基于Nrf2／HO-1 信號(hào)通路探討山楂葉總黃酮對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠卵巢氧化應(yīng)激的影響

劉桂宇，謝倩倩，陳希芬，元 麗，康雪敏

（1.河北師范大學(xué)職工醫(yī)院，河北 石家莊 050024；2.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS） 主要以多囊卵巢形態(tài)、卵巢功能障礙以及高雄激素血癥為主要特征，是導(dǎo)致育齡女性不孕不育的常見(jiàn)代謝紊亂與生殖內(nèi)分泌性疾?。?-3］。PCOS患者若未能得到及時(shí)合理的治療，會(huì)使子宮內(nèi)膜癌、代謝綜合征、心血管疾病及2 型糖尿病的發(fā)病幾率增加［4-5］。因此，尋找安全有效及更加完善的PCOS 治療方案，是當(dāng)前急需解決的難題。山楂具有抗氧化、抗炎、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、治療心肌缺血及調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂等作用［6］。山楂中黃酮類(lèi)化合物含量豐富，研究發(fā)現(xiàn)，山楂葉總黃酮可以使高脂血癥大鼠總膽固醇 （total cholesterol，TC）、甘油三酯 （triglyceride，TG） 及低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL） 水平降低，具有改善脂代謝紊亂作用［7］。山楂葉總黃酮也能夠使糖尿病大鼠血糖水平降低，改善脂代謝，同時(shí)可以降低血清丙二醛（malondialdehyde，MDA） 水平，升高超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）及過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT） 活性，表現(xiàn)出了明顯的抗氧化損傷作用［8］。糖脂代謝異常及氧化應(yīng)激是PCOS 發(fā)病的重要機(jī)制［9］，由此推測(cè)山楂葉總黃酮對(duì)于PCOS 的預(yù)防及治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究采用高脂飼料喂食聯(lián)合灌胃來(lái)曲唑法建立大鼠PCOS 模型，并給予不同劑量山楂葉總黃酮干預(yù)，探討山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠的保護(hù)作用及潛在機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雌性SD 大鼠70 只，SPF 級(jí)，6周齡，具有正常動(dòng)情周期，體質(zhì)量180～220 g，由斯貝福（北京） 生物技術(shù)有限公司提供［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京） 2019-0010］。大鼠飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （冀） 2022-010］，環(huán)境為相對(duì)濕度50%～60%，溫度22～23 ℃，12 h／12 h 晝夜循環(huán)交替，自由飲食及飲水。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)河北師范大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批 （倫理號(hào)2022LLSC023），符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R 原則。

1.2 藥物與試劑 山楂葉總黃酮為山楂葉黃酮提取物（黃酮含量90.0%，批號(hào)20220125，陜西瑞沃生物科技有限公司）；二甲雙胍 （規(guī)格0.5 g／片，國(guó)藥準(zhǔn)字H20023370，中美上海施貴寶制藥有限公司）。來(lái)曲唑（規(guī)格2.5 mg／片，國(guó)藥準(zhǔn)字H20133109，浙江海正藥業(yè)股份有限公司）；蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE） 染色試劑盒（貨號(hào)WH2144，上海威奧生物科技有限公司）；卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、睪酮（testosterone，T）、抗繆勒管激素 （anti-mullerian hormone，AMH）、雌二醇（estradiol，E2） 檢測(cè)試劑盒 （貨號(hào)JEB-13680、JEB-13774、JEB-13693、JEB-13167、JEB-13691，南京金益柏生物科技有限公司）；空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS） 檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)H203-1-2，南京建成生物工程研究所）；SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 （glutathione peroxidase，GSH-Px）、MDA 檢測(cè)試劑盒 （貨號(hào)ml095208、ml095263、ml094963，上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；核因子紅細(xì)胞系2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor，Nrf2）、血紅素氧合酶1 （heme oxygenase 1，HO-1） 多克隆抗體 （貨號(hào)ab137550、ab13243，英國(guó)Abcam 公司）；磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH） 多克隆抗體、IgG 二抗（貨號(hào)R1210-1、HA1001，杭州華安生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器 UXF40086 型超低溫冰箱 （美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；BSA2202S 型電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；KC-100 型酶標(biāo)儀（安徽鴻眾醫(yī)療器械有限公司）；RM2135 型病理組織切片機(jī) （德國(guó)Leica 公司）；NE930 型光學(xué)顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司）；血糖試紙條、ACCU-CHEK 型血糖儀（瑞士Roche 公司）；BK-200VET 型全自動(dòng)生化分析儀（濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司）；UV9000 型紫外可見(jiàn)分光光度儀（上海元析儀器有限公司）；Mini-PROTEAN Tetra型蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng) （美國(guó)Bio-Rad 公司）；3200-97001 型凝膠成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 大鼠分為空白組（10只） 及造模組（60 只），空白組大鼠飼喂普通飼料，并灌胃 1% 羧甲基纖維素鈉 （sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）；造模組大鼠飼喂高脂飼料，并用灌胃1 mg／kg 來(lái)曲唑混懸液（1%CMC-Na 配制），共21 d［10］。從第10 天開(kāi)始行陰道涂片觀察，連續(xù)10 d，當(dāng)出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂、陰道上皮白細(xì)胞持續(xù)增多時(shí)，隨機(jī)選取5 只大鼠處死后取材，并通過(guò)HE 染色檢測(cè)卵巢組織病理變化以進(jìn)一步判斷PCOS 模型是否成功建立。建模成功的大鼠分為模型組、二甲雙胍組（100 mg／kg） 及山楂葉總黃酮低、中、高劑量組（100、200、400 mg／kg），每組10 只。各給藥組按上述劑量灌胃，其中山楂葉總黃酮的灌胃劑量參考文獻(xiàn)［11］ 報(bào)道，灌胃體積均為10 mL／kg，每天1 次，持續(xù)21 d。給藥期間，大鼠動(dòng)情周期的觀察繼續(xù)以陰道涂片法進(jìn)行，連續(xù)14 d，以評(píng)價(jià)山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠動(dòng)情周期的影響。

2.2 取材及體質(zhì)量、子宮質(zhì)量、卵巢質(zhì)量測(cè)定 末次給藥結(jié)束后，禁食不禁水12 h，稱(chēng)定體質(zhì)量。使用10%水合氯醛（300 mg／kg） 麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分離血清。摘取雙角子宮和雙側(cè)卵巢，沖洗殘留血跡并拭干，稱(chēng)定子宮及卵巢質(zhì)量，將一側(cè)卵巢固定于多聚甲醛，另一側(cè)保存于-80 ℃冰箱。

2.3 卵巢組織病理變化檢測(cè) 取固定24 h 的卵巢組織，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，切片（4 μm），行常規(guī)HE 染色，觀察卵巢病理變化。

2.4 激素水平、糖代謝及脂代謝指標(biāo)檢測(cè) 通過(guò)血糖儀檢測(cè)大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)FINS 水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR），公式為HOMA-IR＝FBG × FINS／22.5。取凍存于-80 ℃冰箱中的血清，解凍后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清FSH、LH 活性及T、AMH、E2水平；通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清脂代謝指標(biāo)LDL、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、TC及TG 水平。

2.5 卵巢組織氧化應(yīng)激水平檢測(cè) 取100 mg 卵巢組織，加入1 mL 預(yù)冷的生理鹽水，在冰水浴上用組織研磨器充分研磨，3 000 r／min 離心10 min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，通過(guò)比色法檢測(cè)卵巢組織SOD、GSH-Px 活性及MDA 水平。

2.6 卵巢組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)檢測(cè) 取100 mg 卵巢組織，加入1 mL 預(yù)冷的裂解液，在冰水浴上用組織研磨器充分研磨。離心后取上清液，蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量分析。蛋白樣本經(jīng)SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，TBST 洗膜3 次，分別加入Nrf2、HO-1 （1 ∶1 000）、GAPDH （1 ∶2 500） 一抗，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3 次，加入二抗（1 ∶5 000） 室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次，ECL顯色，曝光，通過(guò)Image J 1.8.0 軟件分析各條帶灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠動(dòng)情周期的影響 SD大鼠一般以4～5 d 為一個(gè)動(dòng)情周期，其中動(dòng)情前期（proestrus，P） 以有核上皮細(xì)胞為主，呈膨大、橢圓形；動(dòng)情期（estrus，E） 主要為無(wú)核角化細(xì)胞，且形態(tài)不規(guī)則；動(dòng)情后期（metestrus，M） 可見(jiàn)白細(xì)胞和有核上皮、角化細(xì)胞，且數(shù)量相當(dāng)；間期（diestrus，D） 主要的細(xì)胞類(lèi)型為白細(xì)胞，見(jiàn)圖1A。經(jīng)過(guò)連續(xù)14 d 對(duì)動(dòng)情周期變化的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)繪制動(dòng)情周期折線圖，見(jiàn)圖1B，發(fā)現(xiàn)空白組大鼠有規(guī)律的動(dòng)情周期；模型組大鼠動(dòng)情周期完全紊亂；二甲雙胍組及山楂葉總黃酮各劑量組大鼠動(dòng)情周期均有逐漸恢復(fù)的趨勢(shì)，表明山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠動(dòng)情周期的紊亂具有改善作用。

圖1 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠動(dòng)情周期的影響Fig．1 Effects of hawthorn leaves flavonoids on estrous cycle in PCOS rats

3.2 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠體質(zhì)量、子宮及卵巢質(zhì)量的影響 如表1 所示，干預(yù)前與干預(yù)后，模型組大鼠體質(zhì)量均高于空白組（P＜0.01）；干預(yù)前，與模型組比較，二甲雙胍組及山楂葉總黃酮各劑量組大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化（P＞0.05）；干預(yù)后，與模型組比較，二甲雙胍組及山楂葉總黃酮中、高劑量組大鼠體質(zhì)量降低 （P＜0.05，P＜0.01），山楂葉總黃酮低劑量組大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化（P＞0.05）。與空白組比較，模型組大鼠子宮質(zhì)量降低 （P＜0.01），卵巢質(zhì)量升高 （P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組及山楂葉總黃酮各劑量組大鼠子宮質(zhì)量升高 （P＜0.05，P＜0.01），卵巢質(zhì)量降低（P＜0.01）。

表1 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠體質(zhì)量、子宮及卵巢質(zhì)量的影響（±s，n＝10）Tab．1 Effects of hawthorn leaves flavonoids on body weight，uterus and ovary weight in PCOS rats （±s，n＝10）

表1 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠體質(zhì)量、子宮及卵巢質(zhì)量的影響（±s，n＝10）Tab．1 Effects of hawthorn leaves flavonoids on body weight，uterus and ovary weight in PCOS rats （±s，n＝10）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別體質(zhì)量／g干預(yù)前干預(yù)后子宮質(zhì)量／mg卵巢質(zhì)量／mg空白組251.39±30.48306.19±36.30529.62±69.4864.13±7.45模型組297.04±28.91**415.22±55.74**363.10±31.29**117.54±13.01**二甲雙胍組306.48±35.44352.58±42.51＃＃446.15±45.42＃＃78.09±8.56＃＃山楂葉總黃酮低劑量組312.13±27.05389.37±40.17398.41±40.21＃92.30±11.73＃＃山楂葉總黃酮中劑量組314.26±34.17371.33±36.24＃420.83±42.18＃＃85.46±8.31＃＃山楂葉總黃酮高劑量組298.62±31.29334.27±34.52＃＃455.96±53.61＃＃73.38±9.95＃＃

3.3 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠卵巢組織病理變化的影響 空白組大鼠卵巢組織未發(fā)生病理?yè)p傷變化，卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，顆粒細(xì)胞排列整齊、緊密；模型組大鼠卵巢組織內(nèi)可見(jiàn)囊性擴(kuò)張卵泡及閉鎖卵泡，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少且排列疏松；二甲雙胍組及山楂葉總黃酮各劑量組大鼠囊性擴(kuò)張卵泡及閉鎖卵泡減少，顆粒細(xì)胞層數(shù)增加且排列較為緊密，其中二甲雙胍組及山楂葉總黃酮高劑量組對(duì)卵巢病理?yè)p傷變化的改善最為明顯，見(jiàn)圖2。

圖2 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠卵巢組織病理變化的影響（HE，×200）Fig．2 Effects of hawthorn leaves flavonoids on ovarian pathological changes in PCOS rats （HE，×200）

3.4 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠血清激素水平的影響 如表2 所示，與空白組比較，模型組大鼠血清FSH 活性及E2水平降低（P＜0.01），LH 活性及T、AMH 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組及山楂葉總黃酮各劑量組大鼠血清FSH活性及E2水平升高（P＜0.01），LH 活性及T、AMH 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠血清激素水平的影響（±s，n＝10）Tab．2 Effects of hawthorn leaves flavonoids on serum hormone levels in PCOS rats （±s，n＝10）

表2 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠血清激素水平的影響（±s，n＝10）Tab．2 Effects of hawthorn leaves flavonoids on serum hormone levels in PCOS rats （±s，n＝10）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別FSH／（U·L-1）LH／（U·L-1）T／（ng·L-1）AMH／（ng·L-1）E2／（pmol·L-1）空白組10.87±1.2325.14±3.31152.73±18.642 084.32±198.3549.32±5.60模型組5.42±0.48**46.22±5.20**281.92±30.36**3 675.24±415.49**23.66±2.78**二甲雙胍組9.68±1.02＃＃31.83±3.25＃＃175.68±19.81＃＃2 426.08±261.53＃＃46.31±5.12＃＃山楂葉總黃酮低劑量組7.59±0.87＃＃37.31±4.66＃＃254.01±25.38＃3 157.12±402.11＃40.75±3.36＃＃山楂葉總黃酮中劑量組9.30±1.16＃＃34.18±4.15＃＃206.89±17.10＃＃2 961.94±327.60＃＃42.34±4.65＃＃山楂葉總黃酮高劑量組10.25±1.41＃＃28.39±3.86＃＃193.17±21.84＃＃2 542.69±284.57＃＃45.40±4.18＃＃

3.5 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠糖代謝的影響 如表3 所示，與空白組比較，模型組大鼠FBG、FINS 水平及HOMA-IR 值均升高（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組及山楂葉總黃酮各劑量組大鼠FBG、FINS 水平及HOMA-IR 值均降低 （P＜0.05，P＜0.01）。

表3 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠糖代謝的影響（±s，n＝10）Tab．3 Effects of hawthorn leaves flavonoids on glucose metabolism in PCOS rats （±s，n＝10）

表3 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠糖代謝的影響（±s，n＝10）Tab．3 Effects of hawthorn leaves flavonoids on glucose metabolism in PCOS rats （±s，n＝10）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別FBG／（mmol·L-1）FINS／（mIU·L-1）HOMA-IR空白組5.09±0.5215.46±1.403.49±0.41模型組7.64±0.67**20.90±2.52**7.09±0.87**二甲雙胍組5.27±0.41＃＃17.82±2.05＃＃4.17±0.42＃＃山楂葉總黃酮低劑量組6.74±0.89＃18.57±1.83＃5.56±0.61＃＃山楂葉總黃酮中劑量組6.58±0.57＃＃18.16±2.19＃5.31±0.58＃＃山楂葉總黃酮高劑量組5.39±0.71＃＃16.65±1.94＃＃3.98±0.42＃＃

3.6 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠脂代謝的影響如表4 所示，與空白組比較，模型組大鼠血清LDL、TC 及TG 水平升高（P＜0.01），HDL 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組及山楂葉總黃酮各劑量組大鼠血清LDL、TG 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），HDL 水平均無(wú)明顯變化（P＞0.05），山楂葉總黃酮中、高劑量組大鼠血清TC 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠脂代謝的影響（mmol／L，±s，n＝10）Tab．4 Effects of hawthorn leaves flavonoids on lipid metabolism in PCOS rats （mmol／L，±s，n＝10）

表4 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠脂代謝的影響（mmol／L，±s，n＝10）Tab．4 Effects of hawthorn leaves flavonoids on lipid metabolism in PCOS rats （mmol／L，±s，n＝10）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別LDLHDLTCTG空白組0.21±0.031.02±0.081.78±0.210.87±0.09模型組0.39±0.04**0.90±0.11*2.27±0.24**2.14±0.22**二甲雙胍組0.26±0.02＃＃0.95±0.132.05±0.331.52±0.18＃＃山楂葉總黃酮低劑量組0.34±0.05＃0.92±0.102.19±0.301.89±0.21＃山楂葉總黃酮中劑量組0.33±0.04＃＃0.96±0.121.96±0.25＃1.73±0.26＃＃山楂葉總黃酮高劑量組0.28±0.04＃＃0.94±0.151.91±0.12＃＃1.54±0.17＃＃

3.7 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠卵巢組織氧化應(yīng)激水平的影響 如表5 所示，與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織SOD、GSH-Px 活性降低 （P＜0.01），而MDA 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組及山楂葉總黃酮各劑量組大鼠卵巢組織SOD、GSH-Px 活性升高 （P＜0.01），而MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表5 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠卵巢組織氧化應(yīng)激的影響（±s，n＝10）Tab．5 Effects of hawthorn leaves flavonoids on oxidative stress in ovarian tissue of PCOS rats （±s，n＝10）

表5 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠卵巢組織氧化應(yīng)激的影響（±s，n＝10）Tab．5 Effects of hawthorn leaves flavonoids on oxidative stress in ovarian tissue of PCOS rats （±s，n＝10）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

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3.8 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠卵巢組織Nrf2／HO-1 信號(hào)通路的影響 如圖3、表6 所示，與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組及山楂葉總黃酮各劑量組大鼠卵巢組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表6 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠卵巢組織Nrf2／HO-1 信號(hào)通路的影響（±s，n＝3）Tab．6 Effects of hawthorn leaves flavonoids on Nrf2／HO-1 signaling pathway in ovarian tissue of PCOS rats（±s，n＝3）

表6 山楂葉總黃酮對(duì)PCOS 大鼠卵巢組織Nrf2／HO-1 信號(hào)通路的影響（±s，n＝3）Tab．6 Effects of hawthorn leaves flavonoids on Nrf2／HO-1 signaling pathway in ovarian tissue of PCOS rats（±s，n＝3）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別Nrf2／GAPDHHO-1／GAPDH空白組0.93±0.101.07±0.12模型組0.18±0.02**0.15±0.02**二甲雙胍組0.71±0.06＃＃0.56±0.05＃＃山楂葉總黃酮低劑量組0.38±0.04＃＃0.25±0.03＃山楂葉總黃酮中劑量組0.66±0.08＃＃0.44±0.05＃＃山楂葉總黃酮高劑量組0.75±0.07＃＃0.52±0.06＃＃

圖3 各組大鼠卵巢組織Nrf2 及HO-1 蛋白表達(dá)Fig．3 Nrf2 and HO-1 protein expressions in rat ovarian tissue of each group

4 討論

本研究通過(guò)高脂飼料喂食及灌胃來(lái)曲唑法成功復(fù)制了大鼠PCOS 模型，并證實(shí)山楂葉總黃酮能夠使PCOS 大鼠紊亂的動(dòng)情周期恢復(fù)，減輕卵巢組織病理?yè)p傷變化。激素水平失衡是引起代謝紊亂和生殖功能障礙的重要原因，其中FSH、LH、T、AMH及E2等激素對(duì)卵巢正常功能的發(fā)揮具有關(guān)鍵性的影響［12］。FSH 的主要作用為促進(jìn)卵泡成熟，LH 可以調(diào)節(jié)月經(jīng)周期及促進(jìn)合成雌激素、雄激素；T 能夠影響卵泡成熟的生理過(guò)程，其水平增加會(huì)使卵泡的發(fā)育成熟過(guò)程被抑制，并能降低卵母細(xì)胞數(shù)量；AMH 的水平與竇狀卵泡數(shù)呈正比，E2具有較強(qiáng)的抗雄激素作用［13］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山楂葉總黃酮能夠增加血清FSH 活性及E2水平，降低LH 活性及T、AMH 水平，可以通過(guò)影響體內(nèi)激素水平改善PCOS 大鼠卵巢內(nèi)環(huán)境。

糖代謝紊亂是PCOS 病因研究中公認(rèn)的重要發(fā)病機(jī)制之一，F(xiàn)BG、FINS 及HOMA-IR 是反映糖代謝紊亂的常用指標(biāo)，具體表現(xiàn)為FBG、FINS 水平及HOMA-IR 值升高［14］。糖代謝紊亂可以對(duì)下丘腦-垂體-卵巢軸造成影響，干擾卵子的生成及排出過(guò)程，進(jìn)而引起女性內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖功能的持久性損傷；糖代謝紊亂也可以通過(guò)抑制性激素結(jié)合球蛋白的合成，升高游離T 水平，使卵巢合成雄激素增加并促進(jìn)釋放，導(dǎo)致PCOS 發(fā)生［15］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山楂葉總黃酮組大鼠FBG、FINS、LDL、TG、TC 水平及HOMA-IR 值均有不同程度的降低，表明山楂葉總黃酮具有改善PCOS 大鼠糖脂代謝紊亂作用，進(jìn)而緩解PCOS 癥狀。

氧化應(yīng)激不僅在各種代謝性疾病、衰老、腫瘤及慢性炎癥中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也參與了PCOS 的發(fā)生及發(fā)展［16］。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢的內(nèi)分泌功能可以受到氧化應(yīng)激的影響，導(dǎo)致卵泡發(fā)育受損、卵泡閉鎖及成熟障礙；氧化應(yīng)激也可使卵巢雄激素相關(guān)合成酶的表達(dá)增加，促進(jìn)雄性激素的生成和分泌，從而加速PCOS 的發(fā)生及進(jìn)展［17］。因此，抑制氧化應(yīng)激是預(yù)防和治療PCOS 的潛在手段。周少英等［18］研究發(fā)現(xiàn)，山楂葉總黃酮可以減輕糖尿病大鼠肝組織損傷，該作用與提高機(jī)體抗氧化酶活性，進(jìn)而使氧化應(yīng)激損傷降低有關(guān)。在大鼠肺缺血再灌注損傷模型中，山楂葉總黃酮可以升高SOD、CAT 活性和降低MDA 水平，通過(guò)增加自由基清除能力及減輕氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮保護(hù)肺組織損傷作用［19］。Nrf2／HO-1 信號(hào)通路是機(jī)體抗氧化反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)通路，Nrf2 具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)作用，而HO-1 是Nrf2 發(fā)揮抗氧化活性的重要媒介［20］。研究證實(shí)，HO-1 的高表達(dá)與PCOS 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的增加密切相關(guān)［21］。Li 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，NADPH 氧化酶4 缺失可能通過(guò)激活Nrf-2／HO-1 信號(hào)通路，減輕氧化應(yīng)激，從而改善PCOS。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山楂葉總黃酮組大鼠卵巢組織SOD、GSH-Px 活性及Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)升高，MDA 水平降低，表明山楂葉總黃酮能夠活化PCOS 大鼠Nrf2／HO-1 信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。

綜上所述，山楂葉總黃酮能夠活化PCOS 大鼠卵巢組織Nrf2／HO-1 信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，改善糖脂代謝異常及胰島素敏感性，調(diào)節(jié)激素水平，減輕卵巢病理變化，恢復(fù)紊亂的動(dòng)情周期。本研究結(jié)果可為山楂葉總黃酮預(yù)防和治療PCOS 提供科學(xué)依據(jù)，也有助于擴(kuò)展山楂葉總黃酮的應(yīng)用范圍，但對(duì)于作用機(jī)制及靶點(diǎn)的研究還有待深入。