單寧酸與不同配比頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對(duì)耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌的體外抑菌作用研究

歐陽(yáng)龍, 肖亞雄

(1. 川北醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系, 四川 南充, 637000; 2. 四川省宜賓市第一人民醫(yī)院, 四川 宜賓, 644000;3. 四川省宜賓市中醫(yī)醫(yī)院, 四川 宜賓, 644000)

鮑曼不動(dòng)桿菌屬于非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌,是一種廣泛分布于臨床的機(jī)會(huì)致病菌。中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)發(fā)布數(shù)據(jù)顯示,鮑曼不動(dòng)桿菌在2010年就已超過(guò)銅綠假單胞菌,成為醫(yī)院感染最主要的非發(fā)酵菌。隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用,鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率從2005年的31.0%和39.0%上升到2021年的71.5%和72.3%[1]。目前臨床尚無(wú)明確針對(duì)耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌(CRAB)感染的“標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物方案”,美國(guó)傳染病學(xué)會(huì)專家小組建議盡可能使用至少2種活性抗菌藥物聯(lián)合治療中重度CRAB感染[2]。近年來(lái)研究[3]表明,很多中藥活性成分具有良好的抗菌作用,與臨床常見(jiàn)抗生素聯(lián)用能起到減量增效的作用,具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力。

單寧酸是一種多酚化合物,廣泛存在于五倍子、石榴、茶葉等天然植物中。研究[4]表明,單寧酸對(duì)金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等9種臨床常見(jiàn)分離菌株有一定抗菌作用,對(duì)多重耐藥菌株和非多重耐藥菌株的抗菌活性無(wú)顯著差異,提示或可使用單寧酸治療臨床多重耐藥細(xì)菌感染?！吨袊?guó)鮑曼不動(dòng)桿菌感染診治與防控專家共識(shí)》[5]認(rèn)為,頭孢哌酮與舒巴坦在體外對(duì)不動(dòng)桿菌存在協(xié)同抗菌活性,敏感性優(yōu)于氨芐西林/舒巴坦,可作為不動(dòng)桿菌感染的主要治療藥物。頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉為頭孢哌酮和舒巴坦的復(fù)方制劑,臨床中有頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)和頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶ 1)這2種不同配比的制劑。本研究通過(guò)體外試驗(yàn)比較不同配比的頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對(duì)CRAB的抑菌作用,并對(duì)單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)觀察抑菌作用,以期為單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉聯(lián)合治療CRAB感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 菌株來(lái)源: 收集2022年宜賓市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室分離的6株CRAB,標(biāo)本類型分別為血液、尿液、膿液、分泌物、痰液、腦脊液。鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)任何一種碳青霉烯類藥物耐藥,即判定為CRAB菌株。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853, 購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 試劑與材料: 單寧酸(西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司),頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)(輝瑞制藥有限公司),頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶ 1)(輝瑞制藥有限公司), MH瓊脂平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司), MH肉湯(青島海博生物技術(shù)有限公司),無(wú)菌96孔板(比克曼生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器: 生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司),超低溫醫(yī)用冰箱(青島海爾特種電器有限公司),電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海力新儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌液配置: 將所有CRAB菌株接種于MH瓊脂平板,35 ℃培養(yǎng)20 h,挑取數(shù)個(gè)分離純化后的菌落置于生理鹽水試管中,使用比濁儀校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?1.0×108cfu/mL)。

1.2.2 微量肉湯法測(cè)定最低抑菌濃度(MIC): 用MH肉湯配制頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉和單寧酸儲(chǔ)存液,濃度為1 024 μg/mL。對(duì)以上濃度藥物進(jìn)行一系列的倍比稀釋,終濃度分別為1 024、512、256、128、64、32、16、8 μg/mL,再將稀釋至不同濃度的藥液100 μL加入96孔板中,最后加入已配制菌液100 μL。將MH肉湯作為空白對(duì)照,不含抗菌藥物的菌懸液作為陽(yáng)性對(duì)照。35 ℃培養(yǎng)24 h后,觀察單寧酸與不同配比頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對(duì)6株CRAB的MIC,并記錄結(jié)果。

1.2.3 聯(lián)合用藥的部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)測(cè)定: 選取抑菌效果更好的頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)與單寧酸進(jìn)行聯(lián)合抑菌試驗(yàn)。取無(wú)菌96孔板,橫排標(biāo)為A～H,縱列標(biāo)為1～8,將單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)分別倍比稀釋至受試菌4 MIC、2 MIC、1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC、1/32 MIC這8個(gè)稀釋度,以棋盤微量肉湯法測(cè)定2種藥物聯(lián)用的MIC。A～H橫排依次為單寧酸MIC的4、2、1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍, 1～8縱列依次為頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)MIC的4、2、1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍。每種藥物各取50 μL, 兩兩組合加入96孔板指定孔內(nèi),各孔內(nèi)加入100 μL用MH肉湯稀釋至濃度為1×106cfu/mL的菌懸液,使得體系內(nèi)單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)的藥物濃度分別為1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC、1/32 MIC、1/64 MIC、1/128 MIC。使體系內(nèi)菌懸液濃度為5×105cfu/mL, 加樣完成后振蕩混勻,每批進(jìn)行空白對(duì)照、生長(zhǎng)對(duì)照。將96孔板置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果,觀察各孔渾濁度并記錄2種藥物聯(lián)用時(shí)的MIC值。

1.2.4 結(jié)果判定: 根據(jù)藥物單用和聯(lián)用的MIC, 參照文獻(xiàn)[6] 計(jì)算FICI。FICI=甲藥聯(lián)用MIC/甲藥單用MIC+乙藥聯(lián)用MIC/乙藥單用MIC。FICI≤0.5時(shí),2種藥為協(xié)同作用; FICI>0.5～1.0時(shí), 2種藥為相加作用; FICI>1.0～4.0時(shí), 2種藥為無(wú)關(guān)作用; FICI>4.0時(shí), 2種藥為拮抗作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 MIC測(cè)定結(jié)果

單寧酸對(duì)6株CRAB的MIC范圍為128～256 μg/mL, 平均MIC為(213.3±66.1) μg/mL; 頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)對(duì)6株CRAB的MIC范圍為32～128 μg/mL,平均MIC為(90.7±42.5) μg/mL; 頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶ 1)對(duì)6株CRAB的MIC范圍為64～256 μg/mL, 平均MIC為(181.3±85.1) μg/mL, 高于頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)表1。由此提示,頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)的抑菌效果更好,故后續(xù)選用頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)與單寧酸進(jìn)行聯(lián)合抑菌試驗(yàn)。

表1 3種抗菌藥物對(duì)6株CRAB的MIC結(jié)果(n=3)

2.2 單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)聯(lián)合抑菌效果

單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶ 1)聯(lián)合用藥對(duì)6株CRAB的FICI范圍為0.375～0.750, 除AB04菌株表現(xiàn)為協(xié)同作用,其余菌株均表現(xiàn)為相加作用,見(jiàn)表2。由此表明,單寧酸可增強(qiáng)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對(duì)CRAB的抑菌作用。

表2 單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉聯(lián)用對(duì)6株CRAB的抑菌效果(n=3)

3 討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院感染較為常見(jiàn)的條件致病菌,是最常見(jiàn)的多重耐藥病原菌"ESKAPE"成員之一。隨著CRAB感染率的不斷增高,患者的治療費(fèi)用和病死率顯著增加[7-8]。目前, CRAB的治療方案多為基于舒巴坦、多黏菌素、替加環(huán)素的聯(lián)合用藥[5]。注射用多黏菌素價(jià)格昂貴,且具有明顯的腎毒性[9]和神經(jīng)毒性[10]。相對(duì)于多黏菌素而言,替加環(huán)素腎毒性較低,但其在微生物清除方面效果較差[11-12]。舒巴坦復(fù)合制劑是目前使用較為廣泛的抗CRAB藥物,其中頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉是一種廣譜抗生素,主要被用于治療CRAB等革蘭氏陰性菌引起的感染。頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉的主要成分是頭孢哌酮和舒巴坦,其中頭孢哌酮屬于第3代頭孢菌素類藥物,具有廣譜抗菌作用,而舒巴坦屬于β-內(nèi)酰胺酶抑制劑,能夠增強(qiáng)頭孢哌酮的抗菌活性。該復(fù)方制劑已被廣泛應(yīng)用于臨床,且在治療醫(yī)院感染方面表現(xiàn)出顯著的抗菌效果。

目前,市場(chǎng)上有頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)和頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶1)這2種配比的制劑可供選用,為探究不同配比頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對(duì)CRAB的體外抗菌活性,本研究挑選6株具有代表性的臨床菌株進(jìn)行體外試驗(yàn)。本研究發(fā)現(xiàn),頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶1)對(duì)6株CRAB臨床菌株的MIC值均是頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)的2倍。由此推測(cè),舒巴坦的濃度可能在頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉復(fù)方制劑對(duì)CRAB的抗菌作用中起主導(dǎo)作用,即舒巴坦?jié)舛仍礁?復(fù)方制劑對(duì)CRAB的抗菌作用越強(qiáng)。LAI C C等[13]也發(fā)現(xiàn),在頭孢哌酮中加入舒巴坦可提高頭孢哌酮對(duì)CRAB的體外抗菌活性,頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)的半數(shù)抑菌濃度(MIC50)和90%抑菌濃度(MIC90)均低于頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶1)。盡管上述試驗(yàn)提示頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)對(duì)CRAB的體外抗菌活性優(yōu)于頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶1), 但根據(jù)中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)技術(shù)方案中頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對(duì)不動(dòng)桿菌屬折點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn),本實(shí)驗(yàn)中6株試驗(yàn)菌株對(duì)頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)依然均應(yīng)判定為耐藥。因此,本研究根據(jù)中西藥聯(lián)用可增強(qiáng)藥物抑菌效果并逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性的思路[14], 對(duì)單寧酸和頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉進(jìn)行聯(lián)合用藥試驗(yàn),觀察其對(duì)CRAB的抑菌作用。本研究結(jié)果顯示,與單藥相比,兩者聯(lián)合用藥的抑菌效果明顯增強(qiáng),其中5株菌株表現(xiàn)為相加作用, AB04菌株則表現(xiàn)為協(xié)同作用[聯(lián)合用藥后頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)的MIC由原來(lái)的64 μg/mL降至16 μg/mL, MIC降到敏感水平]。

綜上所述,頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)在體外對(duì)CRAB的抗菌活性優(yōu)于頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶1), 單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(1∶1)聯(lián)用具有協(xié)同和相加作用,能夠降低頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對(duì)CRAB的MIC。但本研究納入菌株數(shù)量較少,且僅納入對(duì)碳青霉烯耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌,不能證明藥物對(duì)不同耐藥性的鮑曼不動(dòng)桿菌均有良好抗菌作用,后續(xù)將擴(kuò)大樣本量開(kāi)展更深入的研究。此外,本研究?jī)H觀察到單寧酸與頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉聯(lián)合干預(yù)下頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉對(duì)CRAB的MIC明顯下降,但未深入研究其作用機(jī)制,未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步探索聯(lián)合用藥的抑菌作用機(jī)制,從而為抗CRAB感染提供更全面的理論基礎(chǔ)。