HPLC-MS／MS 法同時測定白頭翁湯中13 種成分及其配伍前后含量變化

譚小青，丘海芯，高紅偉，唐紅珍，覃喜軍，劉振杰*

（1.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西中藥質量標準研究重點實驗室，廣西 南寧 530022；2.廣西中醫(yī)藥大學，廣西優(yōu)勢中成藥與民族藥開發(fā)工程技術研究中心，廣西 南寧 530299）

白頭翁始載于《神農本草經》，是毛茛科植物白頭翁Pulsatillachinensis（Bge.） Regel 的干燥根，具有清熱解毒、涼血止痢功效［1-2］，臨床上主要用于治療急性菌?。?-4］、潰瘍性結腸炎［5-6］、腫瘤［7-10］等疾病。白頭翁湯組方包括4 味中藥，分別是君藥白頭翁、臣藥黃連和黃柏、使藥秦皮［11］，皂苷、生物堿、香豆素、黃酮、檸檬苦素、甾醇、木脂素為其主要有效成分［12-13］。賈婭倩等［14］采用HPLC法對白頭翁湯中6 種指標成分含量進行測定，樸美憬等［15］采用HPLC 法結合紫外法測定白頭翁湯中白頭翁皂苷B4 含量，時維靜等［16］采用正交試驗對白頭翁湯提取工藝進行優(yōu)化，再采用HPLC 法測定小檗堿含量。

前期報道，白頭翁湯含量測定方法主要是HPLC 法、分光光度法，測定成分主要是生物堿、香豆素，而對君藥白頭翁活性成分白頭翁皂苷的研究較少，也尚未對該方進行整體質量評價。因此，本實驗采用HPLC-MS／MS 方法同時測定白頭翁湯中白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿的含量，并考察其配伍前后變化，以期為該方及其相關制劑的質量控制提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 Xevo TQ-XS 超高效液相色譜／三重四級桿串聯質譜聯用儀，配置電噴霧離子源（ESI）、Analyst 數據處理系統(tǒng)，購自美國Waters 公司；Genius NM32LA 氮氣發(fā)生器，購自英國 Peak Scientific 公司；SQP 電子天平（十萬分之一），購自賽多利斯科學儀器 （北京） 有限公司；Centrifuge5424R 離心機，購自德國Eppendorf 公司。

1.2 試劑與藥物 白頭翁皂苷 B4 （批號PS010748）、白頭翁皂苷B5 （批號PS010727）、黑海常春藤皂苷A1 （批號PS001149）、白頭翁皂苷D （批號PS190923-03）、白頭翁皂苷A3 （批號PS011161）、α-常春藤皂苷（批號PS000085）、秦皮甲素 （批號 PS011025）、秦皮乙素 （批號PS011505）、秦皮素（批號PSOOO762）、黃柏堿（批號PS000447），鹽酸巴馬?。ㄅ朠S020011）、鹽酸黃連堿 （批號PS190923-04），鹽酸小檗堿（批號PS001003） 對照品均購自成都普思生物科技股份有限公司（純度≥98%）。乙腈為色譜純；甲醇為分析純；水為飲用水，購自屈臣氏集團（香港） 有限公司。

1.3 藥材 白頭翁、黃連、黃柏、秦皮購自全國各地，批號見表1，經廣西中醫(yī)藥大學許瓊明教授鑒定，白頭翁為毛茛科植物白頭翁Pulsatilla chinensis（Bge.） Regel 的干燥根，秦皮為木犀科植物白蠟樹FraxinuschinensisRoxb 的干燥枝皮［17-18］，黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch 的干燥根莖，黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron siniiY.C.Wu 的干燥樹皮［19］，按2020 年版《中國藥典》 一部標準檢測均合格。

表1 白頭翁湯藥材批號Tab．1 Batches of medicinal materials in Baitouweng Decoction

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿對照品適量，甲醇溶解，即得（各成分質量濃度分別為28.2、19.8、33、23、20.8、23.4、48、41、29.2、22.4、27.8、21.4、32.2 ng／mL），保存于4 ℃冰箱中。

2.2 供試品溶液制備 取白頭翁、黃柏、黃連、秦皮適量，除去雜質，切碎，本實驗用藥量按《傷寒論》 處方藥量減半。

2.2.1 白頭翁 取藥材6 g，加10 倍量水浸泡30 min，微沸1 h，濾過，繼續(xù)加8 倍量水微沸1 h，濾過，合并濾液，12 000 r／min 離心10 min，取上清液，50%甲醇稀釋定容至100 mL 量瓶中，即得，同法制備4 份。

2.2.2 白頭翁湯 取白頭翁6 g、黃柏4.5 g、黃連3 g、秦皮6 g，加10 倍量水浸泡30 min，微沸1 h，濾過，繼續(xù)加8 倍量水微沸1 h，濾過，合并濾液，12 000 r／min 離心10 min，取上清液，50%甲醇稀釋定容至250 mL 量瓶中，即得，同法制備4 份。

2.2.3 缺白頭翁陰性湯 取黃柏4.5 g、黃連3 g、秦皮6 g （除去白頭翁），其他操作同 “2.2.2”項，即得，同法制備4 份。

2.3 色譜條件 ACQUITY UPLC ? BEH C18色譜柱 （2.1 mm× 50 mm，1.7 μm）；流動相甲醇（A）-0.1% 甲酸 （B），梯度洗脫 （0～0.5 min，10% A；0.5～2 min，10%～90% A；2～4 min，90%A；4～6 min，90%～10% A）；體積流量0.2 mL／min；柱溫24.5 ℃；進樣量2.0 μL。

2.4 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；毛細管電壓3.0 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度550℃，體積流量1 000 L／h；錐孔氣體積流量50 L／h；正負離子掃描；多反應監(jiān)測（MRM） 模式，其他參數見表2。

表2 各成分質譜參數Tab．2 Mass spectrum parameters for various constituents

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性試驗 取對照品、供試品溶液各1份，在“2.3” “2.4” 項條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，2 種溶液在同一出峰時間均出現各成分色譜峰，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC-MS／MS 圖Fig．1 HPLC-MS／MS spectra for various constituents

2.5.2 線性關系考察 取對照品溶液適量，50%甲醇稀釋成系列質量濃度，在“2.3” “2.4” 項條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，并以S／N＝3 時的質量濃度為檢測限，結果見表3，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表3 各成分線性關系Tab．3 Linear relationships of various constituents

2.5.3 精密度試驗 取“ 2.5.1” 項下對照品溶液適量，在“2.3”“2.4” 項條件下進樣測定6 次，測得白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿峰面積RSD 分別為5.5%、6.9%、2.9%、9.6%、4.2%、4.8%、1.6%、1.1%、1.5%、0.6%、0.4%、0.3%、0.6%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取白頭翁湯供試品溶液（B1） 適量，室溫下于0、6、12、18、24 h 在“2.3” “2.4” 項條件下進樣測定，測得白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿峰面積RSD 分別為3.3%、7.1%、5.1%、2.1%、10.3%、11.2%、10.0%、7.3%、3.7%、2.1%、0.4%、1.2%、0.9%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復性試驗 取白頭翁湯（B1） 6 份，按“ 2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3” “2.4” 項條件下進樣測定，測得白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿峰面積RSD 分別為2.8%、3.1%、1.4%、12.6%、9.2%、8.1%、5.1%、4.8%、3.6%、1.0%、3.3%、2.6%、1.0%，表明該方法重復性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的白頭翁湯（B1） 6 份，分別加入100%水平對照品溶液1 mL，按“ 2.2.2” 項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.3” “2.4” 項條件下進樣測定，計算回收率。結果，白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿平均加樣回收率分別為106.2%、105.6%、99.7%、101.9%、98.3%、101.1%、103.5%、100.0%、93.9%、102.5%、98.9%、97.9%、94.4%，RSD 分別為3.1%、2.3%、1.9%、1.1%、3.3%、1.5%、2.9%、1.6%、3.8%、4.2%、3.2%、4.1%、2.6%。

2.6 樣品含量測定 取白頭翁、白頭翁湯、缺白頭翁陰性湯適量，按“ 2.2” 項下方法各平行制備4 份供試品溶液，在“2.3” “2.4” 項條件下進樣測定，計算含量，結果見表4。

表4 各成分含量測定結果（n＝6）Tab．4 Results of content determination of various constituents （n＝6）

2.7 配伍前后含量變化分析 圖2 顯示，白頭翁中白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5 含量均高于白頭翁湯中；單糖類皂苷α-常春藤皂苷、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷A3 含量在白頭翁中較高，以白頭翁皂苷A3 含量更明顯，而白頭翁皂苷D 含量在白頭翁湯中較高；缺白頭翁陰性湯中秦皮甲素、黃柏堿、巴馬汀等生物堿含量均高于白頭翁湯中，而白頭翁湯中秦皮素、秦皮乙素含量更高。

圖2 不同樣品中各成分含量變化Fig．2 Changes in contents of various constituents in different samples

圖3 顯示，白頭翁湯中雙糖類皂苷（白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5） 含量約為白頭翁中的1／5，單糖類皂苷（黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷） 含量約為白頭翁中的1／2，即合煎時皂苷含量低于單煎時；缺白頭翁陰性湯中香豆素（秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素） 含量約為白頭翁湯中的1／3，而白頭翁湯中生物堿（黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿）約為去頭翁湯的1／2，即單煎時香豆素含量低于合煎時，而生物堿含量更高。

圖3 不同種類成分含量變化Fig．3 Changes in contents of different kinds of constituents

3 討論

為了減少提取時氣泡的產生，本實驗在提取前先將藥材浸泡30 min 后再加熱。由于流動相為甲酸時峰形更理想，故選擇其作為流動相。在正離子模式下，黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿、白頭翁皂苷B5 有響應，而其他8 種成分在負離子模式下有響應。另外，本實驗所用試劑或樣品本身含有Na+，導致待測成分也產生了相關離子峰，通過儀器調諧功能進行正負離子調諧，發(fā)現白頭翁皂苷B5 正離子有很好的響應值，故選擇該模式作為其檢測方式。

前期報道，處方中藥材單煎、合煎可能改變其成分種類和含量［20-23］。本實驗采用HPLC-MS／MS法分別對白頭翁、白頭翁湯、缺白頭翁陰性湯中各成分含量進行測定，發(fā)現合煎會導致皂苷、生物堿類成分溶出量降低，香豆素類成分溶出量升高，推測可能是因為前2 類成分結合生成其他化合物而導致其溶出減少，而白頭翁湯中其他藥材可增加后一類成分溶出。

4 結論

本實驗采用HPLC-MS／MS 法同時測定白頭翁湯中白頭翁皂苷B4、白頭翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白頭翁皂苷D、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黃柏堿、巴馬汀、黃連堿、小檗堿的含量，并考察配伍前后其變化，該方法簡便可行，試劑消耗少，檢測時間短，對該方質量控制有一定參考價值。