革蘭氏陰性病原菌外膜囊泡的生物學(xué)作用與機(jī)制研究進(jìn)展

李春玲，柯海意，徐民生，卞志標(biāo)，張昆麗，李 艷，翟少倫

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與獸醫(yī)生物技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東 廣州 510640；2.廣東省高州農(nóng)業(yè)學(xué)校，廣東 茂名 525000）

外膜囊泡（Outer membrane vesicles，OMV）是從革蘭氏陰性菌外細(xì)胞膜上以程序化方式自發(fā)性分泌而形成的球狀雙層膜納米結(jié)構(gòu)，于1967年由Chatterjee 等在體外研究霍亂弧菌（Vibrio cholera）細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)時(shí)首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道［1-2］，隨后在腦膜炎球菌感染的患者中觀察到OMV 的存在，表明OMV 在細(xì)菌發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。幾乎所有革蘭氏陰性菌均可在自然生長(zhǎng)過(guò)程中分泌OMV［3-4］。OMV 只有納米大小，直徑一般為20～250 nm 左右，外層為磷脂雙分子層，由于來(lái)自細(xì)菌外膜，因此其主要包括細(xì)菌外膜及周質(zhì)等細(xì)胞成分，包括膜脂質(zhì)、膜蛋白、脂多糖、肽聚糖以及分泌蛋白、毒力因子等，脂多糖是OMV雙層膜上的最主要成分；此外，也可能包含細(xì)胞內(nèi)成分，如胞內(nèi)蛋白、DNA、RNA 和酶等，其中多數(shù)為病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMP）和病原體特異性抗原，從而激活宿主的先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。OMV 的產(chǎn)量和組分變化可以很容易地通過(guò)其親本細(xì)菌的基因工程進(jìn)行修飾而實(shí)現(xiàn)，這使它們成為傳遞宿主或外源性抗原的理想載體。

OMV 可通過(guò)多種機(jī)制產(chǎn)生，包括外膜出泡、爆炸性細(xì)胞裂解和鼓泡細(xì)胞死亡等，早期被認(rèn)為是細(xì)菌的副產(chǎn)物，但越來(lái)越多的研究表明，OMV攜帶的蛋白質(zhì)、核酸等來(lái)自細(xì)菌的成分，可用于調(diào)控宿主細(xì)胞的免疫功能、水平轉(zhuǎn)移基因，以及細(xì)胞-細(xì)胞間通信等，OMV 還通過(guò)多種方式影響細(xì)菌和宿主的生存狀態(tài)，包括形成生物膜、掠奪營(yíng)養(yǎng)殺死競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手、提高細(xì)菌在群落和惡劣環(huán)境中的生存能力、調(diào)節(jié)宿主免疫、介導(dǎo)細(xì)菌通信和毒素釋放等［3-4］。因此，OMV 在病原菌致病過(guò)程中發(fā)揮多種生物學(xué)作用，其分子機(jī)制包括傳遞細(xì)菌毒力因子到宿主細(xì)胞［5］、傳播細(xì)菌耐藥基因［6-8］、中和噬菌體［9-10］、抑制其他細(xì)菌生長(zhǎng)［11］、作為誘餌保護(hù)細(xì)菌免受噬菌體捕食、躲避抗生素攻擊、觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路、抑制或減弱宿主的先天性免疫功能等［12-13］，因此，OMV 作為細(xì)菌的模擬物，可以通過(guò)與靶細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來(lái)抑制其親本病原體對(duì)宿主細(xì)胞的粘附和感染。

近年來(lái)OMV 的諸多生物學(xué)功能被逐漸發(fā)現(xiàn)而成為研究熱點(diǎn)。目前已報(bào)道的OMV 細(xì)菌包括病原菌和益生菌兩大類。在病原菌方面，主要集中研究與人類疾病相關(guān)的病原菌，包括與人類消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病等相關(guān)的病原菌。針對(duì)動(dòng)物病原菌OMV 的研究也有少量報(bào)道，包括副豬嗜血桿菌［14］、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌［15-17］、豬鏈球菌［18-19］、卡氏桿菌［20-23］。在植物病原菌中，OMV 同樣發(fā)揮重要作用，包括介導(dǎo)細(xì)菌與植物宿主之間的互作［24］、調(diào)控細(xì)菌毒力和宿主免疫反應(yīng)等［25-26］。本文綜述了病原菌來(lái)源OMV 的生物學(xué)作用，以及潛在的分子機(jī)制相關(guān)研究進(jìn)展，以期為OMV 的應(yīng)用提供參考。

1 OMV 在病原菌致病過(guò)程中的生物學(xué)作用

1.1 OMV 殺滅或抑制病原菌生長(zhǎng)

早在1996 年就有OMV 殺滅病原菌的相關(guān)報(bào)道。Kadurugamuwa 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，與自然分泌的OMV 相比，短期內(nèi)接觸慶大霉素的銅綠假單胞菌產(chǎn)生更多的OMV，而且產(chǎn)生的OMV 均含有幾個(gè)重要的毒力因子，能夠?qū)е缕渌?xì)菌發(fā)生崩解死亡。OMV 采用的另一個(gè)抗菌策略是基于親本細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)掠奪性，Schulz 等［28］研究證明了一種土壤掠食性細(xì)菌黃色黏球菌的OMV 能夠殺死大腸桿菌，在融合酶存在時(shí)該OMV 對(duì)大腸桿菌的抗菌活性增強(qiáng)，可提高親本細(xì)菌的生存機(jī)會(huì)，尤其在營(yíng)養(yǎng)不良的環(huán)境中，囊孢桿菌目毫毛種（Cystobacte velatus）Cbv34 菌株和堆囊菌亞種（Sorangiineae）SBSr073 菌株分泌的OMV 能夠顯著抑制大腸桿菌生長(zhǎng)，且抗菌水平與慶大霉素相當(dāng)。除了殺菌抑菌活性外，OMV 的抗真菌活性也有報(bào)道。產(chǎn)酶乳桿菌是真菌的捕食者［29］，溶酶桿菌C3 株產(chǎn)生的OMV 能直接抑制釀酒酵母和絲狀真菌鐮刀菌的生長(zhǎng)［30］。

1.2 OMV 直接導(dǎo)致疾病發(fā)生或病情加劇

OMV 在細(xì)菌感染介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和器官損傷的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，可同時(shí)向宿主細(xì)胞內(nèi)部傳遞多種毒力因子，使病原體無(wú)需與宿主細(xì)胞直接密切接觸即可與宿主相互作用，導(dǎo)致疫病發(fā)生；同時(shí)OMV 也被認(rèn)為是細(xì)菌攻擊宿主組織的“遠(yuǎn)程武器”，能幫助細(xì)菌病原體在其生物學(xué)生態(tài)位上定植、損害宿主細(xì)胞功能并調(diào)節(jié)宿主防御。

Fan 等［31］在大鼠上證實(shí)了分離的牙齦假單胞菌OMV 在體內(nèi)和體外都參與了牙周炎的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致大鼠的牙槽骨明顯被再吸收。OMV 在炎癥肺反應(yīng)和巨噬細(xì)胞促炎激活中具有更復(fù)雜的作用，各種類型的革蘭氏陰性菌釋放類似的OMV，促進(jìn)骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞的促炎激活；氣管內(nèi)滴注OMV 可誘導(dǎo)小鼠肺部出現(xiàn)顯著的炎癥反應(yīng)，OMV 既可以觸發(fā)表面蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路，也可以觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路；與脂多糖相比，OMV 在激活巨噬細(xì)胞方面發(fā)揮更強(qiáng)大的作用［32］；Natsui 等［33］使用小鼠肝來(lái)源細(xì)胞和小鼠肝硬化模型研究來(lái)自大腸桿菌的OMV 在小鼠肝硬化發(fā)病機(jī)制中的作用，結(jié)果顯示，在體外OMV 可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，包括C 型凝集素家族4 成員E（Clec4e）的上調(diào)，并抑制肝細(xì)胞白蛋白的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致肝臟炎癥增加。來(lái)自幽門螺桿菌的OMV 在體外可誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞出現(xiàn)胃炎樣表型［34］。綠膿桿菌OMV 中含有一種CIF（PA2934）的細(xì)菌毒素，它能減少CFTR介導(dǎo)的人呼吸道上皮細(xì)胞氯的分泌，從而減少病原體的粘液纖毛清除，降低氣道水合作用［35］。腸出血性大腸桿菌（EHEC）等腸道致病性大腸桿菌在實(shí)驗(yàn)室條件下以及感染期間產(chǎn)生OMV 并以其活性形式釋放，通過(guò)細(xì)胞分選過(guò)程運(yùn)輸?shù)狡涮囟ǖ募?xì)胞室，從而促進(jìn)細(xì)菌的致病性［36］。常見(jiàn)的胃病病原體幽門螺桿菌OMV 可以越過(guò)生物屏障到達(dá)大腦，這些OMV 被星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取，導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)元功能障礙，最終加劇認(rèn)知能力的下降。從發(fā)病機(jī)制上來(lái)看，是由于補(bǔ)體成分3(C3)-C3a 受體（C3aR）信號(hào)在腸道幽門螺桿菌OMV 存在時(shí)調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間的相互作用并發(fā)揮關(guān)鍵作用［37］。肺部生境中共生擴(kuò)張擬桿菌和普雷氏菌的OMV 通過(guò)Toll 樣受體-MyD88 接頭信號(hào)誘導(dǎo)IL-17B 的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)促纖維化的炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)來(lái)促進(jìn)肺纖維化等［38］。腸道中革蘭氏陰性細(xì)菌OMV 能導(dǎo)致腸屏障功能障礙［39］?？梢?jiàn)，OMV在病原致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

1.3 OMV 介導(dǎo)病原菌耐藥

攜帶碳青霉烯酶（KPC）的肺炎克雷伯菌OMV，在低濃度時(shí)能促進(jìn)綠膿桿菌對(duì)碳青霉烯的耐藥性突變、降解亞胺培南，保護(hù)敏感的綠膿桿菌抵抗亞胺培南的治療，表明OMV 賦予其他敏感菌獲得體內(nèi)外耐藥表型，是一種新型的抗生素耐藥性來(lái)源［40］。傷寒沙門氏菌中與OMV 生物發(fā)生相關(guān)基因突變可以釋放囊泡，從而提高保護(hù)細(xì)菌免受膜活性物質(zhì)侵害的能力，提取的OMV 以濃度依賴的方式保護(hù)傷寒沙門氏菌免受多粘菌素B（Polymyxin B,PMB）的傷害，這種突變體可以通過(guò)OMV 在功能上將耐藥性轉(zhuǎn)移到周圍的細(xì)菌，降低抗菌劑的有效濃度，并有利于在環(huán)境中選擇自發(fā)耐藥菌株［41］。浮游和生物膜來(lái)源的銅綠假單胞菌OMV 均可將質(zhì)粒編碼的抗生素耐藥性傳遞給受體銅綠假單胞菌，而生物膜來(lái)源的OMV攜帶更多的質(zhì)粒DNA，更加高效地將耐藥基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)菌中，使易感菌在抗生素治療期間依然能存活［42］；來(lái)自PMB 耐藥的鮑氏不動(dòng)桿菌OMV 促進(jìn)了生物膜的形成，可以保護(hù)敏感菌免受PMB 破壞，用PMB 處理的梅隆格氏桿菌感染模型表明，OMV 通過(guò)保護(hù)鮑曼不動(dòng)桿菌免受PMB感染而增加了幼蟲(chóng)的死亡率［43］。

1.4 OMV 作為誘餌保護(hù)親本菌逃避噬菌體或抗生素等外來(lái)攻擊

OMV 具有與親本菌外膜基本相同的膜成分，當(dāng)外膜受攻擊時(shí)，OMV 可以作為潛在的誘餌，將攻擊轉(zhuǎn)離親本細(xì)菌。例如，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌OMV 可以快速且不可逆地與T4 噬菌體結(jié)合，從而使親本細(xì)菌有效逃避攻擊［44］?；魜y弧菌分泌OMV 作為一種防御機(jī)制，賦予其免受噬菌體捕食的能力，并且這種OMV 介導(dǎo)的抑制依賴于噬菌體受體［44］。在耐β-內(nèi)酰胺的大腸桿菌OMV 中已發(fā)現(xiàn)孔蛋白和β-內(nèi)酰胺酶，并可能通過(guò)β-內(nèi)酰胺類抗生素的水解參與敏感菌株在抗生素存在下的生存，孔蛋白OMPC 和OMPF 允許β-內(nèi)酰胺類抗生素滲透到OMV 的管腔，從而被β-內(nèi)酰胺酶降解，揭示了OMV 在細(xì)菌防御機(jī)制中的重要作用［45］。Zhu 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，只分泌ApxII 和ApxIII 毒素的豬胸膜肺炎放線桿菌血清8型臨床分離株（MIDG2331 株）自發(fā)釋放的天然OMV，可抑制豬肺泡巨噬細(xì)胞在滅活或活親本菌刺激下的先天免疫反應(yīng)，在疫苗配方中添加OMV能顯著提高免疫動(dòng)物對(duì)ApfA 和VacJ 的特異性IgG 效價(jià)，證實(shí)OMV 具有佐劑活性，但產(chǎn)生的抗體應(yīng)答并不能對(duì)胸膜肺炎放線桿菌感染提供有效保護(hù)。

2 OMV 發(fā)揮生物學(xué)作用的分子機(jī)制

2.1 OMV 作為生物穿梭系統(tǒng)水平轉(zhuǎn)移病原菌和宿主細(xì)胞的功能分子

Bittel 等［46］將重組表達(dá)Cre -重組酶的大腸桿菌導(dǎo)入Rosa26 小鼠，利用Cre-LoxP 系統(tǒng)在體內(nèi)報(bào)告了細(xì)菌OMV 向受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，將這些大腸桿菌定殖于小鼠的腸道后，導(dǎo)致沿腸上皮細(xì)胞（包括腸干細(xì)胞和粘膜免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞）中Cre-重組酶誘導(dǎo)的熒光報(bào)告基因表達(dá)。此外，細(xì)菌來(lái)源的Cre 在廣泛的宿主組織（包括心臟、肝臟、腎臟、脾臟和大腦）中誘導(dǎo)擴(kuò)展標(biāo)記基因表達(dá)［47］。Rueter 等［36］研究發(fā)現(xiàn)，腸出血性大腸桿菌EHEC O157 型大腸桿菌臨床分離株OMV 攜帶志賀毒素2a（Stx2a）、細(xì)胞致死膨脹毒素V（CdtV）、EHEC 溶血素和鞭毛蛋白等一系列關(guān)鍵毒力因子，這些毒素借助OMV 通過(guò)動(dòng)力依賴性內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，并在胞內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程中采用不同方式與囊泡分離，其中Stx2a 和CdtVB 在早期核內(nèi)體中與OMV 分離，Stx2a 與其受體?；拾按既禾且黄鸨晦D(zhuǎn)運(yùn)到高爾基復(fù)合體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，催化成Stx2a A1 片段后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中；CdtV-B 逆行至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核到達(dá)DNA，而CdtV-A 和CdtV-C 亞基仍然與OMV 一起在溶酶體內(nèi)。EHEC 溶血素從溶酶體OMV 中分離并靶向線粒體。OMV 釋放的CdtV-B 引起細(xì)胞DNA 損傷，激活DNA 損傷反應(yīng)，導(dǎo)致G2 細(xì)胞周期阻滯。Stx2a 和CdtV 通過(guò)Caspase-9 激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。產(chǎn)酶乳桿菌能產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)的抗菌化合物，如熱穩(wěn)定抗真菌因子（HSAF）及其類似物。產(chǎn)酶基因OH11 中存在一個(gè)基因LeLPMO10A，該基因編碼一種溶血型多糖單加氧酶且共定位于OMV 中，去除LeLPMO10A后，OH11 細(xì)胞在菌絲表面形成球形小泡，附著在菌絲上的細(xì)胞數(shù)減少［29］。這種抑制作用依賴于OMV 與細(xì)胞之間的物理接觸，OMV 介導(dǎo)抗真菌活性分子的轉(zhuǎn)移［30］。

2.2 OMV 作為病原菌小分子代謝物結(jié)合到宿主體內(nèi)的通道

使用非靶向高覆蓋率代謝組學(xué)方法，Bryant等［47］在體外條件下對(duì)比測(cè)量了多形擬桿菌OMV的小分子含量，以確定這些代謝物被包裝到這些囊泡中可能發(fā)揮的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一組高度保守的核心小分子被多形擬桿菌包裝進(jìn)OMV，這些小分子富含小鼠可消化的代謝物，以及與小鼠GIT定植相關(guān)的代謝物。可見(jiàn)，通過(guò)親密共生進(jìn)化，由多形擬桿菌產(chǎn)生的OMV 已被用作小分子結(jié)合到哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)的通道。牙齦假單胞菌OMV在體外被人牙周韌帶細(xì)胞（hPDLCs）攝取，隨后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和炎性細(xì)胞因子釋放，這一過(guò)程是由OMV 中的sRNA45033 完成的。Fan 等［31］對(duì)牙齦假單胞菌OMV 進(jìn)行生物信息學(xué)分析和靶基因篩選，確定5 號(hào)染色體框（CBX5）為sRNA45033的下游靶基因，并證實(shí)sRNA45033 靶向CBX5 調(diào)控hPDLC 的凋亡，這些結(jié)果表明牙齦假單胞菌與牙周炎發(fā)展過(guò)程相關(guān)，并與細(xì)菌的毒力有關(guān)。Ryu 等［32］利用TLR4 基因敲除細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)OMV比脂多糖對(duì)激活巨噬細(xì)胞發(fā)揮更強(qiáng)大的作用，OMV 觸發(fā)S100-A8 蛋白介導(dǎo)的通路，強(qiáng)烈誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞促炎活化和炎性肺反應(yīng)。

2.3 OMV 介導(dǎo)耐藥基因水平轉(zhuǎn)移

OMV 介導(dǎo)的耐藥基因水平轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是偶聯(lián)、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)3 種傳統(tǒng)機(jī)制以外的一種水平傳播新機(jī)制。blaCTX-M-15基因編碼腸桿菌科細(xì)菌中最常見(jiàn)的CTX-M 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL），大腸桿菌O104:H4 OMV 將blaCTX-M-15、blaTEM-1和 相關(guān)的質(zhì)粒pESBL 轉(zhuǎn)移到不同種類的腸桿菌科，在模擬腸內(nèi)條件和環(huán)丙沙星應(yīng)激下，OMV 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移頻率顯著增加，接受了攜帶pESBL 的blaCTX-M-15和blaTEM-1的受體菌獲得了對(duì)頭孢噻肟、頭孢他啶和頭孢泊肟的耐藥性［10］。高致病性肺炎克雷伯菌產(chǎn)生的OMV 可以將毒力基因和耐藥基因水平轉(zhuǎn)移到產(chǎn)生ESBL 的低毒力肺炎克雷伯菌上，從而產(chǎn)生抗微生物的高毒力轉(zhuǎn)化菌，而且轉(zhuǎn)化菌在體內(nèi)外均表現(xiàn)出耐藥性和高毒力［48］。Wang 等［49］對(duì)兩株具有超強(qiáng)毒力或碳青霉烯耐藥特性的肺炎克雷伯菌HvK2115 株和CRK3022 株的OMV 進(jìn)行純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OMV 中攜帶毒力或抗性基因，對(duì)其水平轉(zhuǎn)播能力分析結(jié)果表明，OMV 可介導(dǎo)毒力質(zhì)粒phvK2115（來(lái)自HvK2115 株）在種內(nèi)和種間水平轉(zhuǎn)移；OMV 可同時(shí)將兩個(gè)耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)入肺炎克雷伯菌和大腸桿菌受體菌株，OMV 介導(dǎo)的毒力質(zhì)粒phvK2115 水平轉(zhuǎn)移可顯著增強(qiáng)人耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌CRK3022 的致病性，而且由于OMV 介導(dǎo)的水平轉(zhuǎn)移導(dǎo)致肺炎克雷伯菌毒力基因和碳青霉烯耐藥基因共存，從而產(chǎn)生對(duì)碳青霉烯耐藥的超強(qiáng)毒力肺炎克雷伯菌。Chatterjee等［50］通過(guò)采用密度梯度法分離和純化攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)的blaNDM-1和aac(6')-Ib-cr基因、對(duì)碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌株。從OMV 中提取DNA，用于PCR 反應(yīng)和斑點(diǎn)雜交分析，研究β內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaNDM-1 通過(guò)鮑曼不動(dòng)桿菌A-115 釋放OMV 的傳播能力，結(jié)果顯示OMV 可介導(dǎo)耐藥基因blaNDM-1和aac(6')-Ib-cr轉(zhuǎn)移到鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606 和E.ColiJM109 受體細(xì)胞中，且能夠顯著提高轉(zhuǎn)化子的MIC值。有些細(xì)菌（如副雞禽桿菌）OMV 傳播的抗生素耐藥基因（ARGs）只暫時(shí)性出現(xiàn)在受體菌中，經(jīng)過(guò)傳代后即行丟失，不能長(zhǎng)期存在［6］，其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

2.4 OMV 介導(dǎo)病原菌逃避宿主天然免疫

2.4.1 抵抗宿主防御素 宿主防御素（Host defense peptide,HDP）是先天免疫系統(tǒng)的一部分，HDP 及其衍生的抗菌素由于低耐藥性，具有強(qiáng)大的抗菌活性和替代抗生素的潛力。但有研究發(fā)現(xiàn)，亞致死濃度的HDP 增加了大腸桿菌OMV 的釋放，顯著提高了這些細(xì)菌對(duì)抗生素的最低殺菌濃度，提示細(xì)菌通過(guò)釋放OMV 處理被HDP 影響的細(xì)胞膜，OMV 作為HDP 的誘餌保護(hù)細(xì)菌，成為細(xì)菌抵抗宿主HDP 的潛在機(jī)制。但并非所有細(xì)菌都采用這種防御機(jī)制，添加從HDP 處理的細(xì)菌上清液中分離純化的OMV 或熱處理的OMV 也能保護(hù)大腸桿菌免受PMAP-36、CATH-2 和LL-37 的殺傷［51］。

2.4.2 抑制補(bǔ)體系統(tǒng)功能 補(bǔ)體系統(tǒng)為機(jī)體抵抗任何入侵的病原微生物提供了強(qiáng)大的第一道免疫防線。因此，許多病原體已經(jīng)進(jìn)化出各種各樣的防御機(jī)制，以自我保護(hù)免受補(bǔ)體系統(tǒng)可溶性分子及其攻擊復(fù)合物的侵害。Dehinwal 等［52］研究發(fā)現(xiàn)，腸道沙門氏菌OMV 可作為補(bǔ)體陷阱，并通過(guò)招募補(bǔ)體抑制因子H 使宿主細(xì)胞C3b 失活。

2.4.3 激活或抑制炎性體通路 大腸桿菌OMV作為介導(dǎo)脂多糖LPS 胞質(zhì)定位的載體，在被網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用攝取后，將LPS 遞送到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，LPS 從早期內(nèi)吞區(qū)室轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，激活胞質(zhì)中的LPS 感應(yīng)通路，進(jìn)而激活促炎LPS 傳感器caspase-11，最后導(dǎo)致細(xì)胞焦亡和caspase-1 激活［53］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白（Guanylate binding proteins,GBP）是OMV 激活胞質(zhì)caspase-11 所必需的宿主因子，GBP 參與調(diào)控OMV 介導(dǎo)炎癥［54］。由臨床分離的霍亂弧菌El Tor 生物型產(chǎn)生的OMV 很容易被人類腸道細(xì)胞系通過(guò)小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用攝取，將具有生物活性的霍亂毒素遞送到腸上皮細(xì)胞，由于OMV 相關(guān)霍亂毒素不被腸道蛋白酶降解，因此可在腸道中持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間并保持毒素活性［40］。由致病性大腸桿菌分泌的OMV 則通過(guò)破壞自噬體-溶酶體融合抑制巨自噬/自噬流，從而阻止酸性自噬溶酶體的形成和自噬體清除。此外，OMV 更容易激活非經(jīng)典炎癥小體通路，加劇致病性［55］。

具核梭桿菌Fusobacterium nucleatum釋放的OMV 通過(guò)Toll 樣受體4（TLR4）刺激結(jié)腸上皮細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子（TNF），也刺激人結(jié)腸單層分泌TNF、p-ERK、p-CREB，活 化NF-κB［56］。OMV 可誘導(dǎo)人單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、小鼠骨髓來(lái)源的DC 和CD11c+脾臟DC 的成熟。OMV 誘導(dǎo)的DC 成熟依賴于LPS 和Toll 樣受體信號(hào)通路下游的髓樣分化初級(jí)反應(yīng)蛋白88（MyD88）接頭蛋白的存在。重要的是，OMV 沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡/細(xì)胞死亡，而是提供了一個(gè)在DC 內(nèi)的顯著生存優(yōu)勢(shì)。OMV 誘導(dǎo)BMDC 和脾臟CD11c+DC 向OTI CD8+T 細(xì)胞強(qiáng)效交叉呈遞，這依賴于MyD88；而OMV 誘導(dǎo)的交叉呈遞僅部分依賴于CD8a+交叉呈遞DC 亞群。

OMV 還通過(guò)sRNA 介導(dǎo)并抵消宿主的促炎免疫反應(yīng)。Koeppen 等［48］使用RNA-Seq 研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌OMV 中含有不同包裝的sRNA，sRNA 向人氣道細(xì)胞轉(zhuǎn)移，其中sRNA52320 是銅綠假單胞菌蛋氨酸t(yī)RNA 的一個(gè)片段，在OMV 中含量豐富，可減少由LPS 或OMV 誘導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞分泌IL-8，減弱OMV 誘導(dǎo)的小鼠肺KC細(xì)胞因子分泌和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，表明OMV 中的sRNA52320 是宿主-病原體相互作用、降低宿主免疫反應(yīng)的新機(jī)制。牙齦卟啉桿菌OMV 中的小RNA（msRNA）sRNA45033 靶向5 號(hào)染色體盒（CBX5），CBX5 通過(guò)p53 DNA 甲基化調(diào)控細(xì)胞凋亡［31］，放線共生放線桿菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans,Aa）的OMV 能把自身攜帶的小RNA 加載到宿主RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中，從而調(diào)節(jié)宿主靶基因轉(zhuǎn)錄，揭示微生物OMV衍生的小RNA 在宿主基因調(diào)控中的細(xì)胞質(zhì)傳遞和活性。這些小RNA 通過(guò)TLR-8 和NF-κB 信號(hào)通路促進(jìn)TNF-α 產(chǎn)生，對(duì)小鼠心內(nèi)注射Aa OMV，OMV 經(jīng)血腦屏障后成功遞送至大腦，小RNA 增加了小鼠大腦中TNF-α 的表達(dá)，表明OMV 的microRNA 調(diào)控宿主基因是一種新的宿主基因調(diào)控機(jī)制［52］。

2.5 其他機(jī)制

OMV 可以將自溶素遞送到其他細(xì)菌中，通過(guò)水解其他細(xì)菌細(xì)胞壁的最基本成分并維持高細(xì)胞內(nèi)滲透壓使其他細(xì)菌崩解死亡。在營(yíng)養(yǎng)不良的環(huán)境中，含有蛋白酶、磷酸酶和其他水解酶等多種酶的OMV，在融合酶存在時(shí)與靶細(xì)胞融合，利用所承載的多種活性酶（水解酶）和次生代謝產(chǎn)物殺死大腸桿菌，提高親本細(xì)菌的生存機(jī)會(huì)。有些OMV 通過(guò)存在于其中的細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑（囊狀桿菌胺）發(fā)揮抑制其他細(xì)菌生長(zhǎng)的作用［28］。在限制霍亂弧菌感染和霍亂傳播方面，OMV 作為一種防御機(jī)制，為霍亂弧菌提供保護(hù)，使其免受噬菌體捕食，并且這種OMV 介導(dǎo)的抑制依賴于噬菌體受體。噬菌體治療或預(yù)防應(yīng)該考慮到OMV 的產(chǎn)生，作為一種可能影響噬菌體治療結(jié)果的細(xì)菌誘餌機(jī)制，OMV 表面被動(dòng)的釋放過(guò)程有助于噬菌體防御。研究OMV 抵抗3 種強(qiáng)毒噬菌體ICP1、ICP2 和ICP3 對(duì)霍亂弧菌的感染，結(jié)果證明OMV 可作為天然誘餌保護(hù)細(xì)菌免受噬菌體侵食［44］。Ma 等［57］探討小腸結(jié)腸炎耶爾森菌OMV 對(duì)生物被膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)OMV 抑制了小腸結(jié)腸炎耶爾森菌生物膜的形成，但不影響小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的生長(zhǎng)。此外，OMV 對(duì)腸炎沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的生物被膜也有抑制作用。隨后證實(shí)，OMV 中的脂多糖LPS 能抑制生物膜形成，LPS 對(duì)多種細(xì)菌表現(xiàn)出良好的抗生物被膜活性；而OMV 中的蛋白質(zhì)、DNA 或RNA 不能抑制生物膜形成。細(xì)菌運(yùn)動(dòng)和生物被膜相關(guān)基因pgaABC、motb和f lhBD的表達(dá)被內(nèi)毒素抑制。

3 展望

OMV 獨(dú)特的納米結(jié)構(gòu)、組成以及在病原菌致病過(guò)程中的生物學(xué)作用等賦予了其在細(xì)菌病治療、疫苗抗原等多方面的應(yīng)用前景，包括作為藥物和疫苗抗原遞送工具及直接用作抗生素非依賴的抗菌藥物和疫苗抗原。在細(xì)菌病防治方面，OMV 所具有的遞送復(fù)雜細(xì)胞大分子的獨(dú)特能力使其可作為抗生素遞送載體。OMV 有望成為針對(duì)防治細(xì)菌感染更有效的功能化抗生素輸送系統(tǒng)，以及不依賴抗生素的抗菌藥物，應(yīng)用于細(xì)菌病感染的治療［7,58］。例如，針對(duì)危害人畜健康的豬鏈球菌病等，以工程菌OMV 為抗生素載體，基于OMV 突破血腦屏障的特性，將顯著提高抗生素對(duì)腦炎型細(xì)菌病的治療效果。

OMV 由于其天然的抗原性和良好的生化特性，顯示出作為疫苗的巨大潛力，OMV 已被應(yīng)用于血清B 型腦膜炎奈瑟菌疫苗的研發(fā)，該疫苗對(duì)多種腦膜炎球菌B 株具有廣泛的保護(hù)作用［59］；來(lái)自丁香假單胞菌和熒光假單胞菌的OMV 激活植物的免疫反應(yīng)，保護(hù)植物免受細(xì)菌和卵菌病原體的侵害。重要的是，OMV 介導(dǎo)的植物免疫反應(yīng)不同于由保守的細(xì)菌表位或單獨(dú)的效應(yīng)分子觸發(fā)的反應(yīng)［60］。制備細(xì)菌OMV 包覆的載卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米載體，并經(jīng)小鼠鼻腔免疫，發(fā)現(xiàn)該納米給藥系統(tǒng)能同時(shí)使OMV 和OVA 被攝取與呈遞,產(chǎn)生較強(qiáng)的小鼠黏膜免疫誘導(dǎo)反應(yīng)［61］。以細(xì)菌OMV 結(jié)合三嵌段聚合物普朗尼克F127(PEO100-PPO65-PEO100),該載體能夠有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌抗腫瘤細(xì)胞因子,具有免疫調(diào)節(jié)作用［62］。兔波氏桿菌OMV 包含多種與該菌毒力和感染機(jī)制有關(guān)的蛋白質(zhì)［63］。副豬嗜血桿菌病、豬傳染性胸膜肺炎、鴨疫里默氏桿菌病、雞白痢等，是目前在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中流行廣泛、危害嚴(yán)重的病原菌，這些細(xì)菌血清型眾多，相互之間缺少有效的交叉保護(hù)，因此，開(kāi)展相關(guān)病原的OMV 疫苗研發(fā)，將有望實(shí)現(xiàn)這些疫病的綠色高效防控。未來(lái)在OMV 抗原及疫苗產(chǎn)量、安全性和免疫周期方面仍需進(jìn)一步改進(jìn)和發(fā)展。例如，可通過(guò)基因編輯技術(shù)、合成生物學(xué)方法，用外源抗原修飾OMV 等，以提高OMV 的產(chǎn)量和安全性，此外，應(yīng)用噬菌體治療或預(yù)防應(yīng)考慮到OMV 的產(chǎn)生是一種可能影響噬菌體治療效果的細(xì)菌誘餌機(jī)制。