fā)病模型，本研究從HHS 發(fā)病雞組織樣品中分離出KM 株，對(duì)其基因序列進(jìn)行分析，通過比較不同攻毒途徑和不同攻毒劑量的致病性差異，篩選出建立發(fā)病模型的最佳攻毒途徑和攻毒劑量，并對(duì)發(fā)病評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證，為FAdV-2 的免疫原性評(píng)價(jià)和疫苗效果評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源 云南昆明某養(yǎng)殖場(chǎng)雞群出現(xiàn)不明原因死亡，剖檢可見肝炎、腎炎和心包積水等HHS 樣臨床癥狀。該養(yǎng)殖場(chǎng)雞群已經(jīng)免疫過兩次雞新城疫、禽流感（H9 亞型）、禽腺病毒病（I群FAdV-4）三聯(lián)滅活疫苗。為了明確導(dǎo)致此次疾病的病原，采集病死雞的肝臟、脾臟和腎臟樣本，冷藏保存，送至實(shí)驗(yàn)室檢查。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 6 周齡SPF 雞70 只，購(gòu)自北京梅里亞維通公司，于動(dòng)物隔離器中飼養(yǎng)。

1.1.3 試劑和引物 DMEM-F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；雞肝癌細(xì)胞（LMH 細(xì)胞）購(gòu)自廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司；DL2000 Marker、2×Taq Master Mix、磷酸緩沖溶液（PBS）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DNA 提取試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

參照文獻(xiàn)［13］設(shè)計(jì)FAdV 鑒定通用引物（上游引物5' CAARTTCAGRCAGACGGT 3'，下游引物5' TAGTGATGMCGSGACATCAT 3'，目的片段大小為897 bp）；將GenBank 登記的GX01 株作為參考序列，分別設(shè)計(jì)FAdV-2Fiber序列擴(kuò)增引物（上游引物5' ATGGCAAAATCGACTCCTTTC 3'，下游引物5' TTAGGGTTGTGTTAATTTATT 3'，目的片段大小約為1 700 bp）和FAdV-2Hexon序列擴(kuò)增引物（上游引物5' CGTCGCATGTGTTATTGACC 3'，下游引物5' GTCCCAGCCATTATAAGCAG 3'，目的片段大小約為3 000 bp）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 病毒分離鑒定

1.2.1 病原鑒定 將病死雞組織樣本置于研缽，研磨勻漿加PBS 后放入5 mL EP 管中，反復(fù)凍融3 次，5 000 r/min 離心5 min，按照Takara DNA 提取試劑盒說明書的操作步驟抽提上清液DNA 作為模板，用FAdV 通用引物進(jìn)行鑒定。PCR 體系為：2×Taq Master Mix 5 μL、FAdV 上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)預(yù)期條帶則視為樣本禽腺病毒陽(yáng)性。

1.2.2 病毒分離 取LMH 細(xì)胞生長(zhǎng)至密度達(dá)90%～95%的T25 細(xì)胞瓶，棄去瓶中培養(yǎng)基后加入無菌PBS，平鋪潤(rùn)洗后棄去洗液，重復(fù)2 次。加入經(jīng)孔徑0.22 μm 濾膜過濾后的1.2.1 陽(yáng)性樣本液200 μL 和 DMEM-F12 培養(yǎng)基300 μL，晃動(dòng)平鋪后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄接毒液后加入5 mL 含5% FBS 的DMEM-F12 培養(yǎng)基，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每天觀察，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)反復(fù)凍融后收獲。按照上述接毒方法盲傳3 代。

1.2.3 病毒鑒定 取盲傳3 代后的培養(yǎng)液，用DNA 提取試劑盒抽提病毒DNA，作為PCR 特異性擴(kuò)增的模板。PCR 體系和反應(yīng)程序按照1.2.1操作。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)預(yù)期條帶則送測(cè)序，并對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3 分離株KM 的Fiber 和Hexon 序列分析

以1.2.3 制備的病毒DNA 作為模板，分別用Fiber、Hexon引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 體系為：2×Taq Master Mix 25 μL、上下游擴(kuò)增引物各2 μL、模板DNA 2 μL、ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s、55 ℃ 50 s、72 ℃ 1 min 20 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)預(yù)期條帶則送測(cè)序。

在GenBank 中下載14 株禽腺病毒參考株（表1）的全基因組序列，利用MegAlign 軟件的Clustal W 方法將本研究的分離株KM 與參考株進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)和相似性分析，采用MEGA7.0軟件構(gòu)建核苷酸系統(tǒng)發(fā)育樹（算法NJ 鄰接法，Bootstrap 值設(shè)為500）。應(yīng)用生物軟件DNAStar中的Editseq 推導(dǎo)分離株的主要結(jié)構(gòu)基因Hexon和Fiber的氨基酸序列，并與 GX01 株相應(yīng)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。

表1 FAdV 代表毒株信息Table 1 Information of representative FAdV strains

表2 KM 株不同攻毒途徑發(fā)病統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics on the incidence of KM strain with different infection routes

1.4 KM 株擴(kuò)增及TCID50 測(cè)定

將KM 株F2代病毒液接種于T75 細(xì)胞瓶中孵育2 h，棄去接種液并用PBS 潤(rùn)洗2 次，37 ℃下觀察，出現(xiàn)80%以上病變則將細(xì)胞瓶置于-80℃下繁毒凍融3 次使病毒充分釋放，分裝，-80℃保存待測(cè)TCID50。將LMH 細(xì)胞鋪于96 孔板中，待其生長(zhǎng)至密度達(dá)85%～95%時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。用DMEM-F12 培養(yǎng)液將病毒液進(jìn)行10 倍稀釋，使病毒液濃度為原液的10-10～10-1，分別取100 μL接種于96 孔細(xì)胞板中，每個(gè)稀釋度8 個(gè)重復(fù)，第11 列為空白對(duì)照，第12 列為陽(yáng)性對(duì)照。置于37℃溫箱中孵育2 h 后棄去病毒液，加入含1% FBS的DMEM-F12 細(xì)胞維持液。將細(xì)胞板放入37 ℃培養(yǎng)箱中，觀察7 d，記錄病變孔數(shù)，按照 Reed-Muench 法計(jì)算病毒TCID50。

1.5 KM 株發(fā)病模型建立

1.5.1 KM 株純凈性檢測(cè) 分別用試劑盒抽提兩代感染毒KM 株病毒液中的DNA，并用常見的禽病病毒特異性檢測(cè)引物進(jìn)行PCR 特異性擴(kuò)增檢測(cè)，供檢測(cè)的病毒包括雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、減蛋綜合征病毒（EDSV）、禽支原體（MS/MG）、馬立克病病毒（MDV）、新城疫病毒（NDV）、傳染性法氏囊病毒（IBDV）、禽傳染性腦炎病毒（AEV）、禽呼腸孤病毒（ARV）、雞傳染性病病毒（CAV）、雞白血?。ˋLV）、傳染性支氣管炎（IBV）。PCR 體系為：2×Taq 5 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板1 μL、ddH2O 1 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃30 s、55℃ 30 s、72 ℃ 50 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min，PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.5.2 不同攻毒途徑的KM 株致病性分析 以F3代病毒作為感染毒，將30 只6 周齡SPF 雞隨機(jī)分成3 組（a、b、對(duì)照），每組10 只。對(duì)a、b組SPF 雞分別經(jīng)靜脈注射和肌肉注射兩種方式注射107.2TCID50的病毒液，空白對(duì)照組中5 只經(jīng)靜脈注射1 mL DMEM-F12（CK1），另外5 只經(jīng)肌肉注射1 mL DMEM-F12 培養(yǎng)基（CK2）。攻毒后3 組SPF 雞分別在隔離器中飼養(yǎng)，每天觀察并記錄雞群狀態(tài)。攻毒1、3、5、7 d 后用棉簽采集泄殖腔拭子，-80 ℃保存；攻毒7 d 后處死全部雞，剖檢觀察臟器病變情況，并采集心、肝、脾、腎組織樣品，-80 ℃保存。

1.5.3 不同攻毒劑量的KM 株致病性分析 以F3代作為感染毒，將40 只6 周齡SPF 雞隨機(jī)分成4組（A、B、C、對(duì)照），每組10 只。對(duì)A、B、C 組SPF 雞分別靜脈注射108.0TCID50、107.0TCID50和106.0TCID50病毒液，空白對(duì)照組（CK）靜脈注射1 mL 培養(yǎng)基。攻毒后4 組SPF 雞分別于隔離器中飼養(yǎng)，每天觀察并記錄雞群狀態(tài)。攻毒1、3、5、7 d 后用棉簽采集泄殖腔拭子保存于添加PBS的EP 管中，-80 ℃保存；攻毒7 d 后處死全部雞，剖檢觀察臟器病變情況，采集心、肝、脾、腎組織樣品，-80 ℃保存。

1.5.4 組織樣品核酸檢測(cè) 將心、肝、脾、腎組織樣品置于室溫下融化、研磨制成勻漿，置于5 mL EP 管中，加入3 mL 滅菌PBS，反復(fù)倒置混合均勻，放入-80 ℃冰箱中反復(fù)凍融3 次，5 000 r/min離心5 min，取上清液，用試劑盒抽提上清液中的核酸，PCR 體系和反應(yīng)程序同1.2.1，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5.5 泄殖腔拭子核酸檢測(cè) 將泄殖腔拭子于室溫中融化，用試劑盒抽提核酸，PCR 體系和反應(yīng)程序同1.2.1，將PCR 產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠中電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒鑒定結(jié)果

本研究分離的病毒盲傳3 代后，LMH 細(xì)胞出現(xiàn)CPE，表現(xiàn)為變圓、脫落（圖1），抽提核酸后經(jīng)PCR 鑒定（圖2）為禽腺病毒。經(jīng)測(cè)序并比對(duì)序列，所分離的病毒Hexon基因核苷酸序列與GX01 株相似度達(dá)99.64%，鑒定為禽腺病毒Ⅰ群D 種中的禽腺病毒血清2 型（FAdV-2），將該毒株命名為KM 株。

圖1 KM 株感染LMH 細(xì)胞引起的細(xì)胞病變Fig.1 LMH cell pathological changes after KM strain infection

圖2 FAdV-2 的PCR 鑒定Fig.2 Identification of FAdV-2 by PCR assay

2.2 KM 株Fiber 基因和Hexon 基因的進(jìn)化分析

采用MEGA 7.0 軟件的Clustal W 方法將KM株與5 個(gè)群共14 株FAdV 毒株的Fiber基因和Hexon基因核苷酸序列進(jìn)行分析。根據(jù)Fiber遺傳進(jìn)化樹（圖3A）來看，KM 株與國(guó)內(nèi)分離的FAdV-2 血清型GX01 株距離最近，同屬于禽腺病毒Ⅰ群D 種，與其他的A、B、C、E 群距離較遠(yuǎn)；根據(jù)Hexon遺傳進(jìn)化樹（圖3B）來看，KM 株與GX01 株距離也最近，同屬于禽腺病毒Ⅰ群D 種。

圖3 KM 株基于Fiber 基因（A）和Hexon 基因（B）的系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of KM strain based on Fiber gene (A) and Hexon gene (B)

采用MegAlign 對(duì)15 株FAdV 的Fiber和Hexon基因序列進(jìn)行核苷酸同源性分析，結(jié)果顯示，KM 株Fiber基因核苷酸序列與GX01、380、685、A-A2、HBQ12、SR48、SR49 病毒核苷酸序列同源性為71.8%～98.9%，其中與GX01 株同源性為98.9%，該8 株病毒同屬于禽腺病毒Ⅰ群D 種（圖4）；KM 株Hexon基因核苷酸序列與GX01、380、685、A-2A 病毒核苷酸序列同源性為79.9%～99.6%，與380、SR49、HBQ12 病毒核苷酸序列同源性為39.0%～39.1%，其中KM與GX01、685、SR48 病毒核苷酸序列同源性為97.8%～99.6%（圖5）。

圖5 KM 株Hexon 基因核苷酸序列同源性分析結(jié)果Fig.5 Homology analysis result of nucleotide sequence of Hexon gene from KM strain

利用DNAStar 中的Editseq 軟件將分離株KM的主要結(jié)構(gòu)基因Hexon和Fiber翻譯為氨基酸序列，采用MegAlign 對(duì)15 株FAdV 的Fiber 氨基酸序列和Hexon 氨基酸序列分別進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，KM 株Fiber 氨基酸序列與GX01、685、380、HBQ12 的同源性為94.8%～98.9%，其中與GX01 株的同源性最高、為98.9%（圖6）；KM 株Hexon 氨基酸序列也與GX01 株同源性最高、為98.8%，與685、SR48 同源性為33.1%和47.9%，表明KM 株與國(guó)外分離的毒株同源性較低（圖7）。

圖6 KM 株Fiber 氨基酸序列同源性分析結(jié)果Fig.6 Homology analysis result of the deduced amino acid sequence of Fiber from KM strain

圖7 KM 株Hexon 氨基酸序列同源性分析結(jié)果Fig.7 Homology analysis result of the deduced amino acid sequence of Hexon from KM strain

2.3 KM 株的TCID50 效價(jià)

分別記錄病毒液不同稀釋度（10-10～10-1）出現(xiàn)CPE 的孔數(shù)，計(jì)算每個(gè)稀釋度出現(xiàn)CPE 的占比，按照Reed-Muench 計(jì)算可得，KM 株F3代滴度為1×107.2TCID50/0.1 mL。

2.4 KM 株純凈性檢測(cè)

經(jīng)PCR 特異性擴(kuò)增后，凝膠電泳結(jié)果顯示KM 株未檢測(cè)到外源病毒可疑條帶，可見KM 株F3代 無ILTV、EDSV、MS/MG、MDV、NDV、IBDV、AEV、ARV、CAV、ALV、IBV 病毒污染。

2.5 不同攻毒途徑的KM 株致病性

a 組SPF 雞通過靜脈注射107.2TCID50KM 株，感染后2 d 出現(xiàn)排黃綠色稀糞、站立困難、食欲下降等臨床癥狀；攻毒3 d 后死亡1 只，5 d 后死亡1 只，死亡率為20%；7 d 后處死并剖檢每只雞，可見心包積液、肝臟腫大帶出血點(diǎn)、腎腫大等病理變化。b 組SPF 雞通過肌肉注射107.2TCID50KM株，感染后3 d 出現(xiàn)少許黃綠色稀糞，無食欲下降、趴臥不起等臨床癥狀，無死亡；攻毒7 d 后處死剖檢無發(fā)現(xiàn)肝炎、腎炎等癥狀。對(duì)照CK1、CK2的雞精神狀態(tài)良好，食欲正常，7 d 后處死剖檢無發(fā)現(xiàn)肝炎、腎炎等癥狀。

2.6 不同攻毒劑量的KM 株致病性

KM 株經(jīng)靜脈注射劑量為106.0TCID50（C 組）時(shí)，雞群未出現(xiàn)精神沉郁、排黃綠色稀糞等臨床癥狀，剖檢無發(fā)現(xiàn)心包積液、肝炎癥狀。靜脈攻毒劑量為107.0TCID50（B 組）時(shí)，在7 d 內(nèi)5 只SPF 雞出現(xiàn)精神沉郁、趴臥不起、羽毛凌亂、食欲下降等發(fā)病癥狀，但未出現(xiàn)雞只死亡的情況（表3），但剖檢可見3 只出現(xiàn)明顯肝炎、腎炎癥狀。靜脈攻毒劑量達(dá)108.0TCID50（A 組）時(shí)，10 只SPF 雞發(fā)病，出現(xiàn)黃綠色稀糞、精神不振、食欲下降等臨床癥狀，且在攻毒3 d 內(nèi)死亡2 只，攻毒后7 d 內(nèi)死亡5 只，死亡率為50%（表3）；剖檢可見明顯的心包積液、肝炎、腎炎癥狀，肌胃、腺胃無變化（圖8）；攻毒死亡的雞組織病理切片（圖9）顯示，心臟組織間隙增寬、心肌纖維增粗、間質(zhì)性水腫，肝臟炎性細(xì)胞和嗜堿性包涵體浸潤(rùn)，腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)充血；對(duì)照組雞的心臟、肝臟和腎臟組織病理切片顯示正常（表3）。為保證KM 株感染模型中同時(shí)存在發(fā)病和死亡的情況，選擇靜脈注射感染途徑為宜，感染劑量為108.0TCID50。

圖8 KM 株靜脈注射108.0 TCID50 死亡雞只的剖檢結(jié)果Fig.8 Necropsy examination of dead chickens infected with KM strain 108.0 TCID50 in intravenous route

表3 KM 株不同病毒劑量靜脈注射發(fā)病統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics on the incidence of KM strain by intravenous route at different doses

2.7 臟器組織核酸檢測(cè)

采集KM 株靜脈注射108.0TCID50死亡的5 只雞和攻毒7 d 后統(tǒng)一處死的5 只雞的肝臟、腎臟樣本，提取核酸并利用FAdV-2 特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均檢出大小符合預(yù)期的條帶，約897 bp（圖10），確認(rèn)為KM 株感染。

圖10 組織樣本的FAdV-2 PCR 核酸檢測(cè)Fig.10 PCR detection of FAdV-2 in tissue samples

2.8 泄殖腔拭子核酸檢測(cè)

A、B、C 試驗(yàn)組攻毒前泄殖腔拭子核酸檢測(cè)均無目標(biāo)條帶檢出，靜脈注射KM 株，攻毒后1 d的檢測(cè)結(jié)果顯示均有目標(biāo)條帶，攻毒后3～7 d 各組全部雞均檢出目標(biāo)條帶（表4）。

表4 泄殖腔拭子核酸陽(yáng)性率Table 4 Positive rate of cloaca swab nucleic acid

3 討論

我國(guó)是畜禽養(yǎng)殖大國(guó)，規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖業(yè)為社會(huì)帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益［14］。2015 年發(fā)現(xiàn)禽心包積液-肝炎綜合征［15］，2016 年各地均有病例報(bào)告。隨著對(duì)該病的認(rèn)識(shí)逐漸深入，以及各種疫苗、防控手段應(yīng)用，2019—2020年該病呈下降趨勢(shì)［16］。3～5 周齡的種雞和蛋雞是心包積液-肝炎綜合征最為易感的雞群，致死率為30%～90%［17］。FAdV-4 被認(rèn)為是引發(fā)心包積液-肝炎綜合征的特定病原［18］。本研究結(jié)果顯示，高劑量（108.0TCID50）的FAdV-2 經(jīng)靜脈感染也可引發(fā)心包積液-肝炎綜合征典型癥狀進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)物死亡，說明FAdV-2 對(duì)禽類養(yǎng)殖存在較大威脅，研發(fā)針對(duì)FAdV-2 的疫苗仍然是防控的第一選擇。

Xie 等［19］對(duì)FAdV-2 的致病性進(jìn)行研究，經(jīng)肌肉注射感染3 日齡和10 日齡SPF 雞后，試驗(yàn)雞雖無死亡，但出現(xiàn)明顯的體重下降。目前未有報(bào)道進(jìn)行過靜脈注射感染大日齡SPF 雞的致病性研究，無法明確在靜脈感染途徑下大日齡SPF 雞感染FAdV-2 的臨床癥狀。為驗(yàn)證不同攻毒途徑下FAdV-2 的致病性差異，本試驗(yàn)分別通過靜脈注射和肌肉注射107.2TCID50的病毒液，發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈注射107.2TCID50劑量，6 周齡SPF 雞出現(xiàn)死亡，剖檢可見心包積液和肝炎，死亡率為20%，對(duì)未死亡雞剖檢可見明顯病理變化。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、劑量選擇、發(fā)病癥狀通常是建立發(fā)病模型最為關(guān)鍵的參數(shù)。本研究在進(jìn)行不同攻毒劑量致病性試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)分別選擇108.0TCID50、107.0TCID50、106.0TCID503 個(gè)攻毒劑量，感染途徑為靜脈注射，結(jié)果表明，靜脈攻毒劑量達(dá)到107.0TCID50時(shí)，6 周齡SPF 雞出現(xiàn)黃綠色稀糞，無死亡，泄殖腔拭子攻毒后1 d 全部陽(yáng)性；攻毒劑量達(dá)到108.0TCID50時(shí)，試驗(yàn)雞死亡率達(dá)50%，剖檢可見明顯病理變化，泄殖腔拭子攻毒后1 d 全部陽(yáng)性。

本研究結(jié)合不同攻毒途徑和不同攻毒劑量致病性分析結(jié)果，建立了FAdV-2 KM 株感染6 周齡SPF 雞的發(fā)病模型：攻毒途徑為靜脈注射，劑量為108.0TCID50，試驗(yàn)雞可見黃綠色稀糞臨床癥狀，死亡率為50%，剖檢臟器可見明顯病理變化，攻毒1 d 內(nèi)泄殖腔排毒陽(yáng)性。本試驗(yàn)分別在感染途徑和感染劑量?jī)蓚€(gè)方面進(jìn)行了最優(yōu)劑量篩選，并通過動(dòng)物回歸試驗(yàn)驗(yàn)證了發(fā)病模型的結(jié)果。該發(fā)病模型證明FAdV-2 是引發(fā)心包積液-肝炎綜合征的病原之一。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功分離出1 株FAdV-2 野毒株，并將其命名為KM 株，通過生物信息學(xué)軟件對(duì)其Hexon和Fiber基因進(jìn)行遺傳演化分析，結(jié)果表明，KM 株與FAdV-2 GX01 株的同源性最高；此外，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析KM 株在不同感染途徑和不同感染劑量下對(duì)6 周齡SPF 雞的致病性，發(fā)現(xiàn)FAdV-2 也可以引發(fā)心包積液-肝炎綜合征并導(dǎo)致SPF 雞死亡，同時(shí)驗(yàn)證了靜脈注射途徑感染導(dǎo)致的發(fā)病嚴(yán)重程度高于肌肉注射。本研究建立了FAdV-2 KM 株感染SPF 雞的動(dòng)物發(fā)病模型，為研究FAdV-2的免疫原性和評(píng)價(jià)疫苗效果提供參考。