川芎-丹參藥對主要藥理成分的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和指紋圖譜研究

劉明月, 楊玉梅, 鄭延澤

(1. 內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟安神醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 錫林浩特, 026000;2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟中心醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 錫林浩特, 026000)

丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩和涼血消癰功效,其主要活性成分為丹參酮、丹參酚酸類化合物和揮發(fā)油等[1]。川芎活血行氣,其主要活性成分包括阿魏酸、綠原酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、迷迭香酸、洋川芎內(nèi)酯A、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯等。川芎-丹參藥對可活血行氣,其中丹參活血而不傷血,川芎辛溫香燥,走而不守,上行頭目,下入血海,兩者配伍可使活血化瘀、行氣止痛之功倍增,為典型的相須配伍[2]。目前,參芎葡萄糖注射液、冠心寧注射液、冠心寧片等多種川芎-丹參配伍制劑已被用于臨床疾病的治療中。孫青[3]利用高效液相色譜法(HPLC)檢測川芎-丹參藥對不同配比的有效成分含量,發(fā)現(xiàn)合煎液中各成分提取率顯著高于單煎液提取率。張聰?shù)萚4]利用中藥方劑數(shù)據(jù)庫計算川芎與其他中藥配伍出現(xiàn)的頻率,其中川芎-丹參藥對居第1位。相關(guān)研究[5]表明,川芎-丹參配伍可治療心肌梗死、阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化等疾病。近年來,基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討中藥復(fù)方作用機制的研究眾多,中藥復(fù)方的多層次多靶點網(wǎng)絡(luò)可闡釋藥物的治病機理。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法分析川芎-丹參藥對的活性成分、靶點和對疾病的作用機制,以期為臨床合理使用川芎-丹參藥對提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 成分和靶點的收集與篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(https: //old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中搜索川芎和丹參的活性成分和作用靶點。藥物經(jīng)肝臟進入體循環(huán)血液中的藥量占口服劑量的百分比稱為口服生物利用度(OB), 是中藥制劑研發(fā)過程中的關(guān)鍵藥動學(xué)指標。類藥性(DL)指活性成分與已知藥物的相似性,是篩選藥用成分的關(guān)鍵參數(shù)。通常OB值越高,活性成分的藥用價值越高。中藥藥用成分篩選條件為OB≥30%, DL≥0.18[6-7]。

1.2 疾病數(shù)據(jù)收集和靶點對應(yīng)基因獲取

依照“1.1”方法篩選靶點,檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫中與其對應(yīng)的疾病,通過Uniprot網(wǎng)站(https://www.uniprot.org/)的UniprotKB數(shù)據(jù)庫獲取靶點相應(yīng)基因,以Excel格式導(dǎo)出,使用VLOOKUP函數(shù)將靶點與基因信息一一對應(yīng)[8]。

1.3 多層次多靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Cytoscape 3.9.1軟件將已收集的川芎和丹參的活性成分、靶點和疾病整合后,構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)[9]。構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)中,點和線的顏色、粗細均可賦值表示相應(yīng)指標,如圓圈的大小和顏色表示藥物-成分-靶點-疾病的連通性和權(quán)重高低。Degree表示某一節(jié)點與其他節(jié)點連接邊的數(shù)量。Cytoscape網(wǎng)絡(luò)分析常以Degree值高作為篩選參數(shù),川芎-丹參藥對的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建亦參考此方法,即篩選Degree值高的關(guān)鍵參數(shù),構(gòu)建川芎-丹參“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò),并探討川芎-丹參藥對的作用機制。

1.4 基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

利用GO基因功能注釋分析和KEGG通路富集分析方法分析川芎-丹參藥對的作用機制。在DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)中導(dǎo)入整理好的靶點基因,選擇與靶點基因名稱對應(yīng)的選項,點擊"Homo Sapiens", 提交基因列表。數(shù)據(jù)處理后,導(dǎo)出生物過程、分子功能、細胞成分和KEGG通路數(shù)據(jù),設(shè)定閾值P<0.05, 繪圖[10-12]。

1.5 川芎-丹參藥對指紋圖譜研究

1.5.1 溶液制備: 取15批藥材(每批藥材為丹參、川芎各5 g), 分別置于錐形瓶中,加100 mL水浸泡 1 h后,回流提取2.5 h, 抽濾后得丹參-川芎合煎液,加入70%乙醇稀釋后得到供試品溶液。

1.5.2 混合對照品溶液制備: 取谷甾醇、川芎嗪、丹參醇B、鼠尾草酚酮、木犀草素、川芎哚對照品,加70%乙醇制成混合對照品溶液。

1.5.3 色譜條件: 使用Agilent XDB C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm), 流動相為乙腈(A)-水(B), 梯度洗脫(0～35 min、17%～28% A, 35～50 min、28%～75% A, 50～60 min、75%～80% A), 流速1.0 mL/min, 檢測波長280 nm, 柱溫20 ℃, 進樣量20 μL。

2 結(jié) 果

2.1 川芎-丹參藥對的活性成分篩選

搜索TCMSP數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)川芎-丹參藥對的活性成分324個(川芎175個,丹參149個),根據(jù)條件(OB≥30%, DL≥0.18)篩選后共得到15個主要活性成分,見表1。

表1 川芎-丹參藥對中15個活性成分信息

2.2 多層次多靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

川芎-丹參藥對的“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖含有259個節(jié)點(2種藥物, 15個成分, 72個靶點,187種疾病)和453條邊線。以Degree≥10為條件篩選關(guān)鍵活性成分和靶點,以Degree≥5為條件篩選疾病。篩選結(jié)果顯示, Degree≥10的活性成分有谷甾醇(編號CX-1)、丹參醇B(編號DS-2)、川芎嗪(編號CX-8)、木犀草素(編號DS-7)、鼠尾草酚酮(編號DS-5), 其Degree值分別為43、36、32、29、22, 說明這5個活性成分是構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵活性成分,在川芎-丹參藥對的藥理作用中具有功效; Degree≥10的靶標蛋白有10個,包括醛糖還原酶(AKR1B1)、碳酸酐酶2(CA2)、碳酸酐酶1(CA1)、乙醛脫氫酶2(ALDH2)、前列腺素G/H合成酶1(PTGS1)、表皮生長因子受體(EGFR)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體(SLC6A2)和腺苷受體A1(ADORA1),以上靶標蛋白中Degree最高的為AKR1B1,表明川芎-丹參藥對可以調(diào)節(jié)其表達,對機體產(chǎn)生作用; Degree≥5的疾病有8種,包括疼痛、心血管疾病、阿爾茨海默病、前列腺癌、腦損傷、炎癥、焦慮癥、精神分裂癥,其中Degree最高的為心血管疾病,這與川芎-丹參藥對主要治療心血管疾病相吻合。見表2。

表2 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)節(jié)點及參數(shù)

2.3 GO富集分析結(jié)果

利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫,以P<0.05且人類物種為條件進行GO功能富集分析。GO富集分析共得到條目223條: 生物過程165條,包括對藥物的反應(yīng)、增殖過程的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控和DNA模板化、Erk1和Erk2級聯(lián)的正調(diào)控、缺氧反應(yīng)等; 分子功能30條,包括序列特異性DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)DNA結(jié)合、藥物結(jié)合、蛋白酶結(jié)合和細胞因子活性等; 細胞組成28條,包括質(zhì)膜、含膠原的細胞外基質(zhì)、質(zhì)膜組成部分、膜區(qū)、細胞表面等。GO富集分析的主要結(jié)果見圖1、表3。

A: 生物過程; B: 分子功能; C: 細胞組成。

表3 川芎-當歸藥對相應(yīng)基因GO富集分析結(jié)果(各類型前5條條目)

2.4 KEGG通路富集分析結(jié)果

利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析,共得到78條信號通路,包括癌癥通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、乙肝信號通路、癌癥中的蛋白多糖等。KEGG通路富集分析的主要結(jié)果見圖2、表4。

圖2 KEGG富集結(jié)果(前20條通路)

表4 川芎-當歸藥對相應(yīng)基因KEGG富集分析結(jié)果(前16條通路)

2.5 川芎-丹參藥對指紋圖譜的建立

分別取15批川芎-丹參飲片(S1～S15), 制備供試品溶液并分別進樣,記錄色譜圖,導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)中,設(shè)置時間窗寬度為0.3, 采用中位數(shù)法,進行色譜峰匹配,生成對照圖譜,共標定11個共有峰,得到川芎-丹參藥對指紋圖譜,見圖3。與混合對照品溶液色譜圖相比,色譜圖標定谷甾醇、川芎嗪、丹參醇B、鼠尾草酚酮、木犀草素、川芎哚這6個色譜峰,見圖4。15批川芎-丹參藥對指紋圖譜相似度分別為0.999、0.998、1.000、1.000、1.000、0.999、0.999、0.998、0.999、1.000、0.999、1.000、0.997、0.999、1.000,提示15批飲片均質(zhì)量穩(wěn)定。

圖3 15批川芎-丹參樣品的HPLC指紋圖譜

圖4 混合對照品溶液的色譜圖

3 討 論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法,通過TCMSP和DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫分析川芎-丹參藥對的活性成分、靶標蛋白和疾病,并對靶點基因進行GO和KEGG富集分析,發(fā)現(xiàn)川芎-丹參藥對有72個靶點, 2種藥物的15種活性成分參與調(diào)節(jié)靶標基因的生物學(xué)過程、細胞功能和分子組成,從而達到治療相關(guān)疾病的藥理作用。

“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖中,川芎和丹參中Degree值排名前2位的活性成分分別為谷甾醇和丹參醇B, HPLC指紋圖譜檢測表明谷甾醇和丹參醇B為川芎和丹參中的活性成分。裴浩等[13]發(fā)現(xiàn),谷甾醇可以抑制口腔鱗狀細胞癌增殖。陳穎[14]通過微量稀釋法發(fā)現(xiàn)丹參醇B具有抗菌抑菌作用,與頭孢噻肟聯(lián)用抑菌效果可提高6倍。本研究發(fā)現(xiàn),靶標蛋白AKR1B1、CA2、CA1、ALDH2、PTGS1、EGFR、MMP9、MMP2、SLC6A2和ADORA1的Degree值高于10, 說明以上靶標蛋白作為關(guān)鍵靶點參與調(diào)控疾病信號通路。疼痛等疾病的靶點AKR1B1、CA2與細胞凋亡和心肌纖維化等信號轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)度較高,說明這2個靶標蛋白參與川芎-丹參治療疾病的免疫反應(yīng)過程。王倩婷等[15]研究了AKR1B1對乳腺癌患者MCF-7細胞的調(diào)節(jié)機制,發(fā)現(xiàn)AKR1B1能有效抑制細胞凋亡現(xiàn)象。

GO富集分析和KEGG富集分析結(jié)果表明,大部分靶標蛋白富集在增殖過程的正調(diào)控、Erk1和Erk2級聯(lián)的正調(diào)控生物學(xué)過程, Erk1和Erk2為細胞外信號調(diào)節(jié)激酶的成員,參與調(diào)控細胞分化和細胞凋亡過程,可促進細胞增殖,在多種腫瘤中異常表達[16-17],推測抗癌可能是川芎-丹參藥對的重要藥理作用之一。

綜上所述,川芎-丹參藥對治療疼痛、炎癥、癌癥等多種疾病與AKR1B1、CA2、CA1、ALDH2等靶點有關(guān),也與癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路和神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路等有關(guān),故推測川芎-丹參藥對中的活性成分通過參與調(diào)控關(guān)鍵通路中的關(guān)鍵靶標基因表達而達到治療疾病的目的。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘川芎-丹參藥對的“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,進行GO和KEGG通路富集分析,有助于從基因和細胞組成層面揭示川芎-丹參藥對治療疾病的機制,進而為臨床應(yīng)用川芎-丹參復(fù)方提供借鑒。