黃芩炭飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陳智

山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟南 250355

黃芩，別名土金茶根、黃金茶，為唇形科植物黃芩（Scutellɑriɑ bɑicɑlensisGeorgi）的干燥根，用藥歷史悠久，是中醫(yī)臨床最常用的中藥之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］。炮制歷史沿革研究表明，清熱多用生黃芩，能清肺胃膽及大腸經(jīng)之濕熱，用于肺熱咳嗽、熱病煩渴、咽喉腫痛；止血多用黃芩炭，用于血熱吐衄，治療火毒熾盛、迫血妄行的血熱出血證［2-4］。黃芩化學(xué)成分主要包括黃酮類化合物、揮發(fā)油、多糖等化學(xué)成分，又以黃酮類成分含量最高?，F(xiàn)代研究已經(jīng)從不同種類的黃芩中提取分離出黃酮類化合物120余種，其中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等被認為是黃芩的特征化學(xué)成分，是控制黃芩及黃芩制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)［5-6］。黃芩制炭后藥性變緩，黃芩在炒炭過程中黃芩苷分解成其苷元黃芩素，苷類含量與黃酮總含量顯著下降，黃芩素含量明顯增加［7］。本研究在《山東省中藥飲片炮制規(guī)范（2012年版）》［8］的基礎(chǔ)上，參照《中國藥典（2020年版）》一部［9］，對黃芩炭炮制規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)進行完善和提高，增加了水分、總灰分檢查項，浸出物檢查項以及黃芩炭的特征圖譜，以增強黃芩炭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的可控性。

儀器與材料

1.實驗器材

1260高效液相色譜儀（Agilent Technologies Inc，DAD）；島津U-2550紫外分光光度計；OS540紅外溫度測量儀（OMEGA）；BS110S電子分析天平；河南予華循環(huán)水式多用真空泵；上海亞榮RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

2.主要藥品與試劑

漢黃芩素對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號T11J11R108209）；黃芩素對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號C20M8Y31962）；黃芩苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號Z28S11X125952）；漢黃芩苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號A09GB144759）；乙腈和甲醇為色譜純級，其他試劑為分析純級；娃哈哈純凈水。

黃芩藥材（編號S1～S10，具體來源信息見表1），經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定為唇形科屬植物黃芩Scutellɑriɑ bɑicɑlensisGeorgi的干燥根。上述藥材分別置熱鍋內(nèi)，武火炒至表面黑褐色，內(nèi)部黃褐色，噴淋清水少許，滅盡火星，取出，及時攤晾，涼透。

方法與結(jié)果

1.性狀鑒別

本品為類圓形或不規(guī)則形段或片，片面黑褐色，內(nèi)部黃褐色，質(zhì)松脆。有焦糊氣，味苦。結(jié)果見圖1。

圖1 黃芩炭性狀鑒別圖（編號S3）

2.薄層色譜（TLC）鑒別

供試品溶液的制備：取本品粉末1 g，加乙酸乙酯-甲醇的混合溶液30 ml，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 ml使溶解，取上清液作為供試品溶液。點樣2 μl。

對照品溶液的制備：取黃芩素對照品、漢黃芩素對照品，分別加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。點樣1 μl。

黃芩對照藥材溶液的制備：取本品粉末1 g，加乙酸乙酯-甲醇的混合溶液30 ml，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 ml使溶解，取上清液作為供試品溶液。點樣2 μl。

薄層板：浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠出品，規(guī)格10 cm×20 cm，批號為202005。展開劑：甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）。展開條件：溫度25 ℃，相對濕度70%。檢視：紫外光燈（365 nm）。

結(jié)果：供試品色譜中，黃芩炭與對照品及黃芩對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯兩個相同的暗色斑點，見圖2、3。

圖2 黃芩炭的薄層色譜（TLC）鑒別圖譜。1為黃芩素對照品，2為漢黃芩素對照品，3～5為S1至S3樣品，6為黃芩對照藥材

圖3 10批黃芩炭的薄層色譜（TLC）鑒別圖譜。1、8為黃芩素對照品，2、9為漢黃芩素對照品，3～7為S1至S5樣品，10～14為S6至S10樣品

3.水分、總灰分、醇溶性浸出物檢測

3.1.水分 黃芩所含成分主要以黃酮類為主，經(jīng)過制炭之后的炮制品，少含揮發(fā)性化學(xué)成分，因此參照《中國藥典（2020年版）》通則0832第二法測定，每批樣本平行測定3次，取3次平均值，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，10批黃芩炭水分為2.60%～7.36%，平均值為5.20%。炭藥吸水性較強，根據(jù)樣品測定結(jié)果，結(jié)合儲藏過程中對水分控制的要求，擬定黃芩炭水分不得超過10.0%。

表2 黃芩炭水分、總灰分、醇溶性浸出物測定結(jié)果（%，n=3）

3.2.總灰分 取各批次黃芩炭藥材粉末，參照《中國藥典（2020年版）》通則2302測定總灰分，每批樣品平行測定3次，取3次測定平均值，結(jié)果見表2。10批黃芩炭總灰分為5.03%～8.92%，平均值為6.39%。根據(jù)樣品測定結(jié)果，擬定黃芩炭總灰分不得超過10.0%。

3.3.醇溶性浸出物 取各批次黃芩炭藥材粉末，照醇溶性浸出物測定方法（《中國藥典（2020年版）》通則2201）項下的熱浸法測定，每批樣品平行測定3次，取3次測定平均值，結(jié)果見表2。10批黃芩炭醇溶性浸出物為23.08%～48.92%，平均值為32.84%。根據(jù)樣品測定結(jié)果，擬定黃芩炭醇溶性浸出物不得少于20.0%。

4.特征圖譜

黃芩中主要含有黃酮類成分，根據(jù)前期實驗結(jié)果表明，黃芩炒炭后，苷類成分向苷元成分轉(zhuǎn)化，結(jié)果見圖4、5，有必要對黃芩炭炮制前后苷及苷元成分進行特征圖譜研究。

圖4 黃芩苷模擬炮制后成分變化

圖5 漢黃芩苷模擬炮制后成分變化

4.1.對照品溶液的制備 分別精密稱定4種對照品（黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素）適量，甲醇定容，配得黃芩苷對照品溶液（0.400 mg/ml）、黃芩素對照品溶液（0.416 mg/ml）、漢黃芩苷對照品溶液（0.204 mg/ml）、漢黃芩素對照品溶液（0.200 mg/ml）。

4.2.供試品溶液的制備 取本品粉末（過四號篩）約1 g，精密稱定，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，精密加入50 ml 70%乙醇，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

4.3.色譜條件 安捷倫1260高效液相色譜儀，色譜分析柱Diamonsil C18（250×4.6 μm，5 μm）；檢測波長275 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μl；設(shè)定A相為1%甲酸水溶液、B項甲醇，流動速度為1 ml/min，梯度洗脫（0～10 min，80%～60%A；10～20 min，60%A；20～30 min，60%～54%A；30～45 min，54%A；45～50 min，54%～50%A；50～80 min，50%～20%A）。

4.4.方法學(xué)考察

4.4.1.精密度考察 連續(xù)6次精密進樣10 μl混合對照品溶液，得各峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）分別為0.29%、0.48%、0.53%、0.74%（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素）。

4.4.2.穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液，每放置2 h測定一次，共6次，得各峰面積的RSD分別為0.67%、0.46%、0.77%、0.43%（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素），表明12 h內(nèi)各指標(biāo)成分未被明顯破壞。

4.4.3.重復(fù)性考察 精密稱定黃芩炭粉末約2 g，共取6份，按照生黃芩待測品制備條件制得樣品溶液，各RSD分別為0.89%、1.53%、1.97%、0.91%（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素），表明實驗有較好重現(xiàn)性。

4.4.4.加樣回收率 取已測知黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素含量的黃芩炭樣品約0.1 g，精密稱定，共取6份，轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，在每一份樣品中精密加入黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品溶液適量，加50%甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。按上述測定方法進行測定，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率實驗結(jié)果

4.5.不同批次黃芩炭指紋圖譜建立及相似度評價 將10批黃芩炭供試品高效液相色譜法（HPLC）圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，設(shè)定S1為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時間窗寬度為0.1，進行多點校正，進行匹配，生成對照圖譜（R），結(jié)果見圖6。經(jīng)過加入對照品，比對保留時間，共指認了3個色譜峰，分別為1號色譜峰黃芩苷、2號色譜峰黃芩素、3號色譜峰漢黃芩素，結(jié)果見圖7。

圖6 10批次黃芩炭生成對照圖譜

圖7 10批次黃芩炭特征圖譜

5.含量測定

黃芩炒炭后，其黃芩苷的含量會降低，會部分轉(zhuǎn)化為黃芩素。但是黃芩炒炭要求“炒炭存性”，為了反映和控制黃芩炭的內(nèi)在質(zhì)量，建立黃芩炭中黃芩素的HPLC含量測定方法。

5.1.供試品的制備 取本品粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

5.2.對照品溶液的配制 取黃芩素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，即得。

5.3.色譜條件 選用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53）為流動相；檢測波長275 nm，理論板數(shù)以黃芩素峰計不低于5 000。柱溫：35 ℃，流速：1.0 ml/min。按此色譜條件進行實驗，色譜峰分離條件好，見圖8、9。

圖8 黃芩素對照品高效液相色譜法（HPLC）色譜圖

圖9 黃芩炭樣品高效液相色譜法（HPLC）色譜圖

5.4.線性關(guān)系的考察 配置對照品溶液（C對為1 mg/ml）2倍比依次稀釋，得不同濃度黃芩素對照品溶液，分別吸取10 μl注入液相色譜儀，按照上述色譜條件分別測定。以黃芩素對照品的進樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程y=4 514 000x+17 648，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5。試驗結(jié)果表明，黃芩素進樣量在0.312 5～10 μg之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

5.5.方法學(xué)考察 實驗結(jié)果表明，儀器精密度良好，平均RSD為0.64%；實驗方法重復(fù)性良好，RSD為1.83%；供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，加樣回收率符合要求。

5.6.樣品測定 分別精密稱取10批黃芩炭粉末各1 g，按4.2項下方法制備供試品溶液，在5.3項下色譜條件檢測，計算樣品含量，結(jié)果見表4。10批樣品中黃芩素的含量均大于1%，且黃芩素含量與炒炭過程中飲片的碳化程度有很大關(guān)系?？紤]市場樣品的情況，暫規(guī)定：本品按干燥品計算，含黃芩素不得少于1.0%。

表4 10批黃芩炭黃芩素含量測定結(jié)果（%，n=3）

討論

本研究對黃芩炭飲片進行了定性鑒別和水分、總灰分、醇溶性浸出物測定，并對其中黃芩素含量進行了測定，并根據(jù)黃芩中黃酮類成分的變化，制定了黃芩炭的特征圖譜，初步擬定了各指標(biāo)的限度標(biāo)準(zhǔn)，使黃芩炭飲片的標(biāo)準(zhǔn)制備更符合臨床應(yīng)用實際。本研究使黃芩炭飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更加完善，能夠達到全面控制黃芩炭飲片質(zhì)量的目的，為黃芩炭飲片的止咳控制提供了可靠有效的手段。

黃芩苷、黃芩素等黃酮類成分是黃芩中主要藥效成分，在黃芩及其制劑中作為主要質(zhì)量控制指標(biāo)［10-11］。原標(biāo)準(zhǔn)黃芩炭僅以黃芩素作為對照進行鑒別，方法專屬性不強。而中藥制炭過程中要求“炒炭存性”，黃芩炭中除黃芩素以外，還含有多種苷類成分及苷元成分，故應(yīng)對其進行整體質(zhì)量控制。制定黃芩炭特征圖譜中發(fā)現(xiàn)，炭化程度對黃芩中苷元成分影響較大，尤其是隨著炭化程度的增加，漢黃芩苷含量顯著下降，部分樣品中漢黃芩苷含量已降至檢測限以下，故特征圖譜中未對漢黃芩苷進行標(biāo)定。

通過實驗發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地、不同種植條件下收集的黃芩炭各成分含量差異較大，這可能是藥材產(chǎn)地氣候環(huán)境、生長年限等原因所致［12-13］。另外，在制備黃芩炭過程中，炒制火力、炭化程度的不同也是造成各批次之間各成分含量差異的重要原因。為更加科學(xué)有效完善黃芩炭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，后續(xù)課題組將繼續(xù)擴大樣本收集范圍，并完善黃芩炭最佳炮制工藝。

利益沖突作者聲明不存在利益沖突