槐杞黃顆粒干預(yù)狼瘡性腎炎的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)*

劉洋，郭璐萱，郝娜

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，天津 300381；2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300381；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種典型的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，主要特征表現(xiàn)為自身免疫耐受的喪失以及針對(duì)自身抗原產(chǎn)生高水平的自身反應(yīng)性抗體，從而累及全身系統(tǒng)，導(dǎo)致多器官損傷[1]。狼瘡性腎炎（LN）是SLE 最常見的嚴(yán)重表現(xiàn)之一，約50%～70%的SLE 患者可發(fā)展為LN[2]，其中大約22%的LN患者在15 年內(nèi)可進(jìn)展至終末期腎病[3]。目前LN 仍然是SLE 患者發(fā)病和死亡的重要原因[4]，積極地改善治療LN，對(duì)于延緩腎臟病的進(jìn)展，降低病死率，提升生活質(zhì)量具有積極的意義。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于LN 的治療仍以激素類藥物和免疫抑制劑治療為主，雖然具有一定的療效，但仍然不可避免地出現(xiàn)藥物毒性以及可能引發(fā)的繼發(fā)性感染，且治療過程中易出現(xiàn)疾病的反復(fù)發(fā)作，治療不徹底。雖然目前出現(xiàn)了一些新型藥物用于LN 的治療，比如B 細(xì)胞靶向治療、利妥昔單抗、奧瑞珠單抗等藥物，但是其具體的療效仍然需要大規(guī)模臨床試驗(yàn)進(jìn)一步去證實(shí)[5]。迫切地去尋找一種副作用更小，療效更佳的藥物成為臨床治療LN 的熱點(diǎn)所在。槐杞黃顆粒（HQH）是一種以真菌為主要組成的中成藥，近年來，HQH 在慢性腎臟?。–KD），如兒童腎病綜合征、糖尿病腎病、過敏性紫癜性腎炎、慢性腎衰竭等的治療中療效突出，可通過保護(hù)腎小球足細(xì)胞、抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖、抗腎間質(zhì)纖維化等多方面來實(shí)現(xiàn)干預(yù)CKD 的進(jìn)展[6]。根據(jù)中國最新的1 項(xiàng)臨床隨機(jī)對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)[7]，相比于單純應(yīng)用常規(guī)藥物（潑尼松聯(lián)合環(huán)磷酰胺）治療，聯(lián)合HQH 治療后可顯著地降低LN 患者的24 h 尿蛋白定量，降低白細(xì)胞介素（IL）-4 和IL-10 等炎癥因子，還可降低血清鐵蛋白水平，具有突出的療效且安全性良好。雖然目前臨床證實(shí)HQH 可明顯改善LN，改善相關(guān)癥狀，但是其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步明確，且中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同治療的效果，為了明確HQH 干預(yù)LN 的具體物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，因此文章借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法去探究HQH 的核心成分、靶點(diǎn)以及關(guān)鍵通路，以期為今后臨床中HQH 在治療LN 的深入研究與應(yīng)用方面提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 HQH 的有效成分及作用靶點(diǎn)的整理 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php/）并根據(jù)生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18 相關(guān)條件篩選HQH 的有效成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，對(duì)于TCMSP 未收錄的藥物槐耳，在中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具平臺(tái)（BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）獲取其活性成分，同樣在TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選符合條件的有效成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。最后通過UniProt 平臺(tái)（https：//www.uniprot.org/）規(guī)范靶點(diǎn)名稱。

1.2 狼瘡性腎炎的疾病靶點(diǎn)整理 以“Lupus Nephritis”“Lupus Glomerulonephritis”“Lupus Nephritides”“Lupus Glomerulonephritides”為檢索詞在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、Therapeutic Target Database（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫獲取LN 的疾病靶點(diǎn)并整理匯總。

1.3 中藥與疾病共同靶點(diǎn)的整理 借助Venny 2.1.0 平臺(tái)（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對(duì)HQH 的作用靶點(diǎn)與LN 的靶點(diǎn)取交集，獲取兩者的共同靶點(diǎn)。

1.4 中藥-有效成分-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 借助Cytoscape 3.9.1 軟件導(dǎo)入中藥、有效成分、共同靶點(diǎn)及疾病等信息，構(gòu)建中藥-有效成分-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)用軟件中“CytoNCA”插件計(jì)算節(jié)點(diǎn)度值（DC），獲取HQH 干預(yù)LN 的核心關(guān)鍵成分。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將成分與疾病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.stringdb.org/），物種設(shè)置為“Homo sapiens”，最低要求交互得分設(shè)置為0.4，獲得蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，將數(shù)據(jù)輸出為tsv 格式并導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件中建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析 借助Metascape 平臺(tái)（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）對(duì)中藥與疾病的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析，運(yùn)用微生信平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果可視化分析。

1.7 分子對(duì)接 為進(jìn)一步探究HQH 的核心關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的穩(wěn)定性作用關(guān)系。選擇1.4 中中藥-有效成分-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖中DC 值排名前5的核心成分與1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中DC 值排名前3 的核心蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接操作。方法如下：首先，在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索并下載核心關(guān)鍵成分的SDF 結(jié)構(gòu)文件，同時(shí)借助Open Babel 2.3.1 軟件將SDF 結(jié)構(gòu)文件轉(zhuǎn)化為PDB 格式文件；通過Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org//）下載關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)的PDB 格式文件。其次，將關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入至AutoDock Tools 軟件中進(jìn)行去水、加全氫、設(shè)置為受體等操作，以pdbqt 文件格式導(dǎo)出；對(duì)小分子進(jìn)行加全氫、設(shè)置為配體、檢測(cè)扭轉(zhuǎn)鍵等操作，同樣以pdbqt 文件格式導(dǎo)出。再次，將輸出的配體和受體的pdbqt 文件依次進(jìn)行分子對(duì)接的操作，若結(jié)合能<0 kcal/mol，說明配體與受體可自發(fā)結(jié)合，若結(jié)合能<-5 kcal/mol 表示具有較好的結(jié)合活性，若結(jié)合能<-7 kcal/mol 表示具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性；結(jié)合能的絕對(duì)值越大，表示結(jié)合活性越強(qiáng)，分子構(gòu)象越穩(wěn)定。最后，利用Pymol 軟件對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 HQH 的有效成分及作用靶點(diǎn)的整理結(jié)果 通過相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫共計(jì)檢索到56 個(gè)HQH 的有效成分和211 個(gè)活性成分所對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，根據(jù)活性成分所對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)的數(shù)量進(jìn)行排序，對(duì)靶點(diǎn)數(shù)量≥10 的活性成分具體信息進(jìn)行展示，見表1。

表1 HQH 的主要有效成分和作用靶點(diǎn)Tab.1 Main active components and action targets of HQH

2.2 疾病靶點(diǎn)的整理結(jié)果 通過GeneCard、OMIM、TTD 疾病數(shù)據(jù)庫共計(jì)獲取到1 822 個(gè)LN 疾病靶點(diǎn)。

2.3 交集靶點(diǎn)的篩選結(jié)果 借助Venny 2.1.0 平臺(tái)對(duì)HQH 的作用靶點(diǎn)與LN 的疾病靶點(diǎn)取交集，得到117 個(gè)交集靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 HQH 與LN 的交集靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Wayne diagram of the intersection target of HQH and LN

2.4 中藥-有效成分-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建結(jié)果 借助Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建HQH 干預(yù)LN的中藥-有效成分-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖見OSID標(biāo)識(shí)碼。網(wǎng)絡(luò)圖共計(jì)節(jié)點(diǎn)166 個(gè)（3 個(gè)中藥節(jié)點(diǎn)，45 個(gè)有效成分節(jié)點(diǎn)，117 個(gè)共同靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)和1 個(gè)疾病節(jié)點(diǎn)），436 條邊。利用“CytoNCA”插件計(jì)算節(jié)點(diǎn)DC 值，DC 值越大節(jié)點(diǎn)面積越大，取DC 值排名前5的成分作為核心關(guān)鍵成分，見表2。

表2 DC 值排名前5 的活性成分Tab.2 Top five active ingredients by DC value

2.5 HQH 干預(yù)狼瘡性腎炎的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建的結(jié)果 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖共包含116 個(gè)節(jié)點(diǎn)，2359 條邊，見OSID 標(biāo)識(shí)碼。借助插件“CytoNCA”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，首先?jì)算各節(jié)點(diǎn)DC 值，篩選出DC 值大于中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)。其次，分別計(jì)算各節(jié)點(diǎn)介度（BC）和緊密度（CC）值，分別篩選出BC 和CC 值均大于中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)。其中，各節(jié)點(diǎn)中位數(shù)的DC、BC、CC值分別為39、10.52、0.83，最終獲取到27 個(gè)核心靶點(diǎn)，按照DC 值對(duì)核心靶點(diǎn)排序，排名前5 的核心靶點(diǎn)見表3。

表3 HQH 干預(yù)LN 的核心作用靶點(diǎn)Tab.3 Core action target of HQH intervention in LN

2.6 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析的結(jié)果 GO 功能富集分析共得到1 926 條結(jié)果，包括1 702 條BP 信息，80 條CC 信息，144 條MF 信息。按照P 值由小到大的順序排列，BP、CC 和MF 的前10 條富集分析結(jié)果見圖2。

KEGG 通路富集分析得到195 條結(jié)果，主要包括糖尿病并發(fā)癥中的糖基化終末產(chǎn)物（AGE）-糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素（IL）-17 信號(hào)通路、輔助性T 細(xì)胞17（Th17）細(xì)胞分化信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路等。同樣按照P 值由小到大排序，前20 條富集通路信息見圖3。

圖3 KEGG 通路富集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis

2.7 分子對(duì)接的結(jié)果 將HQH 中槲皮素、山柰酚、黃芩素、β-谷甾醇、黃豆黃素等核心成分分別與VEGFA（PDB ID：1MKK）、c-fos 原癌基因蛋白（FOS，PDB ID：1A02）、MMP-9（PDB ID：6ESM）等核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，計(jì)算核心成分和核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合能以便預(yù)測(cè)成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性。結(jié)合能低于0 表明成分與靶點(diǎn)能夠自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能負(fù)值越高提示構(gòu)象越穩(wěn)定。結(jié)合能的具體數(shù)值見表4。結(jié)果顯示15 次對(duì)接結(jié)果均小于0，結(jié)合能的范圍在-5.49～8.46 kJ/mol 之間，提示核心成分與核心靶點(diǎn)對(duì)接良好。其中β-谷甾醇與MMP-9、VEGFA、FOS，槲皮素與VEGFA、FOS，黃豆黃素與FOS，山奈酚與MMP-9 等對(duì)接后結(jié)合能相對(duì)較小，提示HQH 干預(yù)LN 的科學(xué)性及有效性，利用Pymol 軟件對(duì)上述結(jié)合能較高的分子對(duì)接的結(jié)果進(jìn)行可視化分析，見圖4。

圖4 分子對(duì)接結(jié)果Fig.4 Macromolecular docking results

表4 配體-受體的結(jié)合能Tab.4 Binding energy of ligand and receptor

3 討論

文章借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探究了HQH 干預(yù)LN 的物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，HQH 干預(yù)LN 的核心成分以槲皮素、山柰酚、黃芩素、β-谷甾醇、黃豆黃素等為主。槲皮素具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗病毒、抗癌以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[8]。MRL/lpr 小鼠作為研究LN 的常用動(dòng)物模型之一[9]，研究發(fā)現(xiàn)[10]，槲皮素能夠明顯減少M(fèi)RL/lpr 模型小鼠腫大的脾臟，降低異常的免疫功能和炎癥反應(yīng)。系膜細(xì)胞的過度增殖是LN 最嚴(yán)重的病理表現(xiàn)之一，研究證實(shí)，槲皮素通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）信號(hào)通路的活化，降低長正五聚蛋白3 的表達(dá)來抑制系膜細(xì)胞的過度增殖，改善LN[11]。山柰酚則能通過降低高遷移率蛋白1、Toll 樣受體4 和ATP 門控離子通道嘌呤7 等炎性蛋白的表達(dá)從而有效改善脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷和炎癥反應(yīng)[12]。黃芩素具有抗炎和抗氧化的作用，而炎癥、氧化應(yīng)激和腎臟中的髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）的浸潤是加速LN 進(jìn)展的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)[13]，黃芩素能明顯下調(diào)LN 模型小鼠的Nod 樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體的活化和活性氧（ROS）及NF-κB磷酸化水平，抑制MDSC 的擴(kuò)增等，進(jìn)而保護(hù)腎臟。β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、抑菌和類激素功能等多種生物活性[14]。Koc 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)腎缺血/再灌注損傷的模型大鼠，應(yīng)用β-谷甾醇干預(yù)后能夠有效降低其機(jī)體丙二醛水平，升高SOD 和谷胱甘肽的活性，改善氧化應(yīng)激，此外β-谷甾醇還能夠降低大鼠機(jī)體TNF-α 和IL-6 水平，降低炎癥反應(yīng)。然而目前，在β-谷甾醇干預(yù)LN 的應(yīng)用中，仍缺少相關(guān)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其潛在機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，VEGFA、FOS、MMP-9、PTGS2、NFKBIA 為HQH 干預(yù)LN 的核心靶點(diǎn)。VEGFA 屬于血小板源性生長因子超家族的一種分泌型糖蛋白，對(duì)于維持腎小球?yàn)V過屏障至關(guān)重要[16]。在腎組織中，VEGFA 主要由足細(xì)胞產(chǎn)生并穿過腎小球基底膜，到達(dá)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而對(duì)于腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化發(fā)揮重要作用[17]，足細(xì)胞中VEGFA的表達(dá)增多或減少均可導(dǎo)致腎小球結(jié)構(gòu)和功能的異常[18]。FOS 家族由FOS，F(xiàn)OSB，F(xiàn)OSL1 和FOSL2 等成員組成，其中FOSL1 和FOSL2 在IgAN、LN 和局灶性腎小球硬化癥等各種腎臟疾病中均呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)[19]。IgA 腎病的診斷目前僅局限于腎活檢，缺乏有效的血清和尿液相關(guān)的生物標(biāo)志物[20]。但是最新的1 項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[21]，F(xiàn)OS 在健康人群和IgA 腎病人群中具有較高的特異性和敏感性，這提示FOS 有望成為診斷IgA 腎病的生物標(biāo)志物之一。MMP 屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族[22]，包括間質(zhì)膠原酶（MMP-1、MMP-8、MMP-13）、明膠酶（MMP-9、MMP-2）、基質(zhì)溶素（MMP-3、MMP-7、MMP-10）等[23]。相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)[22]，MMP 的過度表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化，加速腎纖維化的進(jìn)展。

通過KEGG 通路富集分析及結(jié)合本專業(yè)和文獻(xiàn)知識(shí)，發(fā)現(xiàn)HQH 可通過調(diào)控多種信號(hào)通路來干預(yù)LN 的進(jìn)程。AGE-RAGE 信號(hào)通路的活化可介導(dǎo)CKD 的炎癥與腎纖維化的進(jìn)程，AGEs 受體，即RAGE，其激活能夠刺激煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶介導(dǎo)的ROS 的產(chǎn)生，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥、腎小球肥大、足細(xì)胞損傷和腎纖維化[24]。此外，AGE-RAGE 信號(hào)通路又能夠通過調(diào)控MAPK 信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)NF-κB 的表達(dá)，促使其下游的TNF-α、IL-6 過度表達(dá)，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)和引發(fā)腎組織損傷[25]。TNF 信號(hào)通路作為經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路之一，在炎癥反應(yīng)的早期其過度活化即可導(dǎo)致大量的TNF-α 釋放，一方面其可直接導(dǎo)致足細(xì)胞的損傷[26]，另一方面可誘導(dǎo)IL-1 和IL-6 等炎癥因子的產(chǎn)生，參與LN 的進(jìn)展[27-28]。IL-17 信號(hào)通路在CKD 領(lǐng)域具有重要的研究意義，通過抑制IL-17 信號(hào)通路的過度活化，可以減輕炎癥因子對(duì)腎臟帶來的損傷。研究發(fā)現(xiàn)[29]，白花蛇舌草能夠通過調(diào)控IL-17 信號(hào)通路進(jìn)而明顯下調(diào)MRL/lpr 模型小鼠的腎臟中炎癥因子的表達(dá)，減少中性粒細(xì)胞浸潤。而黃芪甲苷則能夠抑制血清IL-1β 和IL-17 的表達(dá)從而明顯抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的增加，減輕腎臟損傷[30]。

分子對(duì)接的結(jié)果顯示，HQH 中的核心成分（槲皮素、山柰酚、黃芩素、β-谷甾醇、黃豆黃素等）與LN 的關(guān)鍵靶點(diǎn)（VEGFA、FOS、MMP-9）結(jié)合較為穩(wěn)定。其中，β-谷甾醇與MMP-9、VEGFA、FOS，槲皮素與VEGFA、FOS，黃豆黃素與FOS，山奈酚與MMP-9 等對(duì)接后結(jié)合能相對(duì)較小，提示這極有可能是HQH 干預(yù)LN 的關(guān)鍵作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供一定的有價(jià)值的參考。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接的方法，對(duì)HQH 干預(yù)LN 的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在作用機(jī)制提供了初步的預(yù)測(cè)。通過分子對(duì)接驗(yàn)證了核心成分及靶點(diǎn)結(jié)合的可行性，最終證實(shí)了HQH 能夠通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路來干預(yù)LN 的進(jìn)程，為臨床運(yùn)用HQH 干預(yù)LN 的治療提供重要的參考依據(jù)，但其確切的作用機(jī)制仍需后續(xù)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究予以驗(yàn)證。