芪黃湯治療免疫性血小板減少癥的療效及對細(xì)胞相關(guān)因子和外周血T淋巴細(xì)胞程序性死亡受體-1/程序性死亡配體-1的影響※

周 林 戴 燚 劉毓玲

(1.湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖北 武漢 430050;2.湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院綜合病區(qū),湖北 武漢 430050)

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)是一種獲得性自身免疫性疾病,由于體內(nèi)免疫失衡導(dǎo)致血小板破壞增多、生成減少而導(dǎo)致以皮膚黏膜出血以及內(nèi)臟出血為特征的一種自身免疫性疾病[1]。ITP是臨床最為常見的出血性疾病,成人發(fā)病率為5～10/10萬,育齡期女性發(fā)病率高于男性,60歲以上老年人是該病的高發(fā)群體[2]。ITP治療策略在于阻止血小板過度破壞和促血小板生成,使血小板計(jì)數(shù)維持在安全水平內(nèi),控制出血[3]。2018年6月至2020年12月,我們在糖皮質(zhì)激素治療基礎(chǔ)上應(yīng)用芪黃湯治療ITP 45例,并與糖皮質(zhì)激素治療45例對照,觀察療效及對細(xì)胞相關(guān)因子和外周血淋巴細(xì)胞程序性死亡受體-1(PD-1)/程序性死亡配體-1(PD-L1)的影響,結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 全部90例均為我院綜合科住院患者,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為2組。治療組45例,男17例,女28例;年齡18～80歲,平均(58.4±3.9)歲;病程4～50個(gè)月,平均(20.8±10.1)個(gè)月;體質(zhì)量指數(shù)(BMI)21.65±5.47。對照組45例,男20例,女25例;年齡20～75歲,平均(60.1±2.3)歲;病程5～45個(gè)月,平均(22.3±9.5)個(gè)月;BMI 20.63±6.78。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 病例選擇

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識(shí)(2016年版)》[2]中ITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 年齡18～80歲;3個(gè)月內(nèi)未接受過糖皮質(zhì)激素治療的患者;臨床資料完整;本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)通過,患者自愿簽署知情同意書。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 參與研究前接受過血小板輸注或糖皮質(zhì)激素治療者;因其他疾病接受過糖皮質(zhì)激素治療或有糖皮質(zhì)激素禁忌證等;妊娠或哺乳期女性患者;合并嚴(yán)重肝腎功能不全者;其他繼發(fā)性血小板減少癥。

1.3 治療方法

1.3.1 對照組 予糖皮質(zhì)激素治療。氫化可的松琥珀酸鈉(天津生物化學(xué)制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H12020493)50～100 mg/d,加入0.9%氯化鈉注射液100 mL中,每日1次靜脈滴注,治療5天。血小板(PLT)計(jì)數(shù)>80×109/L予醋酸潑尼松片(山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限公司,國藥準(zhǔn)字H20033023)1.5～2 mg/(kg·d)口服,治療1～2周,緩慢減量后以10 mg/d維持治療。

1.3.2 治療組 在對照組治療基礎(chǔ)上加芪黃湯。藥物組成:黃芪15 g,生地黃15 g,熟地黃15 g,白術(shù)12 g,茯苓15 g,女貞子15 g,墨旱蓮15 g,太子參15 g,菟絲子15 g,枸杞15 g,山藥18 g,豆蔻12 g。日1劑,水煎2次取汁400 mL,分早、晚2次服。

1.3.3 療程 2組均治療2個(gè)月。

1.4 觀察指標(biāo)及方法 ①ITP出血評分[2]:年齡≥65歲1分,≥75歲2分;皮膚(淤點(diǎn)/淤斑/皮下血腫),頭面部2分,其他部位1分;黏膜(鼻出血/牙齦出血/口腔血皰/結(jié)膜出血),偶發(fā)、可自止2分,多發(fā)、持續(xù)不止3分,伴貧血5分;深部器官(內(nèi)臟出血如肺、胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)),不伴貧血3分,伴貧血5分,危及生命8分;中樞神經(jīng)系統(tǒng)8分。②用EDTA-K2抗凝管采集患者靜脈血2 mL,采用SYSMEX XT-1800i型全自動(dòng)血液分析儀檢測PLT計(jì)數(shù);分離膠促凝管采集靜脈血4 mL,離心取血清,采用Rayto RT-6000型酶標(biāo)分析儀,采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血小板相關(guān)抗體(PAIg)G、PAIgM、干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、IL-17;EDTA-K2抗凝管采集靜脈血2 mL,采用BD FACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測外周血T淋巴細(xì)胞CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD4+PD-L1+、CD8+PD-L1+百分比。

1.5 療效標(biāo)準(zhǔn)[2]完全反應(yīng):治療后PLT計(jì)數(shù)≥100×109/L且無出血;有效:治療后PLT計(jì)數(shù)≥30×109/L且至少比基礎(chǔ)PLT計(jì)數(shù)增加2倍,且無出血;無效:治療后PLT計(jì)數(shù)<30×109/L或PLT計(jì)數(shù)增加不到基礎(chǔ)值的2倍或有出血。在定義完全反應(yīng)或有效時(shí),應(yīng)至少檢測2次,期間至少間隔7天。復(fù)發(fā):治療有效后,PLT計(jì)數(shù)<30×109/L或PLT計(jì)數(shù)降至不到基礎(chǔ)值的2倍或出現(xiàn)出血癥狀,定義復(fù)發(fā)時(shí)至少檢測2次PLT計(jì)數(shù),期間至少間隔1天。總有效率=(完全反應(yīng)例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。復(fù)發(fā)率=復(fù)發(fā)例數(shù)/(完全反應(yīng)例數(shù)+有效例數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1 2組療效比較 治療組總有效率86.67%(39/45),復(fù)發(fā)率10.26%(4/39);對照組總有效率68.89%(31/45),復(fù)發(fā)率29.03%(9/31)。治療組療效優(yōu)于對照組(P<0.05),復(fù)發(fā)率低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 2組療效比較 例

2.2 2組治療前后ITP出血評分比較 2組治療后ITP出血評分均較本組治療前降低(P<0.05),且治療組降低更明顯(P<0.05),比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 2組治療前后ITP出血評分比較 分,

2.3 2組治療前后PLT計(jì)數(shù)、PAIgG、PAIgM比較 2組治療后PLT計(jì)數(shù)較本組治療前升高(P<0.05),PAIgG、PAIgM均較本組治療前降低(P<0.05);治療后治療組PLT計(jì)數(shù)高于對照組(P<0.05),PAIgG、PAIgM均低于對照組(P<0.05),比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 2組治療前后PLT、PAIgG、PAIgM比較

2.4 2組治療前后IFN-γ、IL-10、TGF-β、IL-17水平比較 2組治療后IFN-γ、IL-17水平均較本組治療前降低(P<0.05),IL-10、TGF-β水平較本組治療前升高(P<0.05);治療后治療組IFN-γ、IL-17水平均低于對照組(P<0.05),IL-10、TGF-β水平均高于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 2組治療前后IFN-γ、IL-10、TGF-β、IL-17水平比較

2.5 2組治療前后外周血T淋巴細(xì)胞PD-1/PD-L1水平比較 2組治療后外周血CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD4+PD-L1+、CD8+PD-L1+水平均較本組治療前降低(P<0.05);治療后治療組外周血CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+水平均低于對照組(P<0.05)。見表5。

表5 2組治療前后外周血T淋巴細(xì)胞PD-1/PD-L1水平比較

3 討論

ITP的發(fā)病機(jī)制有自身抗體產(chǎn)生、機(jī)體免疫耐受失衡、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)介導(dǎo)的血小板破壞、骨髓巨核細(xì)胞發(fā)育成熟障礙及血小板生成減少[4-5]。

目前,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療ITP主要應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及無效病例切脾等,但有相當(dāng)部分病例治療后反復(fù)遷延不愈而轉(zhuǎn)化為難治性ITP,需要中醫(yī)藥輔助或支撐治療。

ITP屬中醫(yī)學(xué)血證、紫斑、肌衄、葡萄疫等范疇,本病起病緩慢,病程遷延,臨床表現(xiàn)為皮膚出現(xiàn)青紫斑點(diǎn)和斑塊,還有頭暈乏力、舌淡苔白、脈細(xì)無力等脾腎虛損之候?！吨T病源候論·傷寒病諸候》提出“熱毒乘虛,出于皮膚,所以發(fā)斑瘡隱疹如錦紋”。《景岳全書·血證》提出“血本陰精,不宜動(dòng)也,而動(dòng)則為病;營氣,不易損也,而損則為病。蓋動(dòng)者多因于火,火盛則逼血妄行;損者多由于氣,氣傷則血無以存”。現(xiàn)代中醫(yī)提出,ITP外因?yàn)轱L(fēng)寒火濕邪毒侵襲營血,內(nèi)因?yàn)闅庋庩柼澨?、血溢脈外,病機(jī)特點(diǎn)為陰虛火旺、氣不攝血、熱迫血行、瘀血阻滯,且這四種形式往往相互交錯(cuò)而又相互影響;脾腎虛弱是其病理基礎(chǔ),且貫穿疾病的全程,及脾者以脾不統(tǒng)血證候多見,及腎者以陰虛內(nèi)熱,血熱妄行多見;歸納概括為外感溫?zé)岵⌒凹皟?nèi)有臟腑虛損,導(dǎo)致機(jī)體臟腑、陰陽氣血失調(diào),血不循經(jīng)而出血[6-7]。芪黃湯方中黃芪、地黃為君藥,黃芪甘溫,健脾益腎,補(bǔ)氣固表,升提攝血;生地黃清熱涼血,止血,養(yǎng)陰生津,熟地黃補(bǔ)血滋陰,益精填髓,兩者配伍,生津補(bǔ)血,健脾益氣,滋陰補(bǔ)腎,清熱涼血。白術(shù)、茯苓、女貞子、墨旱蓮共為臣藥,脾為氣血之源,主中氣而統(tǒng)血,黃芪合白術(shù)、茯苓益氣健脾增益明顯。白術(shù)補(bǔ)益健脾,燥濕利水。墨旱蓮甘、酸而寒,入肝、腎二經(jīng),補(bǔ)益肝腎之陰,涼血止血,補(bǔ)中有清,為清補(bǔ)之品,與女貞子配伍,既能補(bǔ)益肝腎,又能滋陰止血[8]。太子參益氣生津;菟絲子、枸杞、山藥滋陰補(bǔ)腎,培元固本;豆蔻化濕消痞,行氣溫中,共為佐、使藥。全方配伍合理,主從有序,方證相合,運(yùn)用益氣攝血、清熱涼血、補(bǔ)虛扶正、健脾益氣之法,標(biāo)本兼治?，F(xiàn)代藥理研究表明,黃芪多糖能調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫,通過增加脾淋巴細(xì)胞而改善模型小鼠脾臟指數(shù),從而促進(jìn)血小板生成[9],能促進(jìn)小鼠骨髓的恢復(fù)及外周三系血細(xì)胞的恢復(fù)[10];黃芪糖蛋白可通過不同程度促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化增殖,抑制輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)的分化增殖,有效恢復(fù)Th17/Treg細(xì)胞平衡[11];熟地黃多糖對外周血象、骨髓有核細(xì)胞下降均有拮抗作用,對造血干細(xì)胞具有促進(jìn)增殖、分化作用,地黃苷D可明顯提高血小板數(shù)[12];白術(shù)內(nèi)酯與白術(shù)多糖通過抑制炎癥因子、調(diào)節(jié)免疫等方式治療免疫系統(tǒng)疾病[13];茯苓酸通過抑制IFN-γ分泌,抑制CTL對靶細(xì)胞的殺傷[14];女貞子中紅景天苷可通過提高其特異性免疫功能、巨噬細(xì)胞吞噬功能、機(jī)體非特異免疫功能、阻止骨髓細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)造血干細(xì)胞增殖分化等,從而調(diào)節(jié)其免疫功能[15]。

本研究結(jié)果顯示,治療組總有效率高于對照組(P<0.05),復(fù)發(fā)率低于對照組(P<0.05);治療后治療組ITP出血評分低于對照組(P<0.05)。說明芪黃湯聯(lián)用糖皮質(zhì)激素較單獨(dú)使用糖皮質(zhì)激素治療ITP具有更高的總有效率及更低的復(fù)發(fā)率,且ITP出血評分更低[16]。

血小板生成減少及自身抗體產(chǎn)生是ITP發(fā)病中重要的臨床指標(biāo),患者血清主要檢測到IgG及IgM型血小板抗體。本研究結(jié)果顯示,2組治療后PLT計(jì)數(shù)較治療前升高(P<0.05),PAIgG、PAIgM均較本組治療前降低(P<0.05);治療后治療組PLT計(jì)數(shù)高于對照組(P<0.05),PAIgG、PAIgM均低于對照組(P<0.05)。表明芪黃湯恢復(fù)患者PLT計(jì)數(shù)及減少血小板抗體較對照組具有更好療效。

有研究發(fā)現(xiàn),CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的比例失調(diào)及其分泌的細(xì)胞因子失衡參與了ITP的發(fā)生發(fā)展[17]。ITP患者Th1/Th2失衡,Th1型占優(yōu)勢表達(dá),且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[18],ITP患者同時(shí)存在Th17/Treg比例失衡[19]。IFN-γ來源于Th1細(xì)胞,促炎作用強(qiáng),在疾病的發(fā)展中起主要作用,IL-10來源于Th2細(xì)胞,Th1和Th2之間通過分泌細(xì)胞因子相互制約,維持動(dòng)態(tài)免疫平衡。Th17細(xì)胞分泌IL-17在ITP患者中明顯增高[20],Treg細(xì)胞分泌TGF-β則引起免疫耐受,兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡在維持機(jī)體免疫狀態(tài)穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),2組治療后IFN-γ、IL-17水平均較本組治療前降低(P<0.05),IL-10、TGF-β水平較本組治療前升高(P<0.05);治療后治療組IFN-γ、IL-17水平均低于對照組(P<0.05),IL-10、TGF-β水平均高于對照組(P<0.05),提示芪黃湯可能通過降低Th1、Th17細(xì)胞因子表達(dá),提高Th2、Treg細(xì)胞因子表達(dá)從而調(diào)整Th1/Th2和Th17/Treg平衡,達(dá)到治療效果。

有研究表明,ITP患者CD4+T淋巴細(xì)胞表面PD-1比例升高,并且PD-1/PD-L1升高與ITP患者疾病活動(dòng)程度有一定關(guān)系[21]。PD-1是一種Ⅰ型跨膜蛋白受體,屬于免疫球蛋白CD28家族,表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞,在維持淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面起關(guān)鍵作用;PD-1的配體PD-L1是Ⅰ型跨膜蛋白受體B7家族的成員,廣泛表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓來源的肥大細(xì)胞和一些非造血細(xì)胞[22-23]。PD-1/PD-L1在T淋巴細(xì)胞成熟、分化和增殖過程中能夠提供負(fù)性共刺激信號(hào),在機(jī)體免疫功能異?？哼M(jìn)時(shí)代償性分泌增多,參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展過程[24-25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),2組治療后外周血CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD4+PD-L1+、CD8+PD-L1+水平均較本組治療前降低(P<0.05);治療后治療組外周血CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+水平均低于對照組(P<0.05),提示芪黃湯可能通過調(diào)節(jié)CD4+T淋巴細(xì)胞PD-1/PD-L1信號(hào),使其處于低表達(dá),免疫功能亢進(jìn)被抑制,進(jìn)而改善病情。

綜上所述,芪黃湯治療ITP,可提高患者PLT計(jì)數(shù),降低PAIg水平和ITP出血評分,其機(jī)制可能與減少IFN-γ、IL-17分泌水平、提高IL-10、TGF-β表達(dá)水平,從而調(diào)節(jié)Th1/Th2和Th17/Treg免疫平衡、降低CD4+T淋巴細(xì)胞PD-1/PD-L1信號(hào)表達(dá)水平來干預(yù)細(xì)胞免疫環(huán)境相關(guān)。