無(wú)花果內(nèi)生菌Alternaria sp.QDFB-2發(fā)酵液的聚酮類化學(xué)成分研究

孫 麗, 王莎莎, 陳春穎, 趙 雪, 王鳳舞, 申 麗

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001;2. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 揚(yáng)州, 225001;3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島, 266109)

無(wú)花果(FicuscaricaL.)為桑科榕屬無(wú)花果亞屬植物,是一種藥食同源的植物。據(jù)《全國(guó)中草藥匯編》和《中華本草》記載,無(wú)花果性平、味甘,具有潤(rùn)肺止咳、清熱潤(rùn)腸功效,主治咳喘、腸炎、腹瀉、便秘、痔瘡等。研究[1]顯示,豐富的化學(xué)成分是無(wú)花果具有抗氧化、提高機(jī)體免疫力、延緩衰老等作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前,無(wú)花果的葉片、果實(shí)、乳漿及樹(shù)脂中已被發(fā)現(xiàn)不少新活性成分,基于內(nèi)共生理論,其內(nèi)生菌值得關(guān)注。馬養(yǎng)民等[2-3]曾對(duì)無(wú)花果內(nèi)生菌進(jìn)行較為深入的研究,并分離純化獲得2個(gè)新化合物。從A.tamariiFR02中分離得到的新環(huán)五肽malformin E具有顯著的體外抑菌活性,其對(duì)Staphylococcusaureus、EscherichiaColi、PseudomonasAeruginosa、CandidaAlbicans、Fusariumsolani和Penicilliumchrysogenum的最低抑菌濃度(MIC)分別為0.45、0.91、1.82、7.24、7.24和3.62 μmol/L; malformin E還對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性,半抑制濃度(IC50)分別為0.65和2.42 μmol/L, 與陽(yáng)性對(duì)照藥阿霉素(IC50分別為1.24和4.28 μmol/L)相當(dāng)[2]。從Fusariumsp.FL10中分離得到的新化合物helvolic acid methyl ester對(duì)P.Aeruginosa和E.Coli的MIC分別為3.13和6.25 μg/mL[3]。無(wú)花果內(nèi)生真菌能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的次生代謝產(chǎn)物,是微生物藥物的潛在來(lái)源。Alternariasp.QDFB-2是從無(wú)花果枝條中分離得到的一種內(nèi)生真菌,本研究采用硅膠柱、Sephadex LH-20凝膠柱、ODS反相柱和高效液相色譜法(HPLC)等方法對(duì)其GPY培養(yǎng)基發(fā)酵液的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化,并利用核磁共振譜(NMR)、高分辨質(zhì)譜(HR-MS)等現(xiàn)代波譜技術(shù)和文獻(xiàn)比對(duì)方法鑒定化合物結(jié)構(gòu),共獲得7個(gè)聚酮類化合物,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 材料與試劑: 柱層析硅膠(200～300目),青島海洋化工廠分廠; Sephadex LH-20填料,瑞典Pharmacia Biotech公司; Silica gel 60 F254鋁板(20 cm×20 cm), 德國(guó)默克集團(tuán); Sinochrom ODS-AP柱(4.6 mm×200.0 mm, 5 μm)、Sinochrom ODS-AP柱(4.6 mm×150.0 mm, 5 μm)和Betasil C18柱(4.6 mm×150.0 mm, 5 μm), 大連依利特分析儀器有限公司; DMSO-d6, 美國(guó)Cambridge Isotope Laboratories; CDCl3和acetone-d6, 美國(guó)ALDRICH公司; CD3OD, 青島騰龍微波技術(shù)有限公司; 色譜甲醇,瑞典歐森巴克環(huán)?；瘜W(xué)公司; 人宮頸癌細(xì)胞株HeLa和人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721, 美國(guó)ATCC公司; 順鉑(Cisplatin), 江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司; 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT), 北京索萊寶科技有限公司; DMEM培養(yǎng)基,美國(guó)Gibco公司; 胎牛血清,美國(guó)Gemini公司; 0.25%胰蛋白酶,上海碧云天生物有限公司; 其他試劑為分析純。

1.1.2 儀器: AVANCE 400和AVANCE 600核磁共振儀,德國(guó)Bruker公司; Agilent 6530 Q-TOF液-質(zhì)聯(lián)用儀,美國(guó)安捷倫科技公司; TripleTOF 4600 UPLC-Q-TOF-MS液-質(zhì)聯(lián)用儀,美國(guó)AB SCIEX有限公司; LC3000N高效液相色譜儀,北京創(chuàng)新通恒色譜技術(shù)有限公司; Isolera one快速制備液相色譜,瑞典Biotage公司; UPT-Ⅱ-10T超純水儀,四川優(yōu)普超純科技有限公司; SHP-250恒溫培養(yǎng)箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司; Bio-Tek SYNERGY2酶標(biāo)儀,美國(guó)BioTek有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株: 菌株QDFB-2是王鳳舞博士從無(wú)花果枝條中分離得到的內(nèi)生真菌,菌株的分離和純化參照文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行。菌株現(xiàn)保存于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院。

1.2.2 菌株的鑒定[13-14]: 將菌株接種至PD培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5 d, 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。采用通用引物(ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′; ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后測(cè)序,將測(cè)得的ITS序列上傳至GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)分析,用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 菌株的發(fā)酵和發(fā)酵產(chǎn)物的提取[13-14]:Alternariasp. QDFB-2采用GPY培養(yǎng)基(葡萄糖15 g、胰蛋白胨3 g、酵母膏1 g、水1 000 mL)進(jìn)行液體靜置發(fā)酵。將菌株從凍存管接種到PDA平板培養(yǎng)2～3 d, 然后挑取新鮮菌塊接種到500 mL三角瓶(200 mL PDB培養(yǎng)基)中, 28 ℃、120轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)2～3 d; 種子液以每瓶2.5%的接種量接種到1 000 mL三角瓶(400 mL GPY培養(yǎng)基)中,室溫靜置培養(yǎng)28 d。發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液并減壓去除溶劑得到粗浸膏26.44 g。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化: 發(fā)酵液粗浸膏經(jīng)硅膠柱分離, CH2Cl2-CH3OH進(jìn)行梯度洗脫(v/v100∶0→0∶100), 再經(jīng)薄層色譜(TLC)合并得到19個(gè)組分(Fr.1～Fr.19)。組分Fr.5經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析分離得到Fr.5-1～Fr.5-3, 其中Fr.5-3經(jīng)HPLC[Sinochrom ODS-AP柱(4.6 mm×150.0 mm, 5 μm), 254 nm, CH3OH∶H2O(v/v)為50∶50, 1 mL/min]分離純化得到化合物2[1.0 mg, 保留時(shí)間(tR)=19 min]。組分Fr.8經(jīng)硅膠柱分離得到Fr.8-1～Fr.8-3, 其中Fr.8-1經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱進(jìn)一步分離得到Fr.8-1-1～Fr.8-1-4, Fr.8-1-2再經(jīng)HPLC[Sinochrom ODS-AP柱(4.6 mm×150.0 mm, 5 μm), 254 nm, CH3OH∶H2O(v/v)為40∶60, 1 mL/min]分離純化得到化合物1(2.5 mg,tR=19 min), Fr.8-1-4再經(jīng)HPLC[Sinochrom ODS-AP柱(4.6 mm×150.0 mm, 5 μm), 254 nm, CH3OH∶H2O(v/v)為55∶45, 1 mL/min]分離純化得到化合物3(1 mg,tR=51 min)。組分Fr.11經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離得到的Fr.11-1再經(jīng)HPLC[Sinochrom ODS-AP柱(4.6 mm×200.0 mm, 5 μm), 254 nm, CH3OH∶H2O(v/v)為55∶45, 1 mL/min]分離純化得到化合物4(8.0 mg,tR=21 min)和化合物5(3.2 mg,tR=23 min); Fr.11-2經(jīng)HPLC[Sinochrom ODS-AP柱(4.6 mm×200.0 mm, 5 μm), 210 nm, CH3CN∶H2O(v/v)為25∶75, 1 mL/min]分離純化得到化合物7(4.2 mg,tR=39 min)。組分Fr.11-3經(jīng)HPLC[Betasil C18柱(4.6 mm×150.0 mm, 5 μm), 254 nm, CH3OH∶H2O(v/v)為39∶61, 1 mL/min]分離純化得到化合物6(6.1 mg,tR=60 min)。

1.2.5 體外細(xì)胞毒活性測(cè)定: 參照文獻(xiàn)[15], 采用MTT法測(cè)定化合物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa和人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的體外細(xì)胞毒活性。陽(yáng)性對(duì)照藥為順鉑。

2 結(jié) 果

2.1 菌株鑒定

將菌株QDFB-2的ITS序列上傳至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)分析,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。菌株QDFB-2被鑒定為Alternariasp. (GenBank登錄號(hào): MZ359821), 見(jiàn)圖1。

圖1 Alternaria sp. QDFB-2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

從Alternariasp. QDFB-2發(fā)酵液乙酸乙酯粗浸膏中分離得到7個(gè)聚酮類化合物,分別為7-hydroxy-2, 5-dimethyl-4H-1-benzopyran-4-one(1)[4]、1-deoxyrubralactone(2)[5]、alternariol-9-O-monomethyl ether(3)[6]、alternariol(4)[7]、altenuisol(5)[8]、stemphyperylenol(6)[9]和altertoxin Ⅰ(7)[10-11], 其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2。

圖2 7個(gè)聚酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

化合物1: 白色粉末,分子式為C11H10O3。HR-ESI-MSm/z: 191.070 2 [M+H]+, 213.052 3 [M+Na]+(C11H10O3Na理論值為213.052 2);1H-NMR(600 MHz, CD3OD)δH: 6.54 (1H, d,J=1.8 Hz, H-6), 6.53 (1H, d,J=1.8 Hz, H-8), 5.90 (1H, s, H-3), 2.61 (3H, s, H-2′), 2.22 (3H, s, H-5′);13C-NMR(150 MHz, CD3OD)δC: 182.4 (C-4), 166.7 (C-2), 163.1 (C-9), 161.4 (C-7), 143.6 (C-5), 118.0 (C-6), 115.6 (C-10), 111.4 (C-3), 101.9 (C-8), 23.1 (C-5′), 19.8 (C-2′)。以上1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]結(jié)果一致,故鑒定其為7-hydroxy-2,5-dimethyl-4H-1-benzopyran-4-one。

化合物2: 黃色粉末,分子式為C14H12O5。HR-ESI-MSm/z: 261.079 0 [M+H]+,283.050 0

[M+Na]+(C14H12O5Na理論值為283.057 7);1H-NMR(400 MHz, CDCl3)δH: 11.35 (1H, s, 6-OH), 6.70 (1H, d,J=2.4 Hz, H-7), 6.69 (1H, d,J=2.4 Hz, H-9), 3.94 (3H, s, H-11), 3.43 (1H, m, H-1), 2.92 (1H, dd,J=18.8, 6.4 Hz, H-2), 2.31 (1H, dd,J=18.8, 1.2 Hz, H-2), 1.46 (3H, d,J=7.2 Hz, H-1′);13C-NMR(100 MHz, CDCl3)δC: 195.3 (C-3), 166.8 (C-8), 165.3 (C-6), 164.9 (C-5), 148.2 (C-3), 144.6 (C-10), 134.5 (C-9), 103.2 (C-7), 103.0 (C-9), 100.8 (C-5), 56.0 (C-11)。以上1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]結(jié)果一致,故鑒定其為1-deoxyrubralactone。

化合物3: 黃色粉末,分子式為C15H12O5。HR-ESI-MSm/z: 273.076 3 [M+H]+, 295.057 3 [M+Na]+(C15H12O5Na理論值為295.058 2);1H-NMR(400 MHz, acetone-d6)δH: 7.31 (1H, d,J=2.0 Hz, H-10), 6.81 (1H, d,J=2.8 Hz, H-2), 6.71 (1H, d,J=2.8 Hz, H-4), 6.57 (1H, d,J=2.4 Hz, H-8), 3.98 (3H, s, H-12), 2.82 (3H, s, H-11);13C-NMR(100 MHz, acetone-d6)δC: 166.6 (C-9), 158.8 (C-3), 153.3 (C-4), 138.7 (C-10), 138.3 (C-1), 117.7 (C-2), 109.8 (C-10), 101.8 (C-4), 103.5 (C-10), 98.9 (C-8), 55.3 (C-12)。以上1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]結(jié)果一致,故鑒定其為alternariol-9-O-monomethyl ether(AME)。

化合物4: 白色結(jié)晶,分子式為C14H10O5。HR-ESI-MSm/z: 259.059 3 [M+H]+, 281.042 8 [M+Na]+(C14H11O5理論值為259.060 1);1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)δH: 11.75 (1H, s, -OH), 7.21 (1H, d,J=1.2 Hz, H-6), 6.70 (1H, d,J=2 Hz, H-5′), 6.62 (1H, d,J=2.4 Hz, H-3′), 6.32 (1H, d,J=1.2 Hz, H-4), 2.69 (3H, s, H-8)。以上1H-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]結(jié)果一致,故鑒定其為alternariol。

化合物5: 綠色粉末,分子式為C14H10O6。HR-ESI-MSm/z: 275.054 8 [M+H]+, 297.035 9 [M+Na]+(C14H11O6理論值為275.055);1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)δH: 7.52 (1H, s, H-6′), 7.02 (1H, s, H-6), 6.75 (1H, s, H-3′), 6.52 (1H, s, H-4), 3.93 (3H, s, H-8′)。以上1H-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]結(jié)果一致,故鑒定其為altenuisol(altertenuol)。

化合物6: 黃色粉末,分子式為C20H16O6。HR-ESI-MSm/z: 353.103 6 [M+H]+, 375.084 3 [M+Na]+(C20H17O6理論值為353.102);1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)δH: 12.03 (2H, s, 4-OH, 10-OH), 8.02 (2H, d,J=8.8 Hz, H-6, H-12), 6.87 (2H, d,J=8.4 Hz, H-5, H-11), 5.77 (2H, s, 1-OH, 7-OH), 4.61 (2H, m, H-1, H-7), 3.73 (2H, d,J=8.8 Hz, H-6b, H-12b), 3.16 (2H, dd,J=15.6, 12 Hz, H-2, H-8), 2.93 (2H, dd,J=15.6, 4.4 Hz, H-2, H-8);13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δC: 203.5 (C-3, C-9), 159.2 (C-4, C-10), 142.9 (C-3b, C-9b), 134.6 (C-6, C-12), 130.0 (C-6a, C-12a), 114.9 (C-3a, C-9a), 114.5 (C-5, C-11), 66.5 (C-1, C-7), 46.9 (C-2, C-8), 44.6 (C-6b, C-12b)。以上1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]結(jié)果一致,故鑒定其為stemphyperylenol。

化合物7: 黃色粉末,分子式為C20H16O6。HR-ESI-MSm/z: 353.103 0 [M+H]+, 375.083 9 [M+Na]+(C20H17O6理論值為353.102);1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)δH: 12.73 (1H, s, 3-OH), 12.32 (1H, s, 10-OH), 8.07 (1H, d,J=8.8 Hz, H-1), 8.0 (1H, d,J=8.8 Hz, H-12), 7.05 (1H, d,J=8.8 Hz, H-2), 6.95 (1H, d,J=8.8 Hz, H-11), 5.37 (1H, s, 7-OH), 5.28 (1H, d,J=5.6 Hz, 6a-OH), 4.54 (1H, m, H-7), 3.02 (4H, m, H-5, H-6, H-6b, H-8), 2.86 (1H, dd,J=15.6, 4.8 Hz, H-8), 2.58 (1H, m, H-5), 2.31 (1H, td,J=14.4, 3.6 Hz, H-6);13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δC: 206.1 (C-4), 204.2 (C-9), 161.0 (C-3), 160.4 (C-10), 140.7 (C-9b), 138.4 (C-3b), 132.9 (C-1), 132.5 (C-12), 124.8 (C-12a), 123.5 (C-12b), 117.9 (C-2), 116.5 (C-9a), 115.5 (C-11), 113.8 (C-3a), 68.0 (C-6a), 64.6 (C-7), 51.4 (C-6b), 47.5 (C-8), 34.8 (C-6), 33.5 (C-5)。以上1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10-11]結(jié)果一致,故鑒定其為altertoxin Ⅰ。

2.3 化合物的體外細(xì)胞毒活性

MTT法測(cè)定結(jié)果顯示,化合物4對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa和人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721具有顯著的增殖抑制活性, IC50分別為13.43和50.47 μg/mL, 而陽(yáng)性對(duì)照藥順鉑的IC50分別為8.71和3.46 μg/mL。

3 討 論

植物內(nèi)生菌是一種寶貴的微生物藥物資源,藥用植物內(nèi)生菌是其中的重要研究方向之一。近年來(lái),研究者們已從多種傳統(tǒng)藥用植物(如丹參、三七、雷公藤、人參、白芨等)的內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)多個(gè)結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的化學(xué)成分,為新藥研制提供了豐富的先導(dǎo)化合物。WANG X Z等[16]從丹參內(nèi)生真菌A.tenuissimaSP-07中分離得到的新化合物solanapyrones P對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)和芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)具有顯著的抗菌活性, MIC均為50 μg/mL。王獻(xiàn)等[17]從白芨內(nèi)生菌Ilyonectriarobusta中分離得到的新化合物butyl((S)-5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)-D-leucinate對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7具有一定的增殖抑制活性, IC50為36.2 μmol/L。作為一種藥食同源的植物,無(wú)花果極具藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,其內(nèi)生菌值得關(guān)注,但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于無(wú)花果內(nèi)生菌的研究較少。

Alternaria屬真菌次生代謝產(chǎn)物種類豐富,主要包括肽類、生物堿類、聚酮類、tricycloalternarene(TCA)類和酚類等,其中不少成分具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、酶活性抑制等藥理活性[18]。聚酮類化合物是天然產(chǎn)物中的一大類,是由聚酮合酶(PKS)催化生物合成的次生代謝產(chǎn)物,其來(lái)源廣泛、種類繁多。目前,鏈格孢屬真菌產(chǎn)生的聚酮類化合物主要為苯丙素類、吡喃酮類和苝醌類等[19-20]。本研究從無(wú)花果內(nèi)生真菌Alternariasp.QDFB-2的發(fā)酵液中分離得到7個(gè)聚酮類化合物,其中化合物1～5為吡喃酮類,化合物6和化合物7為苝醌類; 化合物4(alternariol)對(duì)HeLa細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞具有顯著的增殖抑制活性, IC50分別為13.43和50.47 μg/mL, 其藥理活性有待進(jìn)一步研究。

隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬真菌存在著巨大的生物合成潛力,可以產(chǎn)生大量具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物[21]。然而,常規(guī)培養(yǎng)條件下,微生物的許多合成基因簇處于沉默狀態(tài)。研究[22]發(fā)現(xiàn),微生物培養(yǎng)條件的微小變化可以改變其次生代謝特性,激活沉默的生物合成基因簇,提高微量次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量或次生代謝產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)分子。單菌多次級(jí)代謝產(chǎn)物(OSMAC)策略是通過(guò)改變菌株的培養(yǎng)條件,如培養(yǎng)基組成(碳源、氮源、水、前體物質(zhì)等)、pH值、溫度、供氧水平、培養(yǎng)時(shí)間等,從而影響菌株次生代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量,以獲得結(jié)構(gòu)更豐富、活性更顯著的次級(jí)代謝產(chǎn)物[23]。本課題組后續(xù)將基于OSMAC策略,對(duì)菌株QDFB-2的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,以期挖掘發(fā)現(xiàn)更多活性顯著的天然產(chǎn)物,為新藥研發(fā)提供先導(dǎo)化合物。