皮肌炎差異表達(dá)基因鑒定及治療藥物預(yù)測

鄭超越, 張升校, 賀培鳳, 于 琦, 程靈婧,馮 爽, 孔 騰, 孫翔飛

(山西醫(yī)科大學(xué), 1. 管理學(xué)院, 2. 第二臨床醫(yī)學(xué)院, 3. 人文社會科學(xué)學(xué)院, 山西 太原, 030001)

皮肌炎(DM)是一種自身免疫缺陷性疾病,主要損害患者的肌肉和皮膚,影響多個器官和系統(tǒng),伴發(fā)腫瘤和其他結(jié)締組織病的概率較高[1]。DM病因和發(fā)病機制尚未完全闡明,且相關(guān)并發(fā)癥預(yù)后效果不佳,治療也局限于激素和免疫抑制劑等傳統(tǒng)方案[2], 因此尋找新的治療方法顯得尤為迫切。生物信息學(xué)作為一門新型學(xué)科,可與基因芯片或高通量測序技術(shù)相結(jié)合,其已成為發(fā)現(xiàn)各種疾病潛在生物標(biāo)志物、重要通路和基因功能的有效方法。本研究基于生物信息學(xué)方法,通過對基因芯片的公共數(shù)據(jù)庫(GEO)中符合篩選條件的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,探討影響DM發(fā)生發(fā)展的潛在生物標(biāo)志物,以此挖掘治療DM的小分子化學(xué)藥物和中藥,為臨床研究與預(yù)后及新藥開發(fā)提供理論依據(jù)和思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集的獲取

以"Dermatomyositis"作為關(guān)鍵搜索詞,在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中進(jìn)行搜索,獲取已公布的DM基因芯片信息,下載符合本研究標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)集,具體信息見表1。

表1 數(shù)據(jù)集基本信息

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理及差異表達(dá)基因(DEGs)篩選

用R語言軟件讀取并下載原始數(shù)據(jù)集,通過oligo包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及背景矯正,標(biāo)準(zhǔn)歸一化后,使用sva包和limma包處理不同平臺間的批次效應(yīng)后合并3個肌肉組織數(shù)據(jù)集,采用limma包分別對肌肉組織和皮膚組織數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析,以|log2FC|≥0.58和調(diào)整后的P<0.05為存在差異,篩選出DEGs。

1.3 功能富集分析

利用富集分析工具DAVID(http: //david.ncifcrf.gov), 分別勾選基因本體(GO)分析的生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)以及京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析的Pathway, 使用R語言軟件包可視化分析結(jié)果,明確差異基因參與的 GO 功能富集和KEGG 通路富集情況。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)與關(guān)鍵基因分析

將目標(biāo)導(dǎo)入STRING在線工具(http: string-db.org/)獲得蛋白互相作用的網(wǎng)絡(luò),同時導(dǎo)出combined score>0.7的文檔信息文件到Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化。此外,使用插件MCODE執(zhí)行PPI網(wǎng)絡(luò),聚類功能按score進(jìn)行排序,識別出最重要的模塊; 使用CytoHubba插件,根據(jù)Degree算法進(jìn)一步篩選核心基因。

1.5 核心基因受試者工作特征(ROC)曲線分析

使用OECloud(https: //cloud.oebiotech.cn)工具上的ROC曲線分析曲線功能,對10個核心基因進(jìn)行分析,以此來驗證核心基因的可靠性。

1.6 免疫浸潤分析及核心基因與免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性分析

對2個不同組織數(shù)據(jù)集樣本分別進(jìn)行了免疫細(xì)胞浸潤分析, CIBERSORT R軟件包和LM22文件被用來在本地運行算法,過濾掉P>0.05的樣本,得到免疫細(xì)胞浸潤矩陣,按照不同組織中免疫細(xì)胞占比中位數(shù)進(jìn)行排序。R語言中g(shù)gplot2包用于繪制22種免疫浸潤細(xì)胞的箱線圖,并可視化免疫細(xì)胞浸潤的差異。使用Spearman相關(guān)性分析研究10個核心基因表達(dá)量與22種免疫浸潤細(xì)胞豐度之間的相關(guān)性,并繪制相關(guān)性熱圖。

1.7 小分子化學(xué)藥物預(yù)測

DREIMT是一種新的假設(shè)生成網(wǎng)絡(luò)工具,用于對免疫調(diào)節(jié)進(jìn)行藥物優(yōu)先級分析。使用DREIMT在線分析工具(http://www.dreimt.org),輸入差異基因進(jìn)行小分子藥物預(yù)測。

1.8 核心基因中草藥篩選

Coremine Medical(https://coremine.com/medical/)數(shù)據(jù)庫是基于本體的國際醫(yī)學(xué)信息檢索平臺,可以通過輸入基因名檢索出與該基因相關(guān)的疾病及潛在治療藥物。在Coremine Medical數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入10個核心基因名稱及dermatomyositis, 下載traditional Chinese medicine模塊中的數(shù)據(jù),得到可用于DM治療的中藥。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs分析

使用limma包識別了數(shù)據(jù)集中疾病和對照之間的DEGs。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與健康者相比,DM肌肉組織中有552個基因存在差異表達(dá),其中402個基因表達(dá)上調(diào),150個基因表達(dá)下調(diào); 皮膚組織中有970個差異基因,其中686個基因表達(dá)上調(diào), 284個基因表達(dá)下調(diào)。此外,共確定了170個交集DEGs,去除6個上調(diào)、下調(diào)不一致的基因,剩余164個DEGs成為分析目標(biāo),見圖1。

A: 肌肉組織差異基因火山圖(藍(lán)色、灰色、紅色分別表示下調(diào)、無差異、上調(diào));B: 肌肉組織差異基因熱圖(紅色代表DEGs高表達(dá),藍(lán)色代表DEGs低表達(dá)); C: 皮膚組織差異基因火山圖;D: 皮膚組織差異基因熱圖; E: 2組差異基因交集Venn圖。

2.2 DEGs的GO富集分析結(jié)果

DEGs的GO注釋獲得了BP、CC、MF共3個部分的結(jié)果。提取BP、CC、MF富集數(shù)目分別前5位的條目,由BP分析可知富集基因數(shù)較多的條目為固有免疫應(yīng)答、對病毒的防御反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、對病毒的反應(yīng)和免疫應(yīng)答; 由CC分析可知富集基因數(shù)較多的條目為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)溶膠、胞外區(qū)和細(xì)胞外間隙等; 由MF分析可知,大量基因主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚活性、受體結(jié)合和雙鏈RNA結(jié)合,見圖2。

圖2 BP、CC、MF差異基因富集數(shù)目分別前5位的條目

2.3 DEGs的KEGG富集分析結(jié)果

KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示, DEGs主要涉及的信號通路有: 新型冠狀疾病病毒、甲型流感、Epstein-Barr病毒感染、麻疹、丙型肝炎、Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、NOD樣受體等,見圖3。

圖3 差異基因KEGG信號通路富集結(jié)果圖

2.4 差異基因編碼蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)

目標(biāo)基因通過STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了一個包含164個節(jié)點和1 014條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖4A), 將關(guān)于PPI網(wǎng)絡(luò)的tsv格式的數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape軟件(圖4B), 通過MCODE插件識別出最重要的模塊,該模塊包含32個上調(diào)基因(圖4C); CytoHubba插件通過Degree算法篩選出前10位基因作為關(guān)鍵基因(圖4D), 按照連接度由高到低分別為:STAT1、MX1、IFIT3、OAS2、IFI35、RSAD2、IFIT1、OAS1、ISG15、IRF7。

A: 交集DEGs在STRING中的PPI圖; B: 交集DEGs在Cytoscape中的PPI圖;C: 重要模塊核心子網(wǎng)絡(luò)圖; D: 10個核心基因網(wǎng)絡(luò)圖。

2.5 核心靶基因ROC分析結(jié)果

ROC的曲線下面積(AUC)在0～1, 數(shù)值越大說明該模型的性能越好,是目前認(rèn)為評估預(yù)測分布模型準(zhǔn)確性的標(biāo)準(zhǔn)方法。本研究通過繪制ROC曲線圖,評估10個核心基因作為DM疾病預(yù)測靶點的準(zhǔn)確性,其中STAT1(AUC=0.88)、RSAD2(AUC=0.87)、OAS2(AUC=0.87)、OAS1(AUC=0.75)、MX1(AUC=0.83)、ISG15(AUC=0.92)、IRF7(AUC=0.87)、IFIT3(AUC=0.81)、IFIT1(AUC=0.89)、IFI35(AUC=0.91)的AUC基本在0.8以上,進(jìn)一步證明上述核心基因作為靶點基因的可靠性。

2.6 免疫浸潤及與核心基因相關(guān)性分析結(jié)果

免疫浸潤結(jié)果顯示,與正常肌肉組織相比,血漿細(xì)胞浸潤在DM疾病肌肉組織中占主導(dǎo)地位,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5A); 肌肉組織中10個核心基因與血漿細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞的免疫浸潤水平呈正相關(guān)(P<0.05), 與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及單核細(xì)胞的免疫浸潤水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)(圖5B)。與正常皮膚組織相比, M2巨噬細(xì)胞浸潤在DM疾病皮膚組織中大量滲透,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖6A),皮膚組織中10個核心基因與M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和記憶性活化CD4+T細(xì)胞的免疫浸潤水平呈正相關(guān),與靜息肥大細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及靜息性樹突狀細(xì)胞的免疫浸潤水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)(圖6B)。

A: 免疫浸潤細(xì)胞結(jié)果圖; B: 核心基因與免疫細(xì)胞之間含量的相關(guān)性熱圖。

A: 免疫浸潤細(xì)胞結(jié)果圖; B: 核心基因與免疫細(xì)胞之間含量的相關(guān)性熱圖。

2.7 DREIMT小分子藥物預(yù)測結(jié)果

根據(jù)藥物優(yōu)先級評分(|tau|)選擇排名前10位的潛在小分子藥物,見表2。將藥物名字分別輸入到DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com)中進(jìn)行檢索,獲得10個潛在小分子藥物的相關(guān)信息,為之后的實驗驗證提供了理論依據(jù)。

表2 排名前10位的潛在小分子藥物

2.8 中草藥篩選結(jié)果

借助Coremine Medical數(shù)據(jù)庫,獲得核心基因可用于治療DM的中草藥分別為丹參、三七葉、三七花、茶樹根、三七、原蠶蛾、蠶沙、厚樸花和厚樸共9種,見表3。

表3 靶基因用于治療DM的中草藥信息

3 討 論

DM是一種慢性自身免疫性疾病,主要發(fā)生在骨骼肌和皮膚[2], 常?？焖龠M(jìn)展成肺間質(zhì)病變[3]。本研究通過分析DM芯片數(shù)據(jù)集,得到與病理過程密切相關(guān)的致病基因,旨在探索可能治療DM的潛在化學(xué)藥物和中草藥,為后續(xù)疾病的治療提供新思路。本研究通過對肌肉和皮膚組織數(shù)據(jù)集進(jìn)行DEGs篩選,對2組DEGs的交集基因進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。相關(guān)研究[4]提出,新冠肺炎相關(guān)肌炎可能是DM的假設(shè),主要是因為COVID-19中的器官損傷部分歸因于Ⅰ型干擾素(IFN-I), 而現(xiàn)在已知干擾素在DM的肌纖維損傷中起著重要作用,特別是IFN-I與DM等自身免疫性疾病的發(fā)病機制相關(guān)。KEGG主要富集在病毒性通路上,除上面提到的新型冠狀病毒以外,還有甲型流感、Epstein-Bar病毒(EBV)感染、麻疹、丙型肝炎、卡波西肉瘤-相關(guān)皰疹病毒感染,病毒感染可影響DM患者巨噬細(xì)胞的分化,從而影響M1與M2巨噬細(xì)胞的平衡,導(dǎo)致病情惡化[5]。個體免疫細(xì)胞功能和分化異常以及體液免疫發(fā)生改變,會引起細(xì)胞因子和化學(xué)分子不適當(dāng)產(chǎn)生,引發(fā)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致骨骼肌肉損傷以及其他系統(tǒng)受累[6], 這與本研究DEGs的GO富集結(jié)果一致。

免疫浸潤分析在DM的研究中一直發(fā)揮重要作用。本研究免疫細(xì)胞浸潤結(jié)果顯示,在肌肉組織中,漿細(xì)胞和T細(xì)胞被認(rèn)為高度表達(dá)。研究[7]證明,漿細(xì)胞可能與肌肉炎癥有關(guān),但不能證明漿細(xì)胞紊亂直接與DM的發(fā)病機制有關(guān); 在皮膚組織中,巨噬細(xì)胞占炎癥浸潤的大部分,研究[8]表明, M2巨噬細(xì)胞的高表達(dá)能夠抑制免疫反應(yīng),巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可能與DM有關(guān),因此巨噬細(xì)胞紊亂可能是DM的另一個致病機制。

通過STRING和Cytoscape篩選出來的前10位核心基因依次為STAT1、MX1、IFIT3、OAS2、IFI35、RSAD2、IFIT1、OAS1、ISG15、IRF7。STAT1是STAT蛋白家族的成員,具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活的雙重功能,許多參與自身免疫和炎癥疾病發(fā)病機制的細(xì)胞因子使用STAT來轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號。STAT1是由干擾素-γ(IFN-γ)激活的轉(zhuǎn)錄因子。研究[9]證明, STAT1在DM中的萎縮性肌纖維中高度表達(dá)。MX1屬于IFN誘導(dǎo)的GTP結(jié)合蛋白,對各種RNA病毒和一些DNA病毒具有抗病毒活性,在誘導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)因子中,一些MX蛋白成為抵御甲型流感病毒的關(guān)鍵組成部分[10], 這與本研究中DEGs富集的KEGG通路內(nèi)容高度一致。IFIT3作為一種新型的抗病毒基因[11], 是細(xì)胞和病毒過程、細(xì)胞遷移、增殖、信號傳導(dǎo)和病毒復(fù)制的抑制劑,是IFN-I系統(tǒng)的代表基因之一; IFIT1也是一種抗病毒蛋白,與IFIT3一樣,二者在生物過程中都參與免疫、對病毒的防御反應(yīng)[12], 表現(xiàn)在疾病上,則是參與DM的免疫反應(yīng)。OAS2和OAS1同屬于OAS家族,是由IFN誘導(dǎo)的雙鏈RNA激活酶,在細(xì)胞先天抗病毒反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[13], 已有研究[14]分析數(shù)據(jù)表明,所有OAS基因都在青少年DM肌肉活檢中顯著上調(diào);OAS基因可能在其他細(xì)胞過程中發(fā)揮作用,如生長、分化、凋亡及基因調(diào)節(jié),狼瘡(CLE)和DM的皮膚病變中發(fā)生了過度的角質(zhì)細(xì)胞凋亡,這也證實了這一點[15]。IFI35主要參與并調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)的響應(yīng),抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移[16]。IFN誘導(dǎo)基因可能與DM的發(fā)病機制有關(guān)[17-18], 而IFI35作為一種IFN誘導(dǎo)的蛋白質(zhì),應(yīng)當(dāng)予以重視。RSAD2是一種IFN誘導(dǎo)抗病毒蛋白,在Ⅰ型和Ⅱ型IFN誘導(dǎo)的細(xì)胞抗病毒狀態(tài)中起著重要作用[19], 能夠抑制廣泛的DNA和RNA病毒,包括KEGG通路中的甲型流感、丙型肝炎等病毒。RSAD2已被發(fā)現(xiàn)與各種自身免疫性疾病有關(guān),如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎等[20]。研究[21]證明, ISG15共軛物存在于自身免疫性人類疾病組織樣本中。ISG15可以誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞增殖,充當(dāng)中性粒細(xì)胞的趨化因子,并作為IFN-γ誘導(dǎo)的細(xì)胞因子,在抗菌免疫中發(fā)揮重要作用[22]。研究[23]指出, IFN刺激基因15(ISG15)、IFN調(diào)節(jié)基因7(IRF7)的mRNA表達(dá)顯著上調(diào),并且發(fā)現(xiàn)成人發(fā)病臨床肌病性皮肌炎(CADM)患者的外周血中過度產(chǎn)生IFN-α蛋白。IRF7是IFN-I依賴性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑,在對DNA和RNA病毒的先天免疫反應(yīng)中也起著關(guān)鍵作用。在一項青少年DM的研究[24]中,高表達(dá)基因為ISG15(408倍)、IFIT3(261倍)、MX1(99倍)和IRF7(37倍)。

治療DM的藥物主要局限在糖皮質(zhì)激素、硫唑嘌呤、霉酚酸酯、環(huán)磷酰胺、靜脈免疫球蛋白等,還有一些老藥新用的藥物,如環(huán)孢素A、他克莫司等[25], 但患者預(yù)后普遍不佳。本研究通過分析DEGs, 獲得10個得分較高的小分子藥物,分別為芐達(dá)明(benzydamine)、脫氧皮質(zhì)酮(desoxycorticosterone)、甲砜霉素(thiamphenicol)、胡椒堿(piperine)、二氟拉松(diflorasone)、骨化三醇(calcitriol)、阿利維A酸(alitretinoin)、阿爾維林(alverine)、維A酸(tretinoin)、氟尼縮松(flunisolide), 這些藥物在治療DM方面具有豐富的潛力,可以在未來的實驗中加以驗證。

鄧韻珊等[26]通過統(tǒng)計使用頻次得出治療DM的中藥主要有黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)、丹參、薏苡仁、茯苓、黨參、赤芍、牛膝、山藥、牡丹皮、甘草、生地黃、金銀花、紅花、熟地黃、雞血藤、連翹、蒼術(shù)、黃柏等藥物。本研究通過對疾病和核心基因的探索,除丹參以外,還分析出三七葉、三七花、三七、茶樹根、原蠶蛾、蠶沙、厚樸花、厚樸存在治療DM的可能性,為今后中醫(yī)治療DM提供了臨床用藥思路。