微小RNA-203b-3p調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的分子機(jī)制研究

薛 靜, 郭 博, 胡 玲, 付 杏

(海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心, 1. 檢驗(yàn)科, 2. 血液腫瘤科, 海南 ?？? 570000)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種克隆性B細(xì)胞惡性腫瘤,其特征是分化的單克隆漿細(xì)胞在骨髓中堆積[1-2]。MM被認(rèn)為是世界上最難治愈的漿細(xì)胞惡性腫瘤之一,占所有血液學(xué)癌癥的13%以上[3]。由于耐藥性的產(chǎn)生,近年來(lái)MM的復(fù)發(fā)率呈逐漸升高趨勢(shì)[4]。微小RNA(miRNA)是一種高度保守的小型非編碼RNA分子,在基因的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。此外, miRNA可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控相應(yīng)的靶基因而影響癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[5-7]。研究[8-10]表明, miRNA的異常表達(dá)與MM的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān),這可能促使對(duì)人類MM機(jī)制發(fā)生新的認(rèn)識(shí)。ZHAO Y等[11]研究表明,微小RNA-144-3p(miR-144-3p)通過(guò)靶向細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換因子(c-Met)抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)MM的凋亡。微小RNA-203(miR-203)在MM中通過(guò)靶向Bmi-1可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并調(diào)節(jié)G1/S轉(zhuǎn)換[12]。研究[13]顯示, miR-203b-3p在紫杉醇耐藥的腫瘤進(jìn)程調(diào)控中同樣發(fā)揮作用。盡管如此, miR-203b-3p在MM細(xì)胞中的作用和功能仍然未知。

腫瘤壞死因子超家族成員13b(TNFSF13B)是一種B細(xì)胞激活因子(BAFF),主要由骨髓系細(xì)胞產(chǎn)生[14]。BAFF在B細(xì)胞的生存、增殖和分化中起著至關(guān)重要的作用,可以導(dǎo)致部分惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[15-16]。最近的研究[17]表明, BAFF/受體蛋白或TNFSF13BmRNA在系統(tǒng)性紅斑狼瘡和淋巴瘤中表現(xiàn)出異常的表達(dá)。本研究觀察MM細(xì)胞中miR-203b-3p與TNFSF13B的關(guān)系,探討miR-203b-3p影響MM細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的分子機(jī)制,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞系

選取2020年2月—2022年7月在海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心接受手術(shù)的30例MM患者的骨髓瘤組織和癌旁組織,其中男14例,女16例; 年齡35～67歲,中位年齡47歲。所有組織樣本放在-80 ℃的液氮中冷凍,以備日后實(shí)驗(yàn)使用。本研究得到了本院倫理學(xué)委員會(huì)的批準(zhǔn),并獲得了所有受試者的書面知情同意書。MM細(xì)胞系(U266、RPMI-8226、LP-1和H929)和正常人骨髓基質(zhì)細(xì)胞系(HS-27A)購(gòu)自BeNa生物(中國(guó)北京)。

1.2 基因芯片分析

本研究從30對(duì)組織中隨機(jī)抽取了3對(duì)骨髓瘤組織和癌旁組織,然后進(jìn)行RNA提取,并對(duì)RNA進(jìn)行了鑒定分析。利用Affymetrix HUGene 2.0ST基因芯片(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)篩選出表達(dá)異常的mRNA。差異倍數(shù)>4或<-4和P<0.05被設(shè)定為篩選標(biāo)準(zhǔn)?；蛐酒瑪?shù)據(jù)通過(guò)DNAstar軟件(Lasergene, Madison, WI)進(jìn)行分析。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組

細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich,美國(guó))中加10% FBS和0.1%青霉素-鏈霉素培養(yǎng),然后在37 ℃的培養(yǎng)箱中保存。miR-203b-3p模擬物和TNFSF13B過(guò)表達(dá)載體(TNFSF13 cDNA)由蘇州基因制藥有限公司(中國(guó)蘇州)合成,其中miR-203b-3p模擬物的序列為5′-ATCGCATCGACTACCATCACT-3′。使用Lipofectamine 2000試劑(Life Technologies, 美國(guó))將LP-1細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)染miR-203b-3p模擬物和TNFSF13B過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后24 h檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)分以下5組進(jìn)行: 空白組(非轉(zhuǎn)染), NC組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空白質(zhì)粒), miR-203b-3p組(轉(zhuǎn)染miR-203b-3p模擬物), TNFSF13B組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TNFSF13B過(guò)表達(dá)質(zhì)粒),以及miR-203b-3p+TNFSF13B組(共同轉(zhuǎn)染miR-203b-3p模擬物和TNFSF13B過(guò)表達(dá)質(zhì)粒)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)miR-203b-3p的表達(dá)水平

按照說(shuō)明書使用TRIzol試劑(Beyotime,中國(guó))和PureLink RNA Mini Kit(Invitrogen)提取總RNA。使用TIANScript Ⅱ RT試劑盒(TIANGEN)進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄。PCR在MiniOpticon實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Bio-Rad)上進(jìn)行,并使用SYBR-Green RealMastcrMix(Bio-Rad)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。U6是miR-203b-3p的內(nèi)參基因。miR-203b-3p或U6的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct方法測(cè)量。PCR引物是由Sangon Biotech(中國(guó)上海)制作的。miR-203b-3p的引物設(shè)計(jì)為加Poly A法: 正向5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′, 反向5′-GCCGCGTGAAATGTTTAGG-3′;U6的引物是正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′, 反向5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析(Western blot)檢測(cè)TNFSF13B的表達(dá)水平

本研究收獲處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。使用RIPA緩沖液(Sigma-Aldrich)進(jìn)行總蛋白的提取,直到細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%匯合。采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(Pierce, Rock ford, IL)鑒定蛋白濃度。蛋白質(zhì)通過(guò)10%的SDS-PAGE(Bio-Rad)分離,然后按照指南放入聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Invitrogen)中。5%的脫脂牛奶涂抹在膜的密封處1 h, 然后在4 ℃下加入一級(jí)抗體抗TNFSF13B(ab8396, 1∶1 000, Abcam, 英國(guó))和抗GAPDH(ab22555, 1∶1 000, Abcam, 英國(guó))并孵育過(guò)夜,然后采用TBST沖洗膜3次,每次10 min。隨后將二抗HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG H&L抗體(1∶2 000)加入到膜上,再孵育1 h, 之后采用TBST沖洗膜2次。通過(guò)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)系統(tǒng)(Thermo Scientific)觀察免疫活性蛋白,并在顯微鏡下拍照(Bio-Rad)。β-actin作為內(nèi)參蛋白用于檢測(cè)。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)檢測(cè)miR-203-3p與TNFSF13B的靶向關(guān)系

質(zhì)粒pmirGLO和pGEM-T載體均購(gòu)自Promega公司。PmirGlo-TNFSF13B 3′非翻譯區(qū)-野生型(3′UTR-wt)和PmirGlo-TNFSF13B 3′UTR-突變(3′UTR-mut)是由XL定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Qiagen)構(gòu)建。將LP-1細(xì)胞放入帶有48孔的平板中。細(xì)胞在達(dá)到80%匯合度之前不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000試劑將miRNA(miR-203b-3p mimic或?qū)φ战M)和載體(野生型或突變型)共同轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,然后在室溫下進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24 h使用熒光素酶報(bào)告測(cè)定試劑盒(Promega)評(píng)估熒光素酶活性。

1.7 集落形成試驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)

將細(xì)胞接種到60 mm的培養(yǎng)皿中,在37 ℃的潮濕環(huán)境下培養(yǎng)2周; 除去完整的培養(yǎng)基,采用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2次; 采用0.1%的水晶紫染色20 min, 然后除去水晶紫溶液,采用甲醇固定集落,并對(duì)集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行了3次。

收集細(xì)胞并置于48孔板中(每孔1×106細(xì)胞)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到75%匯合時(shí),用無(wú)菌的200 mL微量吸頭來(lái)刮取單層細(xì)胞,隨后采用PBS洗2次脫落的細(xì)胞,然后培養(yǎng)24 h。在顯微鏡下觀察0、24 h的細(xì)胞劃痕愈合區(qū)。

1.8 Transwell侵襲試驗(yàn)

為了檢查L(zhǎng)P-1細(xì)胞的侵襲能力,將細(xì)胞置于轉(zhuǎn)孔板中,與無(wú)血清培養(yǎng)基(100 μL)混合后,在上腔加入Matrigel(BD Biosciences, 美國(guó)),然后在37 ℃下保存過(guò)夜; 采用胰蛋白酶裂解細(xì)胞,采用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋,將細(xì)胞(1×105)轉(zhuǎn)移到上腔。下室含有600 μL DMEM(Sigma-Aldrich)和10% FBS(Invitrogen)。培養(yǎng)24 h后,采用棉簽刮除非入侵細(xì)胞,采用甲醇和0.1%的水晶紫固定和染色遷移或入侵的細(xì)胞。采用光學(xué)顯微鏡(日本尼康)檢測(cè)侵入的細(xì)胞。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 miR-203b-3p在MM組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況

為了檢查骨髓瘤組織和癌旁組織的表達(dá)情況,本研究通過(guò)基因芯片分析篩選出腫瘤組織和癌旁組織中異常表達(dá)的miRNA(圖1A)。選擇MM組織和細(xì)胞中低表達(dá)的miR-203b-3p mRNA作為研究靶基因,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)組織樣本中miR-203b-3p的表達(dá)。與癌旁組織相比, miR-203b-3p在腫瘤組織中的表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1B); 同時(shí), miR-203b-3p在MM細(xì)胞系(U266、RPMI-8266、LP-1和H929)中的表達(dá)與正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞系(HS-27A)相比降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1C)。選擇miR-203b-3p表達(dá)水平最低的LP-1細(xì)胞系進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。

2.2 TNFSF13B是MM細(xì)胞中miR-203b-3p的靶基因

TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè),在TNFSF13B的3′UTR-wt區(qū)有1個(gè)miR-203b-3p的直接結(jié)合點(diǎn)(圖2A)。與miR-203b-3p模擬物和TNFSF13B 3′UTR-wt共轉(zhuǎn)染組相比,細(xì)胞的熒光素酶活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 而miR-203b-3p模擬物和TNFSF13B 3′UTR-mut共轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2B)。本研究證實(shí)miR-203b-3p直接針對(duì)TNFSF13B。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,與正常細(xì)胞相比,腫瘤組織和MM細(xì)胞中TNFSF13B蛋白水平的表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2C、2D)。

A: TargetScan預(yù)測(cè)在TNFSF13B的3′UTR中存在miR-203b-3p的直接結(jié)合位點(diǎn); B: 與對(duì)照組相比, miR-203b-3p模擬物和TNFSF13B 3′UTR-wt的共轉(zhuǎn)染顯著降低了熒光素酶活性,而miR-203f-3p模擬品和TNFSF1 3B 3′UTR-mut的共轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組無(wú)顯著差異; C: Wesfern blot檢測(cè)顯示腫瘤組織中TNFSF13B蛋白的表達(dá)顯著高于正常鄰近組織; D: Wesfern blot檢測(cè)顯示TNFSF13B蛋白在MM細(xì)胞系(U266、RPMI-8226、LP-1和H929)中的表達(dá)顯著高于正常人骨髓基質(zhì)細(xì)胞系(HS-27A)。與對(duì)照組比較, *P<0.05; 與正常組織比較, #P<0.05; 與HS-27A比較, △P<0.05。

2.3 miR-203b-3p對(duì)MM細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移的影響

miR-203b-3p和miR-203b-3p+TNFSF13B均能促進(jìn)miR-203b-3p的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 而TNFSF13B對(duì)miR-203b-3p的表達(dá)無(wú)影響,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3A)。miR-203b-3p能夠抑制TNFSF13B的表達(dá),而TNFSF13B組表現(xiàn)為促進(jìn)了TNFSF13B的表達(dá)(P<0.05)(圖3B)。此外,集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, miR-203b-3p抑制了MM細(xì)胞的增殖,而TNFSF13B促進(jìn)了MM細(xì)胞的增殖,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3C)。劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示, MM細(xì)胞的遷移受到miR-203b-3p的抑制,而TNFSF13B則促進(jìn)其遷移,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4A); 侵襲試驗(yàn)結(jié)果表明, miR-203b-3p抑制了MM細(xì)胞的侵襲,而TNFSF13B增強(qiáng)了MM細(xì)胞的侵襲,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4 B)。

A、B: miR-203b-3p組和miR-203b3p+TNFSF13B組的miR-203b-3p的表達(dá)水平高于對(duì)照組, qRT-PCR和Wesfern blot檢測(cè)顯示,與對(duì)照組比較, miR-203b-3p組的TNFSF13B表達(dá)較低, TNFSF13B組的TNFSF13B表達(dá)較高, miR-203b-3p+TNFSF113B組的miR-203b-3p和TNFSF13B組的miR203b-3p表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著差異; C: 集落形成試驗(yàn)采用結(jié)晶紫染色,放大倍數(shù)40倍,miR-203b-3p組MM細(xì)胞的集落數(shù)量低于對(duì)照組,而TNFSF13B組MM細(xì)胞集落數(shù)量高于對(duì)照組, miR-203-b-3p+TNFSFF13B組的集落數(shù)與對(duì)照組無(wú)顯著差異。與空白組(Mock)或?qū)φ战M比較, *P<0.05。

A: 傷口愈合試驗(yàn)表明(比例尺為100 μm), miR-203b-3p組的遷移率低于對(duì)照組,而TNFSF13B組的遷移速率高于對(duì)照組,miR-203b-3p+TNFSF13B組與對(duì)照組、NC組無(wú)顯著差異; B: Transwell分析表明(結(jié)晶紫染色,放大倍數(shù)40倍,比例尺為50 μm), miR-203b-3p組的侵襲細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組,而TNFSF13B組的侵襲細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組,miR-203b-3p+TNFSF113B組與對(duì)照組、NC組無(wú)顯著差異。與對(duì)照組比較, *P<0.05。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示, miR-203b-3p的表達(dá)在MM組織及細(xì)胞中顯著下調(diào),并驗(yàn)證了miR-203b-3p在MM細(xì)胞中能夠靶向調(diào)控TNFSF13B的表達(dá),同時(shí)還證明了miR-203b-3p通過(guò)抑制TNFSF13B對(duì)MM細(xì)胞的生物學(xué)功能產(chǎn)生了抑制作用。

miRNA已經(jīng)被證實(shí)可以調(diào)節(jié)各種生物過(guò)程。研究[18-19]顯示, miRNA在腫瘤中失調(diào),包括MM。miR-21能夠調(diào)控MM細(xì)胞的增殖能力。YANG Y J等[20]驗(yàn)證了miR-137/197調(diào)節(jié)MM細(xì)胞的活力、克隆形成和遷移。miR-203b-3p在包括肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤中的作用也相繼被證實(shí)[21]。ZHANG C Y等[22]研究結(jié)果顯示, miR-203在三陰性乳腺癌(TNBC)中被下調(diào),從而抑制了TNBC細(xì)胞的增殖和遷移。與既往研究結(jié)果類似,本研究結(jié)果顯示, miR-203b-3p在MM細(xì)胞中下調(diào),并抑制MM細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。這是通過(guò)特異性結(jié)合TNFSF13B而實(shí)現(xiàn)的。miR-203b-3p已被發(fā)現(xiàn)通過(guò)靶向各種基因來(lái)抑制各種腫瘤的侵襲性。AN N等[23]發(fā)現(xiàn), miR-203b-3p靶向CASK導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲性降低。WU S Q等[12]發(fā)現(xiàn),通過(guò)靶向Bmi-1恢復(fù)miR-203b-3p能明顯抑制MM細(xì)胞的生長(zhǎng)和G1/S轉(zhuǎn)換。YANG P S等[24]發(fā)現(xiàn), miR-203b-3p通過(guò)靶向CREB1 mRNA抑制了MM的細(xì)胞增殖。復(fù)雜的miRNA網(wǎng)絡(luò)參與了癌癥的發(fā)展。miR-203b-3p被認(rèn)為通過(guò)靶向各種基因影響MM以及其他癌癥的發(fā)展。本研究驗(yàn)證了MM細(xì)胞中miR-203b-3p和TNFSF13B之間的新型分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

TNFSF13B屬于TNF超家族,該家族已被證明是細(xì)胞活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)器。TNF家族的2個(gè)成員APRIL和BAFF, 已被發(fā)現(xiàn)在許多癌癥中高表達(dá),包括MM[25]。BRUNETTI G等[26]證明, TNFSF14在MM中促進(jìn)破骨細(xì)胞生成而抑制成骨細(xì)胞生成。ZHU X J等[27]研究表明, TNFSF13B在免疫性血小板減少癥患者中表達(dá)升高。在MM晚期患者血清中發(fā)現(xiàn)TNFSF13B升高與骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有關(guān)[28]。然而, TNFSF13B在MM細(xì)胞中的作用尚不明確。本研究證實(shí)了TNFSF13B對(duì)MM細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究結(jié)果顯示, TNFSF13B在MM組織和細(xì)胞中明顯上調(diào)。此外,本研究通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TNFSF13B促進(jìn)了MM細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

綜上所述, miR-203b-3p可能通過(guò)靶向調(diào)控TNFSF13的表達(dá)來(lái)抑制MM細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。這些發(fā)現(xiàn)不僅為深入研究miR-203b-3p在MM細(xì)胞中的作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù),而且為MM的臨床治療提供了一種新的潛在治療策略。