一種高效測定動物源性食品中類固醇激素的方法

陳彤 鐘名琴 邱永為 何玉榆 黃婷

摘? 要：本文基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了一種高效檢測動物源性食品中4種類固醇激素的方法，并對建立的方法進(jìn)行了方法學(xué)的考察與驗(yàn)證，試驗(yàn)對前處理步驟和測定條件進(jìn)行優(yōu)化，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析。醋酸美侖孕酮、17α-群勃龍、甲基睪丸酮、17β-群勃龍的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.996 33、0.995 42、0.996 55、0.993 64，方法檢出限分別為0.051 5 μg/kg、0.097 0 μg/kg、0.093 2 μg/kg、

0.087 3 μg/kg，回收率范圍為93.4％～105.0％、82.2％～102.0％、88.8％～104.0％、85.0％～102.0％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8％～5.2％、0.8％～6.9％、3.0％～6.1％、2.6％～5.4％，所得結(jié)果表明，該方法具有過程簡單，方法檢出限低、回收率較好、精準(zhǔn)度高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，可以為動物源性食品中類固醇激素檢驗(yàn)提供方法支持。

關(guān)鍵詞：類固醇激素；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；動物源性食品；性激素殘留

中圖分類號：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ?文章編號：1001-0769（2023）04-00107-05

類固醇激素（steroid hormones），又稱為甾體激素，是一類擁有環(huán)戊烷多氫菲母核的脂溶性化合物。類固醇激素分為腎上性激素和腎上腺皮質(zhì)激素兩大類別[1]。腎上性激素主要有醋酸美侖孕酮、17α-群勃龍、甲基睪丸酮、17β-群勃龍等，而腎上腺皮質(zhì)激素又稱為糖皮質(zhì)激素，主要有倍他米松、丙酸倍氯米松、潑尼松龍、地塞米松等。類固醇激素有助于調(diào)節(jié)新陳代謝、炎癥、免疫功能、水鹽代謝平衡、性特征的發(fā)育等，在哺乳動物發(fā)育的不同階段均發(fā)揮重要的作用，包括動物的生長、發(fā)育、繁殖、行為變化以及適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境，即使是少量激素都會對動物體產(chǎn)生很大影響[2-5]。類固醇激素在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中具有增強(qiáng)動物體內(nèi)蛋白質(zhì)積累和改善生產(chǎn)性能的作用，少量的喂養(yǎng)成本就可以得到較高的經(jīng)濟(jì)效益，故很多不法商販及養(yǎng)殖者將其添加到飼料中或直接喂食動物以獲得高額的利潤，造成了目前畜牧業(yè)出現(xiàn)濫用類固醇激素類藥物的現(xiàn)象[3，5]。當(dāng)人類長期攝入含激素殘留的食品，超過某一限定值時(shí)將會對人體產(chǎn)生負(fù)反饋?zhàn)饔?，從而破壞機(jī)體的正常生理平衡，致使激素分泌失調(diào)而呈現(xiàn)出不良后果，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致心力衰竭[6-8]。因此，對動物源性食品中的類固醇激素殘留進(jìn)行檢測，對于保護(hù)人們的身體健康，保障畜禽產(chǎn)品的食品安全具有重要的意義。

如今，類固醇激素的殘留分析方法主要包括免疫層析柱法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）、液相色譜法（HPLC）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）等。其中免疫檢測法操作復(fù)雜、周期長、重復(fù)性較差、精確性較差且交叉反應(yīng)率較高，容易出現(xiàn)假陽性，只適合少數(shù)激素類物質(zhì)的分析，難以同時(shí)進(jìn)行多種激素物質(zhì)的同時(shí)定性和定量檢測[1-3，9-10]。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖然能夠高靈敏度檢測類固醇激素，但衍生化步驟操作復(fù)雜，成本和人工費(fèi)用高[11]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法與其相比，操作更為簡單快捷，抗干擾能力強(qiáng)，靈敏度高，且支持多種藥物殘留同時(shí)進(jìn)行定性、定量檢測。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜是理想的檢測動物源性食品中類固醇激素含量的檢測方法。

本研究優(yōu)化并建立了一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中類固醇激素殘留量的方法。該方法簡便快捷、準(zhǔn)確度高、靈敏度高，有效解決了傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法中的缺陷，例如GB/T 20760－2006中前處理過程繁瑣，用時(shí)較長，有機(jī)試劑使用過多，從而為類固醇激素藥物檢測提供全新的技術(shù)支持[12]。

1? 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1儀器

安捷倫1290液相色譜儀、AB Science質(zhì)譜儀、氮吹儀、漩渦混合儀、電子天平、冷凍離心機(jī)、超純水儀、超聲波清洗機(jī)、Captiva EMR-Lipid脂肪去除柱、獸藥分析專用 QuEChERS 萃取鹽包、陶瓷均質(zhì)子。

1.1.2? 試劑

乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），乙酸，乙酸銨，復(fù)溶液為甲醇/2 mmol乙酸銨水/甲酸（體積比為30∶70∶0.05）。

1.2? 樣本制備

取適量新鮮豬肉組織，將其攪碎至均勻態(tài)，于－20 ℃避光保存。

1.3? 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

準(zhǔn)確稱取醋酸美侖孕酮、17α-群勃龍、甲基睪丸酮、17β-群勃龍的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配成1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，－20 ℃保存?zhèn)溆茫行?2個(gè)月；分別移取適量4種類固醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 000 μg/mL）于同一容量瓶中，用甲醇逐級稀釋成1.00 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)液，－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，有效?個(gè)月；再移取1.00 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為

10.00 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4? 樣本前處理

準(zhǔn)確稱取試驗(yàn)樣本（5±0.05）g 置于50 mL離心管中，加入3 mL水和陶瓷均質(zhì)子渦旋混合1 min，加入10 mL乙腈超聲提取10 min，加入鹽包，渦旋混勻，9 000 r/min低溫離心

10 min，取全部上清液過Captiva EMR-Lipid脂肪去除柱，擠干小柱，接收全部洗脫液轉(zhuǎn)移至20 mL離心管，60 ℃下氮?dú)獯抵两?，用?fù)溶液定容至1 mL，渦旋45 s后過0.22 μm濾膜，上機(jī)測定。

1.5? HPLC-MS/MS條件

1.5.1 高效液相色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C8，（3.0 mm

×100.0 mm，2.7 ?m）；流動相：A為0.05％乙酸，2 mmol乙酸銨水溶液，B為甲醇；柱溫40.0 ℃；進(jìn)樣體積5.00 μL。具體梯度洗脫程序見表1。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；監(jiān)測反應(yīng)模式：多反應(yīng)監(jiān)測；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：

6 L/min；鞘氣溫度：325 ℃；鞘氣流量：

11 L/min；毛細(xì)管電壓：3 500 V；噴嘴電壓：500 V。

保留時(shí)間、定性離子對、定量離子對、去簇電壓及碰撞能量見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液（0.50 、

1.00、2.00、5.00、10.00 μg/kg），待儀器參數(shù)穩(wěn)定后，對系列標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，醋酸美侖孕酮、17α-群勃龍、甲基睪丸酮、17β-群勃龍相關(guān)系數(shù)

r2分別為0.996 33、0.995 42、0.996 55、0.993 64。具體見表1。

2.2 方法檢出限確定

以空白豬肉樣本為基質(zhì)，做7個(gè)平行添加試驗(yàn)，陽性添加濃度醋酸美侖孕酮、17α-群勃龍、甲基睪丸酮、17β-群勃龍均為

0.500 μg/kg，按照1.4方法進(jìn)行前處理和上機(jī)測定，測得醋酸美侖孕酮、17α-群勃龍、甲基睪丸酮、17β-群勃龍的方法檢出限分別為0.051 5、0.097 0、0.093 2、

0.087 3 μg/kg，具體見表3。計(jì)算公式如下：

檢出限（method detection limit，MDL）（μg/kg） =K·Sb·C/

式中：K取3；Sb為平行測試樣含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差；C為加標(biāo)濃度（μg/kg）； 為平行試樣含量的平均值。

2.3 回收率及精密度確定

以空白豬肉樣本為基質(zhì)，向豬肉樣本中添加類固醇藥物（醋酸美侖孕酮、17α-群勃龍、甲基睪丸酮、17β-群勃龍）濃度水平分別為10.0、20.0、100.0 μg/kg進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。按照方法進(jìn)行前處理，上機(jī)測試，結(jié)果如表2和表3所示。

根據(jù)表4與表5中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，同時(shí)回收率范圍表現(xiàn)較好，醋酸美侖孕酮、17α-群勃龍、甲基睪丸酮、17β-群勃龍的回收率范圍分別為93.4％～105.0％、82.2％～102.0％、88.8％～104.0％、85.0％～102.0％；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.8％～5.2％、0.8％～6.9％、3.0％～6.1％、2.6％～5.4％。該方法的檢出限較低、精準(zhǔn)度較高，峰形受基質(zhì)干擾較少，定性定量準(zhǔn)確，是用于醋酸美侖孕酮、17α-群勃龍、甲基睪丸酮、17β-群勃龍非常理想的檢測方法。

3? 結(jié)論

本文旨在建立一種動物源性食品中4種類固醇激素測定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測定方法，為行政主管部門提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。試驗(yàn)結(jié)果表明，此方法在簡單的前處理提取中能保持較高的準(zhǔn)確度及精確度，而且分離度表現(xiàn)好；與傳統(tǒng)的方法相比，該方法提取時(shí)間較短，操作過程較簡單，有機(jī)溶劑使用較少，節(jié)約了成本并提高了檢測效率，適用于動物源性食品中醋酸美侖孕酮、17α-群勃龍、甲基睪丸酮、17β-群勃龍殘留量的定性、定量檢測。

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