微生物胞外多糖結(jié)構(gòu)與活性研究進(jìn)展

李春雨，屈建航，周佳

（河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

多糖通常是由十幾種單糖通過(guò)糖苷鍵連接并組合而形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)高分子聚合物，是生命組成的四大基本物質(zhì)之一[1]。微生物多糖是一類(lèi)豐富且重要的化合物，主要由細(xì)菌、真菌和藻類(lèi)分泌。根據(jù)多糖在細(xì)胞中的不同位置，可以分為胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）、胞壁多糖和胞內(nèi)多糖三大類(lèi)[2]。微生物胞外多糖是一些特殊微生物通過(guò)碳源的吸收同化在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞壁外的聚合物，屬于微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物。胞內(nèi)多糖和胞壁多糖產(chǎn)量低，成分復(fù)雜，雜質(zhì)多，提取純化不易，相比之下，微生物胞外多糖生產(chǎn)周期短，易分離純化，具有更高的經(jīng)濟(jì)效益[3]。

胞外多糖是微生物產(chǎn)生的重要代謝物，這些EPS分子主要負(fù)責(zé)生物膜的形成，也參與細(xì)胞防御機(jī)制，保護(hù)菌體免受外界環(huán)境壓力[4]。大量研究表明，微生物EPS 具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血糖、乳化、絮凝等多種生物活性[5]，除此之外，微生物EPS 不僅是天然化合物，而且屬于可再生可持續(xù)發(fā)展的資源，應(yīng)用范圍非常廣泛，其中普魯蘭多糖、結(jié)冷膠及黃原膠等多個(gè)產(chǎn)品已應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等多個(gè)領(lǐng)域[6]。

微生物EPS 的來(lái)源不同，其結(jié)構(gòu)與功能也各不相同。因此，本文對(duì)微生物胞外多糖的結(jié)構(gòu)表征及生物活性進(jìn)行歸納總結(jié)，并探討二者之間的構(gòu)效關(guān)系，以期為微生物EPS 在食品、藥品、化工等領(lǐng)域的研究與應(yīng)用發(fā)展提供思路和理論依據(jù)。

1 微生物胞外多糖的結(jié)構(gòu)

1.1 初級(jí)結(jié)構(gòu)

微生物胞外多糖的結(jié)構(gòu)分為初級(jí)（一級(jí)）結(jié)構(gòu)和高級(jí)（二、三、四級(jí)）結(jié)構(gòu)。初級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括胞外多糖的分子量、單糖組成及比例、異頭碳構(gòu)型、糖苷鍵類(lèi)型、糖鏈中糖基排列順序和分支情況、單糖殘基上的羥基取代狀況等[7]。對(duì)于多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析方法主要分為物理、化學(xué)和生物學(xué)三大類(lèi)，如表1 所示。通常采用色譜法測(cè)定分子量（高效液相色譜或凝膠排阻色譜）和單糖組成及比例（氣相色譜或液相色譜），采用紅外光譜法對(duì)異頭碳構(gòu)型進(jìn)行分析，采用甲基化和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）對(duì)單糖連接次序以及化學(xué)基團(tuán)等進(jìn)行表征分析。

表1 胞外多糖初級(jí)結(jié)構(gòu)分析方法Table 1 Methods for primary structure analysis of exopolysaccharides

目前，已報(bào)道的產(chǎn)胞外多糖的微生物主要有乳桿菌（Lactobacillus sp.）[8]、芽孢桿菌（Bacillus sp.）[5]、魏斯氏菌（Weissella sp.）[9]、明串珠菌（Leuconostoc sp.）[10]、發(fā)酵乳酸桿菌（Limosilactobacillus sp.）[11]腸球菌（Enterococcus sp.）[12]、毛霉（Mucor sp.）[13]、小球藻（Chlorella sp.）[14]等，這些多糖種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，通常采用多種方法綜合運(yùn)用，解析多糖的結(jié)構(gòu)，具體表征方法及研究結(jié)果如表2 所示。

表2 胞外多糖初級(jí)結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展Tab le 2Rese arch progres s in primary structures of exop olysaccharides

1.2 高級(jí)結(jié)構(gòu)

多糖結(jié)構(gòu)的研究晚于蛋白質(zhì)和核酸，且多糖結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，目前關(guān)于微生物EPS高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究尚處于起步階段。Vinothkanna 等[21]通過(guò)原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）在分子水平上直接觀察到地衣芽孢桿菌AG-06 EPS 在分子間、分子內(nèi)聚集，形成球形團(tuán)塊和鏈狀特征且球形結(jié)構(gòu)的尺寸遠(yuǎn)大于鏈狀多糖。徐淵美[22]通過(guò)剛果紅試驗(yàn)檢測(cè)植物乳桿菌KX041 EPS-3 是否具有三螺旋構(gòu)象，結(jié)果顯示在弱堿環(huán)境下，EPS-3 與剛果紅聚合物產(chǎn)生了紅移，表明其具有三螺旋結(jié)構(gòu)。除此之外，還可通過(guò)掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）、X-射線(xiàn)衍射（X -ray diffraction，XRD）、 圓二色譜（circular dichroism，CD）、分子模擬技術(shù)等方法對(duì)多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征[23-24]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于解析胞外多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)的相關(guān)報(bào)道較少，這主要與多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、解析難度高、解析技術(shù)水平相對(duì)有限等原因有關(guān)。

2 胞外多糖的活性

2.1 抗氧化活性

自由基和活性氧在人體的新陳代謝活動(dòng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，但含量過(guò)高時(shí)會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使細(xì)胞膜破壞、核酸斷裂、蛋白質(zhì)損壞等，進(jìn)而引發(fā)氧化應(yīng)激性相關(guān)疾病[25]。清除氧活性化自由基是抗氧化藥物發(fā)揮其藥效的一個(gè)重要途徑。目前食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用的抗氧化劑主要有沒(méi)食子酸酯、丁基羥基茴香醚、2，6-二叔丁基甲酚、三羥基苯丁酮等，這些抗氧化劑均是合成的，不僅具有一定毒性而且生產(chǎn)成本高，因此對(duì)天然抗氧化劑的研究和開(kāi)發(fā)受到了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[26]。

許多研究表明，微生物EPS 具有較好的抗氧化能力，能減輕自由基等對(duì)機(jī)體造成的氧化損傷。通過(guò)自由基清除和還原力測(cè)試的方法，研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自細(xì)菌[27-28]、真菌[29]、藻類(lèi)[30]等微生物的胞外多糖都具有自由基清除能力和還原能力，且表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。除此之外，胞外多糖還可改善細(xì)胞抗氧化的能力。Wang等[31]探究了球毛殼菌CGMCC 6882 EPS 對(duì)巨噬細(xì)胞抗氧化的影響，結(jié)果表明該多糖可通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶）的活性和總抗氧化能力以及減少丙二醛的含量顯著提高細(xì)胞的活力。Wang 等[32]研究了發(fā)酵乳桿菌S1 的EPS對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)抗氧化的影響，結(jié)果表明，該EPS 可顯著提高線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)總抗氧化能力和超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛含量水平，顯著改善線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化狀態(tài)。這些研究結(jié)果表明，微生物EPS 有可能成為一種天然抗氧化劑在食品、藥品等行業(yè)中應(yīng)用。

2.2 抗腫瘤活性

癌癥是主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，癌細(xì)胞是惡性腫瘤中最常見(jiàn)的一類(lèi)。大量研究表明，EPS 具有抗腫瘤活性，其作用機(jī)制主要分為兩種：一種是直接作用于腫瘤細(xì)胞，直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡等；另一種是作用于宿主細(xì)胞，通過(guò)提高宿主的免疫功能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或殺死腫瘤細(xì)胞[33]。

大量研究報(bào)道了微生物EPS 的抗腫瘤活性。海洋芽孢桿菌EPS 濃度超過(guò)50 μg/mL 時(shí)具有顯著抑制HeLa 細(xì)胞增殖的作用[34]。副干酪乳桿菌EPS 對(duì)Caco-2細(xì)胞作用72 h 時(shí)的抑制率達(dá)到19.5%（500 μg/mL），該EPS 可通過(guò)影響Caco-2 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[35]。低劑量粒毛盤(pán)菌胞外多糖硒納米顆粒可有效抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤細(xì)胞的增殖，除此之外，可增加血清中的免疫因子白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-1-β、γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ） 和腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）的質(zhì)量濃度，繼而激活抗腫瘤免疫系統(tǒng)抑制腫瘤的生長(zhǎng)[36]。深海細(xì)菌EPS 對(duì)肝癌細(xì)胞Bel-7402 和Huh7.5 均具有較好的生長(zhǎng)抑制作用，對(duì)兩種細(xì)胞系的抗腫瘤作用的IC50為0.4～0.5 mg/mL，構(gòu)建抗腫瘤模型發(fā)現(xiàn)，該EPS 通過(guò)靶向FGF19-FGFR4 信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用[37]。真菌胞外多糖羧甲基化后，降低了MCF-7 細(xì)胞的增殖，降低細(xì)胞形成菌落和在細(xì)胞外基質(zhì)中遷移的能力[38]。

2.3 抗炎癥活性

炎癥因子的過(guò)度表達(dá)會(huì)造成細(xì)胞、組織、器官的損傷，甚至?xí)偈鼓[瘤生長(zhǎng)，因此消除炎癥因子并恢復(fù)免疫穩(wěn)態(tài)對(duì)保護(hù)機(jī)體具有重要意義。EPS 可起到抑制感染，預(yù)防和治療炎癥的作用，一般是通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)分子來(lái)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的應(yīng)答反應(yīng)，從而發(fā)揮其抗炎癥活性[39]。

EPS 的抗炎活性研究主要以巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞為載體，Zhang 等[40]從沼澤紅假單胞菌提取胞外多糖，體外免疫試驗(yàn)表明，其EPS 可激活巨噬細(xì)胞的吞噬能力，并且可以促進(jìn)腸道有益菌群的生長(zhǎng)。周興濤[41]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌NCU116 EPS 可減輕右旋糖酐硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥，機(jī)制探究結(jié)果表明，EPS 可促進(jìn)緊密連接蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子STAT3 信號(hào)通路，調(diào)節(jié)腸道黏膜屏障功能，從而減輕炎癥。房曉彬[42]發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌EPS103 對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7 具有雙重體外免疫調(diào)節(jié)作用，一方面，在未被脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 激活的巨噬細(xì)胞中，EPS103可顯著增強(qiáng)細(xì)胞的吞噬能力，并促進(jìn)促炎細(xì)胞分子（IL-6、TNF-α 和NO）的分泌；另一方面，在LPS 激活的巨噬細(xì)胞中，EPS103 能顯著抑制促炎細(xì)胞分子產(chǎn)生以及相關(guān)基因的表達(dá)，緩解LPS 對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的刺激，說(shuō)明EPS 既可以適當(dāng)促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加快機(jī)體修復(fù)，也可以抑制促炎分子分泌，防止過(guò)度免疫。

2.4 抑菌活性

濫用抗生素帶來(lái)的耐藥性細(xì)菌日益增多已成為一個(gè)世界性的問(wèn)題，除了對(duì)抗生素的使用進(jìn)行更科學(xué)的管理外，還迫切需要開(kāi)發(fā)更加綠色高效的抗生素替代品[43]。多糖的抑菌機(jī)制主要有抑制細(xì)菌生物膜的形成、阻礙細(xì)菌代謝、破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、降低基因轉(zhuǎn)錄水平等[44]。

唐少軍等[45]對(duì)粗毛纖孔菌EPS 抑菌能力進(jìn)行了探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該EPS 對(duì)白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌均有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑分別為12、11、11 mm。淡水微藻的EPS 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑可以達(dá)到14.72 mm，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌能力[46]。Xu 等[47]研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌EPS 對(duì)金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和大腸桿菌O157∶H7 均有抑制作用，該EPS 可通過(guò)抑制生物膜的形成和分散病原菌發(fā)揮抗菌性能。Hu 等[15]發(fā)現(xiàn)，乳桿菌PW-7 EPS 具有抑菌作用且對(duì)幽門(mén)螺桿菌的最低抑制濃度為50 mg/mL，抗菌機(jī)理研究結(jié)果表明該EPS通過(guò)破壞幽門(mén)螺桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜發(fā)揮其抗菌作用。

2.5 其他活性

微生物胞外多糖除上述活性外，還具有乳化、保濕、金屬離子吸附等活性。楊艷芳[48]對(duì)檸檬明串珠菌N21 的EPS 進(jìn)行乳化試驗(yàn)，結(jié)果顯示，7 d 與24 d 時(shí)該EPS 對(duì)葵花油的乳化指數(shù)與24 h 的乳化指數(shù)無(wú)顯著差異，表明其具有良好的乳化穩(wěn)定性，可作為食品添加劑提高食品的乳化穩(wěn)定性。曹永強(qiáng)等[49]研究?jī)芍曛参锶闂U菌EPS 的乳化特性，結(jié)果表明二者均可形成相對(duì)較小的乳化顆粒，且兩者的胞外多糖均對(duì)十六烷有極強(qiáng)的乳化效果，24 h 內(nèi)最高可達(dá)（93.01±2.29）%和（83.33±1.21）%。周璇[50]對(duì)地衣芽孢桿菌Ⅱ4-01 胞外多糖在不同環(huán)境中的吸濕活性和保濕活性進(jìn)行了探究，結(jié)果顯示在相對(duì)濕度為43%和81%環(huán)境中，純多糖的吸濕能力強(qiáng)于殼聚糖和黃原膠；在相對(duì)濕度0%（干燥硅膠）環(huán)境中，多糖的保濕活性明顯高于殼聚糖和黃原膠。關(guān)志國(guó)等[51]在研究中采用紅球菌HX-2 產(chǎn)生的EPS 吸附水體中的Cu2＋，經(jīng)模型擬合得到最大吸附量，為144.93 mg/g，這一特性可應(yīng)用于工業(yè)廢水中重金屬離子的治理。

EPS 因具有特殊的理化性質(zhì)，在食品中添加EPS成為一種功能性食品開(kāi)發(fā)的研究方向。賴(lài)田甜等[52]在植物乳桿菌NMGL2 對(duì)鮮牛乳發(fā)酵過(guò)程中添加胞外多糖，結(jié)果表明其能顯著提高發(fā)酵乳的彈性和黏性，顯著降低流動(dòng)性和硬度。張逢溫等[53]研究發(fā)現(xiàn)，融合魏斯氏菌胞外多糖對(duì)無(wú)蛋蛋糕面糊特性和烘焙品質(zhì)具有顯著的改善作用。Yuan 等[54]將強(qiáng)雄腐霉胞外多糖PEPS-2 應(yīng)用于草莓保鮮中，結(jié)果顯示該多糖可顯著提高草莓采后的生理品質(zhì)，有效延緩草莓腐爛、延長(zhǎng)草莓貨架期?？傊珽PS 具備的優(yōu)良特性可使其作為天然食品添加劑，如抗氧化劑、穩(wěn)定劑、增稠劑等應(yīng)用在食品行業(yè)中。

3 胞外多糖結(jié)構(gòu)與活性的構(gòu)效關(guān)系

微生物EPS 的生物活性與結(jié)構(gòu)息息相關(guān)，多糖的結(jié)構(gòu)影響其物理性質(zhì)，從而對(duì)生物活性產(chǎn)生影響。明晰多糖結(jié)構(gòu)與活性之間的構(gòu)效關(guān)系有利于功能性多糖的特異性篩選和應(yīng)用。由于多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，解析難度大，目前對(duì)結(jié)構(gòu)與活性的構(gòu)效關(guān)系研究還不夠深入，但根據(jù)目前的研究探索可知多糖的單糖組成、分子量、糖苷鍵、分子構(gòu)象、取代基等對(duì)多糖功能均具有不同程度的影響。

單糖是EPS 最基礎(chǔ)的組成單元，與EPS 的活性緊密相關(guān)。Zhu 等[55]從菌株SJ14 中分離得到的兩種富含甘露糖的胞外多糖EPS-1（75.9%）和EPS-3（28.7%）均表現(xiàn)出較好的自由基清除活性，且EPS-1 的清除活性顯著高于EPS-3，表明EPS 中含有甘露糖可能使其具有較強(qiáng)的抗氧化活性。Lo 等[56]以香菇多糖為樣品探究了抗氧化性與單糖組成之間的關(guān)系，結(jié)果表明，隨著鼠李糖和甘露糖含量的增加，抗氧化性能也隨之增大。EPS 分子量的大小對(duì)生物活性的發(fā)揮具有重要影響，與較大的EPS 相比，低分子量EPS 中存在更多的游離還原羥基末端，而且更容易穿透細(xì)胞，可通過(guò)羥基提供電子或氫發(fā)揮自由基清除能力，保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷[11]，在提高其抗氧化活性方面起著至關(guān)重要的作用[57]。而較大分子量的EPS 與抗腫瘤活性相關(guān)，不同種類(lèi)的多糖發(fā)揮抗腫瘤活性的分子量分段不同，通常情況下，在一定濃度范圍內(nèi)，分子量越高的多糖水溶性越高，抗腫瘤活性也越強(qiáng)[58]。EPS 的糖苷鍵對(duì)其生物活性同樣具有重要的影響，目前尚未有確切定論，但在當(dāng)前研究中發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律，如α-（1→6）-糖苷鍵對(duì)EPS 清除反應(yīng)具有積極作用，因?yàn)檫@種鍵可以提供靈活的區(qū)域，增加活性基團(tuán)與自由基相互作用的可及性[11]。一些以β-（1→2）連接的葡聚糖、半乳糖和甘露糖，大多具有抗腫瘤活性，以β-（1→6）連接的葡聚糖不具有抗腫瘤活性[59]。除此之外，EPS 的生物活性與三螺旋結(jié)構(gòu)也關(guān)聯(lián)密切，尤其是免疫調(diào)節(jié)和抗癌作用方面[60]。Kojima 等[61]研究發(fā)現(xiàn)，如果三螺旋結(jié)構(gòu)消失，發(fā)生解旋，會(huì)極大降低多糖的活性，造成多糖的抗腫瘤活性消失。Zhang 等[62]研究發(fā)現(xiàn)，不同種香菇多糖在分子質(zhì)量相近的情況下，具有三螺旋結(jié)構(gòu)的香菇多糖對(duì)肉瘤S-180 細(xì)胞的抑制率高于不具有三螺旋結(jié)構(gòu)的香菇多糖。

4 結(jié)論與展望

微生物胞外多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、乳化等多種生物活性，且毒副作用小，可成為化學(xué)合成聚合物的替代品，在食品、藥品、化妝品等行業(yè)具有較大的應(yīng)用潛力，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。微生物胞外多糖的這些活性與其單糖組成、分子量、糖苷鍵等結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。目前關(guān)于胞外多糖的活性研究較多，但結(jié)構(gòu)復(fù)雜，解析困難，未能深入挖掘生物活性與結(jié)構(gòu)的構(gòu)效關(guān)系。除此之外，有關(guān)胞外多糖的研究大多數(shù)為實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，無(wú)法滿(mǎn)足大規(guī)模生產(chǎn)，胞外多糖的放大應(yīng)用研究仍需突破。