基于Wnt/β-catenin 信號通路探討四君子湯對胃癌脾氣虛證裸鼠的作用機(jī)制*

陳 成，付 越，李 亮，李 豐

湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208

胃癌是世界上發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，對人類健康和安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）最新統(tǒng)計(jì)，2020 年全球大約76.3 萬人死于胃癌，在惡性腫瘤發(fā)病率排名第五，死亡率排名第四［1］。東亞、東歐和南美是胃癌高發(fā)的重點(diǎn)地區(qū)［2］。其發(fā)生發(fā)展是一個多因素?fù)诫s、存在多個階段的復(fù)雜病理過程。臨床實(shí)踐和科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在治療癌癥方面具有確切療效［3］。四君子湯源自《太平惠民和劑局方》。LI等［4］研究發(fā)現(xiàn)四君子湯可整合增強(qiáng)非替尼抗癌的調(diào)節(jié)特性，提示四君子湯可能在癌癥治療中發(fā)揮作用。LUO 等［5］通過高通量組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)四君子湯可通過上調(diào)MicroRNA 表達(dá)改善胃癌癥狀，其靶基因中關(guān)系最為密切的通路是Wnt/β-catenin。Wnt/β-catenin 是一個高保守的信號通路，大量證據(jù)證明其參與了腫瘤的增殖、分化、遷移和侵襲過程［6］。因此，這一分子途徑在癌癥靶向治療中具有重要意義。有研究揭示脾氣虛證在胃癌的整個病程中具有重要作用［7］。四君子湯為治療脾氣虛證的代表方，但四君子湯能否通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin發(fā)揮作用的機(jī)制仍不明確。

前期研究發(fā)現(xiàn)四君子湯對胃癌脾氣虛證具有改善作用［8］，四君子湯通過作用于血漿和唾液的共同靶基因miR-151a-3 調(diào)控胃癌脾氣虛證的發(fā)生、發(fā)展。因此，基于前期研究基礎(chǔ)，本研究以Wnt/β-catenin 信號通路為切入點(diǎn)進(jìn)一步探討四君子湯對胃癌脾氣虛證的治療作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞人胃癌NCI-N87 細(xì)胞購自北納生物制品公司（質(zhì)檢編號：338548）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物BALB/c 雄性裸鼠25 只，4～6 周齡，體質(zhì)量（16±4）g，湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SYXK（湘）2019-0009，飼養(yǎng)在濕度（50±10）%和溫度（22±2）℃的環(huán)境下，實(shí)驗(yàn)方案已通過動物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理編號：LL2020061501）。

1.3 藥品、試劑與儀器

1.3.1 四君子湯 由人參12 g、白術(shù)12 g、茯苓12 g 和甘草6 g 組成，購于遼寧龍參健康藥業(yè)有限公司（批號：200905），經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院袁林祥教授鑒定合格。四君子湯藥液制備：以10倍水充分浸泡中藥2 h，回流提取2 次，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，75 ℃蒸發(fā)濃縮成2 g/mL 的藥液于-20 ℃冰箱保存。灌胃時水浴加熱至37 ℃。

1.3.2 番瀉葉 購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（批號：201019），以10倍水充分浸泡30 min，回流提取2 次，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，75 ℃蒸發(fā)濃縮成1 g/mL的藥液于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 主要試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)基（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：MA0215-Feb-16G2）；BI特級胎牛血清（Biological Industries 公司，批號：04-001-1ACS）；超純總RNA 提取試劑盒（新景生物試劑開發(fā)有限公司，批號：5003050）；BCA 蛋白定量試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司，批號：E-BC-K318-M）；ECL 發(fā)光液（Biosharp 公司，批號：BL520B）；RIPA 蛋白裂解液（批號：CW2333s）、蛋白磷酸酶抑制劑混合物（批號：CW2383S）；SDSPAGE上樣緩沖液（批號：CW0027S）均購自康為世紀(jì)科技有限公司；Wnt1、β-catenin、C-myc、Mmp-7、Gsk-3β、GAPDH 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)科技有限公司，批號分別為：27935-1-AP、66379-1-Ig、67447-1-Ig、10374-2-AP、22104-1-AP、10494-1-AP）；山羊抗兔免疫球蛋白、山羊抗鼠免疫球蛋白（伊萊瑞特生物科技有限公司，批號分別為E-AB-1003、E-AB-1001）。

1.3.4 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司）；低溫高速離心機(jī)（長沙維爾康）；varioskan LUX酶標(biāo)儀（Thermo 公司）；蛋白電泳儀、蛋白表達(dá)成像系統(tǒng)、580BRMy-CyclerPCR 儀、ChemiDocXRS+凝膠成像分析系統(tǒng)均美國Biorad公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制備

1.4.1.1 脾氣虛證制備 將20 只裸鼠分為正常組6 只、模型組14 只，正常組常規(guī)喂養(yǎng)，灌胃蒸餾水；模型組灌胃番瀉葉結(jié)合饑飽失常法制備脾氣虛證模型，番瀉葉藥液（1 g/mL）按每日10 mL/kg劑量灌胃，灌胃后禁食12 h，再恢復(fù)足量喂食，共15天。

1.4.1.2 人胃癌裸鼠原位移植瘤模型制備［9］另取5 只4～6 周齡BALB/c 雄性裸鼠，將NCI-N87 人源胃癌細(xì)胞懸液（2×106/mL）接種于裸鼠腋下，培育胃癌組織塊。觀察裸鼠腋下種植瘤生長情況，長到直徑10 mm 左右剝?nèi)〕鰜恚鳛樵灰浦擦龅陌┰?。脫頸處死癌源裸鼠，剝?nèi)∫赶履[瘤，清理瘤體上的包膜纖維和殘留血管等，PBS 溶液沖洗呈魚肉狀，剪成1 mm 大小瘤體，將瘤體種植于脾氣虛證裸鼠胃體上，用無菌針頭輕微挑破胃大彎中部皮下筋膜，微微滲血即可，將制備好的瘤體用OB 膠粘貼于筋膜劃破處，醫(yī)用膠凝固定，粘牢瘤體，分層關(guān)閉腹腔，整個操作過程要迅速、保溫，嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則。

1.4.2 動物分組、干預(yù)及樣本采集 將造模成功的模型組（14 只）中裸鼠隨機(jī)挑選7 只（四君子湯組）灌胃四君子湯（10.92 g/kg），每日1 次，剩余裸鼠仍記為模型組。模型組、正常組灌胃蒸餾水。于造模后14天末，禁食禁水12 h，處死裸鼠，打開腹腔，分離剝?nèi)∧Ｐ徒M和四君子湯組裸鼠胃癌組織。測量腫瘤質(zhì)量，置于無菌凍存管-80 ℃冰箱保存。

1.5 觀察指標(biāo)及測定方法

1.5.1 中醫(yī)行為學(xué)表征及體質(zhì)量 造模后，每日清晨8 點(diǎn)密切觀察3 組裸鼠精神狀態(tài)、皮膚色澤、反應(yīng)力、活動度及肛門、糞便狀態(tài)［10］等行為學(xué)表征，每3天測量裸鼠體質(zhì)量。

1.5.2 瘤體體積及抑瘤率 末次給藥后處死裸鼠，稱重腫瘤組織，計(jì)算腫瘤生長抑制率（抑瘤率）。

抑瘤率（%）=（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%

1.5.3 腫瘤組織Wnt/β-catenin 相關(guān)蛋白表達(dá)檢測（Western blot法） 將-80 ℃冰箱中的腫瘤組織取出，稱重，在研磨器中加入含蛋白酶抑制劑的裂解液，冰上低溫研磨，離心取上清，用BCA試劑盒測定胃癌組織蛋白濃度，配上樣緩沖液，于-20 ℃保存。剩余原液置-80 ℃保存。電泳條件：160 V，30 min，400 V，90 min。PVDF膜濕轉(zhuǎn)400 mA，1 h。5%脫脂奶粉搖床封閉90 min，TBST沖洗干凈牛奶后孵育一抗Wnt1 抗體（1∶1000）、β-catenin 抗體（1∶30000）、C-myc 抗體（1∶30000）、Mmp-7 抗體（1∶5000）、Gsk-3β 抗體（1∶4000）4 ℃過夜，TBST 清洗4 次，每次8 min，37 ℃孵育二抗（兔抗1∶10000，鼠抗1∶10000）1 h，TBST 清洗4 次，8 min，ECL 顯影液于凝膠成像系統(tǒng)中顯影成像，Image J 軟件分析圖像。

1.5.4 Wnt1、β-catenin、C-myc、Mmp-7 和Gsk-3β的mRNA表達(dá)檢測（qPCR法） -80 ℃冰箱取出腫瘤組織稱重，TRIzol法提取胃癌組織RNA，測其濃度，按照1000 ng每20 μL逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR染料，檢測Wnt-1、β-catenin、C-myc、Mmp-7和Gsk-3β的mRNA 表達(dá)（qPCR），以GAPDH 為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算各mRNA相對表達(dá)量。各引物序列見表1。

表1 Wnt-1、β-catenin、C-myc、Mmp-7和Gsk-3β引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠脫落情況手術(shù)種瘤后，模型組死亡1只，四君子湯組死亡1只。

2.2 裸鼠中醫(yī)行為學(xué)表征正常組裸鼠活動度正常，皮毛柔順有光澤，反應(yīng)靈敏、大小便正常；模型組裸鼠精神萎靡不振，反應(yīng)遲鈍，弓背懶動，皮毛雜亂，肛門紅腫且濕潤，大便呈溏狀；四君子湯組裸鼠精神狀態(tài)改善，活動度提高，反應(yīng)尚佳，無明顯弓背懶動現(xiàn)象，皮膚光澤度尚可，泄瀉情況改善，糞便數(shù)量減少并趨于正常，肛周未見紅腫，便質(zhì)變硬，呈黑褐色。

2.3 裸鼠體質(zhì)量正常組裸鼠體質(zhì)量呈平穩(wěn)上升趨勢；與正常組相比，不同時間段模型組、四君子湯組體質(zhì)量降低（P＜0.05）。與模型組相比，第19 天開始，四君子湯組體質(zhì)量增加（P＜0.05）。見表2。

表2 不同時間段3組裸鼠體質(zhì)量比較（±s）g

表2 不同時間段3組裸鼠體質(zhì)量比較（±s）g

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組四君子湯組第28天25.56±0.62 18.28±0.37*21.63±0.42*#鼠數(shù)6 6 6第16天24.17±0.40 20.25±0.54*20.55±0.41*第19天24.43±0.70 19.95±0.47*20.88±0.40*#第22天25.16±0.64 19.48±0.39*21.13±0.34*#第25天25.23±0.74 18.93±0.42*21.33±0.40*#

2.4 裸鼠瘤體質(zhì)量與模型組相比，四君子湯組瘤體質(zhì)量減輕（P＜0.05），抑瘤率為47%。見表3。

表3 3組裸鼠瘤體質(zhì)量比較（±s）g

表3 3組裸鼠瘤體質(zhì)量比較（±s）g

注：#表示與模型組比較，P＜0.05；-表示無瘤體

組別正常組模型組四君子湯組瘤體質(zhì)量-0.045±0.0078 0.024±0.0040#鼠數(shù)6 6 6

2.5 Wnt-1、β-catenin、C-myc、Mmp-7和Gsk-3β的mRNA 表達(dá)與模型組相比，四君子湯組Wnt1、βcatenin、C-myc和Mmp-7的mRNA表達(dá)下降（P＜0.05），Gsk-3β的mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組裸鼠Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)結(jié)果（±s）

表4 兩組裸鼠Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)結(jié)果（±s）

注：：#表示與模型組比較，P＜0.05

組別模型組四君子湯組Gsk-3β mRNA 1.53±1.25 2.18±1.16#鼠數(shù)6 6 Wnt-1 mRNA 0.72±0.35 0.33±0.12#β-catenin mRNA 1.17±0.80 0.51±0.18#C-myc mRNA 1.16±0.55 0.23±0.17#Mmp-7 mRNA 1.04±0.27 0.47±0.13#

2.6 Wnt-1、β-catenin、C-myc、Mmp-7 和Gsk-3β的蛋白表達(dá)與模型組相比，四君子湯組Wnt-1、β-catenin、C-myc和Mmp-7蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Gsk-3β蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見表5和圖1。

圖1 兩組裸鼠胃癌組織蛋白電泳

表5 兩組裸鼠Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)（±s）

表5 兩組裸鼠Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)（±s）

注：#表示與模型組比較，P＜0.05

組別模型組四君子湯組Gsk-3β 0.65±0.20 1.14±0.28#鼠數(shù)6 6 Wnt-1 1.15±0.20 0.56±0.22#β-catenin 1.50±0.77 0.60±0.04#C-myc 1.06±0.19 0.78±0.04#Mmp-7 0.97±0.06 0.75±0.08#

3 討論

胃癌是一種常見的惡性病質(zhì)，包括上皮內(nèi)瘤變、黏膜內(nèi)癌、黏膜下癌及浸潤癌，病因未明，可發(fā)生于胃的任何部位［11］。胃癌屬中醫(yī)“反胃”“胃脘痛”“噎膈”“癥瘕”等范疇［12］。中醫(yī)認(rèn)為脾胃為后天之本，脾胃受損則元?dú)獠怀洌T病由生，致積聚結(jié)塊。現(xiàn)代研究認(rèn)為胃癌的發(fā)生與“虛”“痰”“瘀毒”等因素密切相關(guān)，因脾氣不足，運(yùn)化水濕失治，聚濕成痰，進(jìn)一步加重中焦虛弱，氣血化生乏源，血液運(yùn)行不暢，瘀血由生，痰瘀互結(jié)，痰瘀蘊(yùn)久化毒，最后生成痰瘀毒交結(jié)的病理產(chǎn)物［13］。病性是本虛標(biāo)實(shí)，脾胃氣虛是胃癌產(chǎn)生的根本，貫穿胃癌早、中、晚期及術(shù)后等，健脾益氣是治病求本，培本固元［14］?，F(xiàn)代藥理研究顯示，機(jī)體的免疫逃逸也是造成腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖的主要原因，健脾益氣法可增強(qiáng)自身免疫［15］。因此可通過培本固元，調(diào)節(jié)機(jī)體陰陽、臟腑、氣血、經(jīng)絡(luò)平衡，調(diào)動人體內(nèi)的防御機(jī)制，抑制腫瘤生長。四君子湯方中人參為君，甘溫益氣，健脾養(yǎng)胃；臣以白術(shù)苦溫健脾燥濕，益氣助運(yùn)；佐以甘淡茯苓，健脾滲濕，苓術(shù)相配則健脾祛濕之力顯著；使以甘草益氣和中，調(diào)和諸藥［16］。慢性萎縮性胃炎是胃癌進(jìn)程中的重要過程，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)四君子湯可改善胃局部炎癥和外周血白細(xì)胞炎癥，降低慢性胃炎患者胃癌的發(fā)生率［17］。四君子湯還可抑制胃癌干細(xì)胞GCSCs，通過降低β-catenin 核積累和DNA 結(jié)合活性來實(shí)現(xiàn)［18］。

Wnt/β-catenin 信號通路也被稱為經(jīng)典或β-catenin 依賴信號通路，是一個保守的信號軸，參與各種生理過程，如細(xì)胞生長、分化、凋亡、遷移、侵襲和組織穩(wěn)態(tài)［19］。研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號通路與胃癌、肝癌和乳腺癌等多種惡性病質(zhì)密切相關(guān)［20］，其通路的激活依賴于β-catenin 的過度積累和表達(dá)。但一種被稱為“破壞復(fù)合物”的復(fù)合物有助于β-catenin 在生理?xiàng)l件下的降解?！捌茐膹?fù)合物”由腺瘤性大腸息肉病、Dishevelled（Dvl）、酪蛋白激酶1 和Axin/Axin2 組成，β-catenin 會導(dǎo)致其被糖原合成酶激酶-3β（Gsk-3β）降解，然而，Dvl 的刺激會“破壞復(fù)合體”，從而導(dǎo)致抑癌基因Gsk-3β失活，大量β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，與淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子和t 細(xì)胞因子相互作用，從而活化轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)下游靶基因如C-myc 和Mmp-7 等，造成細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控是惡性腫瘤的重要特征之一，這將對細(xì)胞產(chǎn)生災(zāi)難性影響［21］。Wnt1是Wnt家族的第一個成員，其在系統(tǒng)發(fā)育方面保守，對于腫瘤發(fā)生和多種發(fā)育過程至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)Wnt1 表達(dá)與胃癌大小、分化程度、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存率密切相關(guān)。正常成熟的胃組織Wnt1信號表現(xiàn)缺如［22］。說明Wnt1可作為胃癌潛在生物標(biāo)志物的靶標(biāo)［23］。β-catenin又名B-連環(huán)蛋白，是Wnt通路的關(guān)鍵因子，幽門桿菌可激活β-catenin 以促進(jìn)胃上皮細(xì)胞的腸道轉(zhuǎn)分化［24］，β-catenin 及胃癌相關(guān)E-鈣黏蛋白被證實(shí)不僅是黏附連接的靜態(tài)成分，而且是下游Wnt 信號級聯(lián)的重要介質(zhì)，二者可作為胃癌發(fā)生和發(fā)展的獨(dú)立危險因素［25］。C-myc基因是MYC基因家族的重要成員之一，C-myc蛋白為細(xì)胞程序的主要調(diào)節(jié)劑，該基因既是可轉(zhuǎn)基因，也是受多種因子調(diào)控的調(diào)控基因。C-myc通過腫瘤細(xì)胞內(nèi)在機(jī)制及宿主免疫和TME 依賴機(jī)制啟動和維持癌癥［26］。Mmp-7 蛋白（又稱金屬蛋白酶7）屬M(fèi)mp 家族，參與基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，導(dǎo)致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。LONG等［27］發(fā)現(xiàn)Mmp-7與胃癌的分化程度和臨床分期密切相關(guān)，并提示Mmp-7參與了胃癌組織的侵襲和轉(zhuǎn)移，有望作為確定胃癌進(jìn)展和預(yù)后的有用生物標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示，模型組裸鼠胃癌組織中Wnt1、β-catenin、C-myc 和Mmp-7 蛋白及其mRNA 表達(dá)上升，Gsk-3β蛋白及其mRNA 表達(dá)下降，四君子湯組Wnt1、β-catenin、C-myc 和Mmp-7 蛋白及其mRNA表達(dá)下降，Gsk-3β蛋白及其mRNA表達(dá)上升。由此推斷，四君子湯可通過影響Wnt 信號通路相關(guān)蛋白來影響胃癌脾氣虛證裸鼠癌瘤體的生長。預(yù)測影響途徑可能是上游wnt 配體的調(diào)控、關(guān)鍵基因β-catenin 核異位下調(diào)和基因表達(dá)或影響下游靶基因C-myc和Mmp-7表達(dá)，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控。

綜上所述，四君子湯可下調(diào)腫瘤因子表達(dá)，在一定程度上抑制Wnt/β-catenin 信號通路的激活，減緩胃癌脾氣虛證病程。