包裝飲用水中銅綠假單胞菌的控制措施及檢測(cè)方法

支曉紅

（咸陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西咸陽 712000）

水是人體的六大營(yíng)養(yǎng)元素之一，是所有生物（包括人類）賴以生存的重要條件。隨著高品質(zhì)飲用水的提出，越來越多的人選擇包裝飲用水，世界衛(wèi)生組織制定的飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)明確指出飲用水有關(guān)的安全問題大多來自微生物[1]。數(shù)據(jù)分析顯示我國(guó)的包裝飲用水中微生物主要集中在銅綠假單胞菌的超標(biāo)問題[2-3]。銅綠假單胞菌是包裝飲用水中污染風(fēng)險(xiǎn)較大的一種水源性條件致病菌，飲用被其污染的水表現(xiàn)為急性腹瀉，嚴(yán)重的發(fā)展為敗血癥、肺炎、腦膜炎等重癥。因此，研究和探討包裝飲用水中銅綠假單胞菌的控制措施及檢測(cè)方法，對(duì)于預(yù)防銅綠假單胞菌中毒和保障公共安全具有重要意義。

1 污染現(xiàn)狀及超標(biāo)原因

1.1 污染現(xiàn)狀

自2015 年《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》將銅綠假單胞菌作為質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)后，我國(guó)很多地方在包裝飲用水的抽樣檢測(cè)中檢出銅綠假單胞菌。福建省市場(chǎng)監(jiān)督管理局2019 年抽檢信息公告顯示共抽檢包裝飲用水787 批次，不合格產(chǎn)品共5 個(gè)批次，且5 個(gè)批次均檢出銅綠假單胞菌[4]。李杜娟[5]采集某市區(qū)居民飲用水180 份，其中純凈水103 份，礦物質(zhì)水46 份，天然礦物質(zhì)水31 份進(jìn)行抽樣檢測(cè)，檢出銅綠假單胞菌69 份，銅綠假單胞菌檢出率為38.3%，在天然礦泉水中檢出銅綠假單胞菌22 份，檢出率高達(dá)70.9%。因此，探討包裝飲用水中銅綠假單胞菌的超標(biāo)原因顯得尤為重要。

1.2 超標(biāo)原因

1.2.1 水源污染

銅綠假單胞菌超標(biāo)考慮的首要原因就是水源污染。包裝飲用水中的純凈水以自來水為水源，礦泉水以河流水、湖泊水或者泉水為水源，這些水源都易被銅綠假單胞菌污染。如果水源受到污染，且后續(xù)沒有采用清除設(shè)備和正確有效的清除方式，就很有可能導(dǎo)致最終的成品飲用水中出現(xiàn)銅綠假單胞菌。

1.2.2 生產(chǎn)過程衛(wèi)生控制不嚴(yán)格

銅綠假單胞菌分布于空氣、水、土壤中，甚至人的皮膚上，且常存在于潮濕的環(huán)境中[5]。而包裝飲用水的生產(chǎn)操作環(huán)境一般比較潮濕，這在無形之中就為銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)提供了良好環(huán)境。因此，生產(chǎn)過程中生產(chǎn)車間環(huán)境不達(dá)標(biāo)、儀器設(shè)備污染、殺菌工藝參數(shù)設(shè)置不合理都有可能導(dǎo)致包裝飲用水中銅綠假單胞菌超標(biāo)。

有的生產(chǎn)操作區(qū)缺乏合理規(guī)劃，回收區(qū)、灌裝區(qū)、檢驗(yàn)區(qū)都在一起就容易造成交叉污染；有的儀器設(shè)備和車間消毒不嚴(yán)格，甚至沒有消毒設(shè)備，就非常容易導(dǎo)致銅綠假單胞菌污染且蔓延到整個(gè)生產(chǎn)工序的管道和設(shè)備，導(dǎo)致成品水的污染。

1.2.3 包裝材料清洗消毒不標(biāo)準(zhǔn)

包裝飲用水受銅綠假單胞菌污染的最主要原因就是桶裝、瓶裝清潔和消毒不到位。目前包裝飲品水廠家都存在回收包裝材料的現(xiàn)象，水桶的特殊構(gòu)造會(huì)讓消毒效果大打折扣，而不合理的消毒方式和使用不當(dāng)?shù)南緞┒紩?huì)造成消毒不徹底，成品水中仍然存在銅綠假單胞菌。需要注意的是，紫外線對(duì)銅綠假單胞菌殺菌效果不佳[6]。

1.2.4 自檢及運(yùn)輸過程監(jiān)管不到位

目前很多包裝飲用水生產(chǎn)企業(yè)都因缺少專業(yè)檢測(cè)人員和檢測(cè)設(shè)備而未對(duì)成品水進(jìn)行微生物檢測(cè)，缺乏真實(shí)數(shù)據(jù)來有效應(yīng)對(duì)超標(biāo)情況，只能放之任之。同時(shí)，包裝飲用水中的桶裝水密封性相對(duì)差一些，在運(yùn)輸搬運(yùn)中多次提拉桶蓋會(huì)導(dǎo)致頂蓋松動(dòng)甚至漏水，無形之中就會(huì)造成細(xì)菌污染。

2 控制措施

2.1 包裝材料的質(zhì)量控制

試驗(yàn)研究和調(diào)查結(jié)果顯示包裝飲用水中檢出銅綠假單胞菌和產(chǎn)品包裝材料的處理有著顯著的關(guān)系。一次性包裝材料的污染程度要比反復(fù)使用的包裝材料小得多。針對(duì)企業(yè)大多采用回收桶的現(xiàn)象，回收桶及瓶蓋的存放、消毒、沖洗必須做到分類存放和有效清潔，回收桶的內(nèi)部清潔應(yīng)當(dāng)至少含有預(yù)清洗、洗滌劑清洗、消毒劑清洗、沖洗和成品水沖洗等環(huán)節(jié)，且回收桶的使用不超過5 年桶齡。

2.2 生產(chǎn)環(huán)境的質(zhì)量控制

銅綠假單胞菌不僅會(huì)通過飲用水感染人體，也會(huì)通過交叉感染的方式進(jìn)入飲用水，因此生產(chǎn)企業(yè)必須嚴(yán)格控制生產(chǎn)環(huán)境。在生產(chǎn)過程中要及時(shí)清除積水保持地面干燥，生產(chǎn)區(qū)域要?jiǎng)澐趾侠砬也扇∮行Ц綦x，操作車間和生產(chǎn)設(shè)備要進(jìn)行定期清潔和消毒，此外還要加強(qiáng)對(duì)操作人員的消毒管理，徹底阻斷銅綠假單胞菌繁殖蔓延。

2.3 生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制

包裝飲用水的生產(chǎn)一般包括原水、砂濾、碳濾、精濾、反滲透、殺菌、罐裝和包裝等環(huán)節(jié)。其中，原水和殺菌是關(guān)鍵控制點(diǎn)。原水井每隔15 d 必須進(jìn)行一次嚴(yán)格的消毒，原水箱每周都要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒，可以從源頭上杜絕被銅綠假單胞菌污染。貯水罐和管道應(yīng)配備沖洗消毒設(shè)施，每周進(jìn)行一次消毒，避免管道上附著有銅綠假單胞菌造成交叉污染。殺菌設(shè)備定期進(jìn)行維護(hù)和檢修，使用前必須檢查是否完好，使用后做好使用記錄。此外，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)找尋適合企業(yè)的消毒方式，減少因?yàn)橄静粡氐锥鴮?dǎo)致的交叉污染，使用消毒劑時(shí)要嚴(yán)格把控用量，避免產(chǎn)生消毒副產(chǎn)物，進(jìn)而帶來次生危害。

2.4 人員的質(zhì)量控制

生產(chǎn)人員的操作習(xí)慣和衛(wèi)生狀況也會(huì)直接影響包裝飲用水污染銅綠假單胞菌的概率，因此應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)人員的衛(wèi)生操作和消毒工作的監(jiān)督管理，進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)域后換衣帽，戴好符合要求且消過毒的防護(hù)用品，嚴(yán)格執(zhí)行消毒間的規(guī)定，做好消毒處理。同時(shí)生產(chǎn)人員要持健康證上崗，進(jìn)入車間后按照崗位要求操作，不隨意摸碰廢棄物，避免人體帶入銅綠假單胞菌。此外，人員的控制還應(yīng)當(dāng)包括檢測(cè)人員、運(yùn)輸人員和銷售人員的控制。檢測(cè)人員要熟悉標(biāo)準(zhǔn)和方法，定期開展考核，驗(yàn)證能力是否滿足崗位需求。運(yùn)輸人員在運(yùn)輸裝卸中禁止以桶蓋為抓手，防止蓋子受損產(chǎn)生污染。銷售人員要查驗(yàn)合格證和出廠報(bào)告，做到產(chǎn)品質(zhì)量安全心中有數(shù)。

2.5 出廠檢驗(yàn)的質(zhì)量控制

很多包裝飲用水生產(chǎn)企業(yè)對(duì)新標(biāo)準(zhǔn)《食品安全標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》（GB 19298—2014）既不熟悉也不重視，只看重經(jīng)濟(jì)效益忽視產(chǎn)品質(zhì)量。建議生產(chǎn)企業(yè)配備銅綠假單胞菌檢測(cè)的定性和定量設(shè)備儀器，提高檢測(cè)數(shù)據(jù)的真實(shí)性和有效性，同時(shí)加強(qiáng)對(duì)檢測(cè)人員的管理，使其熟悉標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法，提高檢測(cè)水平。每一批次成品水出庫前做好檢測(cè)，確保包裝飲用水的出廠有據(jù)可依、有據(jù)可循。此外，銷售商在售賣時(shí)應(yīng)仔細(xì)觀察包裝飲用水外包裝有無破損，是否完好，有破損時(shí)應(yīng)聯(lián)系廠家盡快返廠避免流入市場(chǎng)，同時(shí)做好銷售記錄登記。

3 檢測(cè)方法

3.1 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》（GB 8538—2022）中規(guī)定了銅綠假單胞菌的檢測(cè)方法。采用孔徑0.45 μm 親水性微孔濾膜將水中所含的細(xì)菌截留在濾膜上，再將濾膜移至CN瓊脂培養(yǎng)基上，（36±1） 培養(yǎng)20 ～48 h。菌落在CN 瓊脂上產(chǎn)綠膿菌素并呈藍(lán)色或綠色；菌落在CN瓊脂上呈非藍(lán)色且非綠色，但發(fā)熒光，并能夠利用乙酰胺產(chǎn)氨，42 生長(zhǎng)；菌落在CN 瓊脂上呈紅褐色不發(fā)熒光，但在金氏B 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)發(fā)熒光，氧化酶反應(yīng)陽性，能夠利用乙酰胺產(chǎn)氨。符合上述3 類現(xiàn)象之一均可確證為銅綠假單胞菌，報(bào)告每250 mL水樣中銅綠假單胞菌數(shù)。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法是在分析銅綠假單胞菌外毒素A 基因片段序列后，設(shè)計(jì)特異性引物和對(duì)應(yīng)的TaqMan 探針，在其進(jìn)行特異性擴(kuò)增時(shí)加入熒光集團(tuán)或染料，通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來反映擴(kuò)增過程中模板濃度變化。楊滴等[7]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)礦泉水中的銅綠假單胞菌，結(jié)果表明特異性較好，檢測(cè)靈敏度也很高。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是由NOTOMI 等[8]研發(fā)的一種新興快速測(cè)定方法，它主要是利用特異性引物和DNA 聚合酶在恒溫條件下擴(kuò)增，最終的檢驗(yàn)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法基本一致，但具有成本低、檢驗(yàn)時(shí)間短的特點(diǎn)，適合即時(shí)量大的初篩作業(yè)。

3.4 Pseudalert 酶底物法

Pseudalert 酶底物法是已通過ISO 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證的一種特異性底物檢測(cè)技術(shù)。它主要是利用目標(biāo)細(xì)菌分泌的特定酶來分解培養(yǎng)基中的相應(yīng)底物發(fā)出熒光的原理，24 h內(nèi)定量或定性檢測(cè)水中銅綠假單胞菌，且不需要確認(rèn)試驗(yàn)。王莉莉[9]比較了國(guó)標(biāo)法（濾膜法）和Pseudalert 酶底物法檢測(cè)飲用水中銅綠假單胞菌，結(jié)果表明兩種方法結(jié)果一致，數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

4 結(jié)語

生活質(zhì)量和生活方式的改變讓包裝飲用水進(jìn)入千家萬戶，銅綠假單胞菌作為包裝飲用水中的危險(xiǎn)因子和必檢項(xiàng)目，其檢驗(yàn)檢測(cè)的質(zhì)量需要嚴(yán)格管控和監(jiān)督監(jiān)管。本文通過分析包裝飲用水中銅綠假單胞菌的超標(biāo)原因，提出了質(zhì)控措施，對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行了研究，為從事包裝飲用水的生產(chǎn)和檢測(cè)人員提供了技術(shù)參考和理論支撐，從而更大力度地保障消費(fèi)者的飲水安全。此外，消費(fèi)者在選用包裝飲用水時(shí)要看清外包裝上的相關(guān)標(biāo)識(shí)同時(shí)檢查外包裝，盡量選擇生產(chǎn)規(guī)模大、社會(huì)口碑好、售后服務(wù)好的生產(chǎn)廠家。