茶葉中硒賦存形態(tài)的檢測研究進展

陳 瑤，薛敏敏，雷朋娜

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗研究院，湖南長沙 410007）

硒（Selenium，Se）作為人體和動物體內(nèi)必需的微量元素，其功能由于形態(tài)的不同而有差異，其中有機硒具有提高免疫力、抗氧化和延緩衰老等作用。硒茶樹有較強富集和轉(zhuǎn)化硒元素的能力，茶葉是人類食物鏈中植物環(huán)節(jié)最佳的補硒資源，硒在茶葉中的賦存形態(tài)決定了人體中硒的營養(yǎng)生理學功能的發(fā)揮和攝入過量可能帶來的毒性[1]。因此，測定茶葉中總硒及硒賦存形態(tài)的含量，對合理膳食攝入硒元素具有重要指導作用。本文對茶葉中總硒及硒賦存形態(tài)的提取和含量檢測方法進行綜合論述，為茶葉中硒元素的賦存形態(tài)的后期研究提供參考。

1 茶葉中總硒及硒的賦存形態(tài)

硒有6 個天然存在的穩(wěn)定同位素，具有-2、0、+4、+6 多種化學價態(tài)，構(gòu)成多種特性的有機和無機硒化物[2]。其中有機硒化物包括含硒的氨基酸、含硒蛋白、硒醇、硒醚、硒酚等及其衍生物，無機硒化物包括含硒酸和含亞硒酸的鈉鹽。

杜琪珍等[3]采用同位素示蹤技術(shù)對硒在茶葉中的成分進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)茶葉中硒蛋白質(zhì)含量最多，占硒總量的80%，無機硒含量最少，僅約占硒總量的8%。茶樹中約80%的硒以有機化合物的形式存在，包括含硒的氨基酸及衍生產(chǎn)物、含硒的蛋白、硒核糖核酸和硒多糖等，其中絕大部分為游離硒蛋白。無機硒主要以SeO3

-和SeO42-的形式存在，在硒總量中的占比不超過16%[4]。

2 總硒及硒的賦存形態(tài)的提取

2.1 總硒的提取

總硒的提取方法較為統(tǒng)一，按照食品安全國家標準GB 5009.93—2017[5]中規(guī)定的方法，直接加硝酸-高氯酸混合酸利用微波消解或加硝酸利用微波消解對樣品進行提取。

2.2 有機硒的提取

有機硒的測定有兩種途徑，第一種是通過分離有機硒和無機硒，檢測出總硒和無機硒的含量，再將二者相減得到有機硒的含量。第二種是利用有機硒的標準品，分別檢測每種賦存形態(tài)硒的有機硒含量，再總和得到有機硒的含量。由于有機硒的標準品較難獲得，所以一般采用第一種。常見的有機硒提取方法包括差減法、有機溶劑萃取法和持續(xù)透析法[6]。

（1）差減法。采用定量檢測茶葉中含有的總硒和無機硒，二者含量相減得到有機硒的含量。無機硒的提取有50% HCl 酸提法、水提法。王梅等[7]通過水提法對富硒螺旋藻片中的無機硒進行提取，發(fā)現(xiàn)總硒和無機硒含量差減后得到有機硒在總硒中的占比在60%以上。

（2）有機溶劑萃取法。利用相似相溶原理提取有機硒，通過有機溶劑如甲苯、乙醇、乙醚和環(huán)己烷等萃取樣品中的有機硒。孫新濤等[8]選取乙醚、乙醇、甲苯有機試劑萃取富硒茶葉的有機硒，對萃取條件進行研究，發(fā)現(xiàn)用乙醇的萃取效果最好，最佳條件為浸提溫度50 ，浸提時間1 h，該方法的回收率為93.8%～95.9%，有機硒占總硒的百分比約為90.48%。

（3）持續(xù)透析法。利用透析袋和去離子水對樣品進行透析，通過持續(xù)換水將茶葉樣品中的無機硒透析到袋外，并測定透析袋內(nèi)有機硒含量。艾春月等[9]通過采用持續(xù)透析法和差減法進行有機硒提取方法優(yōu)選，持續(xù)透析法、差減法測得有機硒含量分別為（154.76±9.47） μg·kg-1、（265.02±6.55） μg·kg-1，富硒茶葉的有機硒提取方法中差減法優(yōu)于持續(xù)透析法。

2.3 硒蛋白的提取

硒蛋白為茶葉中硒的主要存在形態(tài)。硒蛋白提取方法主要有溶劑提取法（水、鹽、乙醇、酸、酶和堿溶液萃取）、微波和超聲輔助提取法等[10]。溶劑提取法是指根據(jù)蛋白的溶解性不同，用蒸餾水、氯化鈉、氫氧化鈉和乙醇溶液為溶劑分離樣品中蛋白，主要用于富硒大米的硒蛋白提取方面。溶劑提取法效率高、成本低，使用較為頻繁，但也有硒蛋白易流失的問題。微波輔助提取法是利用微波的電磁場提高樣品與介質(zhì)分子之間的分離作用，而超聲輔助提取法是利用超聲波加速了樣品和提取液充分混合反應(yīng)，節(jié)省了預處理時間，兩種提取技術(shù)都可達到提高提取效率的效果。VALE 等[11]利用超聲輔助提取技術(shù)對硒營養(yǎng)強化劑中的硒化物進行了提取，用時短且提取效率高，方法回收率達到99%。

3 總硒及硒的賦存形態(tài)分析分離和檢測方法

近年來，針對茶葉樣品中硒的不同賦存形態(tài)研究出現(xiàn)了多種分離和檢測方法。研究表明，隨著聯(lián)用技術(shù)的迅猛發(fā)展，通過高效率的分離技術(shù)和高靈敏度的檢測方法的結(jié)合，可直接得到硒的賦存形態(tài)，從而對茶葉中硒的賦存形態(tài)進行分析。

3.1 氣相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法

氣相色譜- 電感耦合等離子體質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，GC-ICP-MS）是利用氣相色譜儀對樣品進行分離，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜用儀進行檢測的方法。氣相色譜的高效能、高靈敏度、分析速度快、應(yīng)用廣泛以及容易操作等特點，適合分離揮發(fā)性的硒化合物，也可利用衍生劑法使硒化合物衍生出揮發(fā)性，再利用氣相色譜分離進行硒化合物的檢測。GIRáLDEZ 等[12]利用衍生劑對樣品中硒化合物進行衍生化，吸附萃取后使用GC-ICP-MS 進行亞硒酸鹽和硒氨基酸的形態(tài)檢測，結(jié)果表明該方法線性關(guān)系良好、靈敏度高。

3.2 高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法

氫化物-原子熒光光譜法（Hydride Generation-Atomiomic Fluorescence Spectrometry，HG-AFS）具有操作簡單、準確度高、有較寬線性范圍、效率高和消耗低等特點，與高效液相色譜儀聯(lián)用后可檢測不同形態(tài)的硒。章寒英等[13]采用酸和酶兩種方法對樣品進行提取，再利用此種聯(lián)用技術(shù)對樣品進行形態(tài)分析，在11 min 內(nèi)分離出5 種硒形態(tài)。許月明等[14]用高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法檢測出富硒黃山貢菊的樣品中存在4 種硒形態(tài)，其中硒代蛋氨酸含量最多。

3.3 高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法

高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS）由于具有高靈敏度、速度快、同時多元素分析以及寬線性范圍等特點，是元素形態(tài)分析領(lǐng)域的常用技術(shù)。高效液相色譜是較為普及的分離技術(shù)，目前研究較多的有反相離子對色譜、離子交換色譜和分子排阻色譜。電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用儀是目前使用最多的檢測器，其具有檢出限低、靈敏度高和多元素同位素檢測等優(yōu)點，但運行成本較高。張穎等[15]利用HPLCICP-MS 聯(lián)用法有效分離出食品中5 種硒形態(tài)，定量分析硒（IV）和硒（VI）測得食品中無機硒的含量，對總硒進行測定，從而進一步計算出樣品中有機硒的含量。

3.4 毛細管電泳-電感耦合等離子體質(zhì)譜法

毛細管電泳-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，CE-ICP-MS）適用于分析檢測硒蛋白，其優(yōu)點為分辨率高、取樣量少、效率高以及不改變樣品形態(tài)等。毛細管電泳是以高壓直流電場為驅(qū)動力，加入緩沖溶液，在極微小內(nèi)徑的毛細管內(nèi)，根據(jù)各組分分配系數(shù)以及遷移速度的差異進行蛋白高效分離。ZHAO 等[16]使用CE-ICP-MS 聯(lián)用法檢測了富硒大米中的硒形態(tài)，得出硒主要以硒代蛋氨酸形式存在，該聯(lián)用法回收率較高。

4 結(jié)語

目前我國現(xiàn)行的茶葉中硒的檢測方法和國家標準為總硒含量的檢測標準，茶葉中有機硒、硒賦存形態(tài)等關(guān)鍵性指標的國家標準仍缺失。根據(jù)《中華人民共和國國民經(jīng)濟和社會發(fā)展第十四個五年規(guī)劃和2035 年遠景目標綱要》《“健康中國2030”規(guī)劃綱要》，預計到2030 年，全民健康素養(yǎng)水平大幅提升，健康生活方式基本普及，各地將有把富硒產(chǎn)業(yè)作為特色產(chǎn)業(yè)上升為國家戰(zhàn)略的趨勢。隨著我國市場對富硒茶葉的需求不斷增長，有機硒、硒不同賦存形態(tài)含量標準、生產(chǎn)技術(shù)和質(zhì)量安全成為關(guān)注重點。茶葉中硒賦存形態(tài)的研究是為了后期更好地研究硒在人體內(nèi)的營養(yǎng)價值和生理功能，所以將硒的賦存形態(tài)分析與生物功能學和營養(yǎng)學等相結(jié)合是未來研究的方向。