環(huán)丙沙星生物條形碼檢測技術(shù)的研究

栗慧，于苗，孫豐梅，魏玉文，魏東*

（1. 河北北方學(xué)院 河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000；2. 河北北方學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075000；3. 河北北方學(xué)院 張家口市特色農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000；4. 張家口市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北 張家口 075000）

環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CPFX）屬于氟喹諾酮類藥物，物理形態(tài)為結(jié)晶粉末，顏色呈現(xiàn)為白色或微黃色，化學(xué)分子式為C17H18FN3O3[1]。其藥物作用為破壞細(xì)菌DNA 的雙螺旋鏈，干擾其DNA 轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及重組等過程。醫(yī)學(xué)上一般應(yīng)用于由敏感病原體引起的呼吸道感染、胃腸道感染、肺部感染、泌尿道感染和局部感染等疾病[2-5]。由于其抗菌活性比其他氟喹諾酮類藥物強(qiáng)，尤其是對革蘭氏陰性菌和支原體，是氧氟沙星和培氟沙星的4 倍，所以在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中被廣泛應(yīng)用，但其存在一定的不良反應(yīng)發(fā)生率、二重感染率以及細(xì)菌耐藥性等問題，特別是耐藥性問題，對環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥性后，可能也會(huì)引發(fā)對其他喹諾酮類藥物的交叉耐藥性，甚至對氨基糖苷類藥物也產(chǎn)生耐藥性[6-8]。目前，對我國食品中獸藥的最大殘留限量采用GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了環(huán)丙沙星在牛、羊、豬的肌肉中允許殘留的最大限量為400 μg/kg，在家禽肌肉中允許殘留的最大限量為300 μg/kg，魚（皮+肉）中允許殘留的最大限量為300 μg/kg[9]。近年來，動(dòng)物源性食品中的環(huán)丙沙星殘留問題引起了消費(fèi)者的廣泛關(guān)注。目前，對動(dòng)物源性食品中CPFX 殘留的檢測方法包括微生物法[10]與儀器方法[11-12]等，其中最常用的方法是高效液相色譜法和高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法，這些方法結(jié)果可靠，可滿足一般檢測。但這些方法樣品前處理較為繁瑣，需要操作人員有較高的專業(yè)性知識(shí)，且儀器價(jià)格較為昂貴[13-15]。因此，迫切需要建立一種靈敏性高、操作簡單易學(xué)、結(jié)果可靠的檢測手段。

生物條形碼檢測技術(shù)是近年興起的一種快速檢測新技術(shù)，其原理是指通過化學(xué)、靜電耦合等方式首先將相同序列的DNA 條形碼耦連在納米金顆粒表面，其次將檢測抗原耦連在磁性微球表面，以形成“納米金探針－目標(biāo)物－磁性探針”的三明治結(jié)構(gòu)，檢測其條形DNA 碼含量，以此實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測殘留藥物的方法。該技術(shù)具有操作步驟相對簡便、準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)、不需要大型儀器輔助等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與檢疫、食品衛(wèi)生檢測、環(huán)境監(jiān)測等各個(gè)領(lǐng)域[16-20]。目前，生物條形碼檢測技術(shù)與其他多種技術(shù)相結(jié)合，包括生物芯片印染技術(shù)、酶標(biāo)納米金探針技術(shù)、生物傳感器技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)以及微孔板銀染技術(shù)等。通過與上述技術(shù)相結(jié)合，更加提高了生物條形碼技術(shù)的靈敏性和準(zhǔn)確度。

本研究采用生物條形碼技術(shù)與微孔板銀染技術(shù)相結(jié)合的方法，首先將DNA 鏈與環(huán)丙沙星多克隆抗體標(biāo)記于納米金顆粒表面制備納米金探針，其次將環(huán)丙沙星單克隆抗體標(biāo)記于磁性微珠表面制備磁性探針；然后制備三明治結(jié)構(gòu)，獲取DNA 鏈，建立一種使用酶標(biāo)儀快速檢測CPFX 殘留的方法。為CPFX 藥物殘留的定量定性檢測研究開拓思路，對保障我國動(dòng)物源性食品質(zhì)量安全具有重大的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；納米金：上海金標(biāo)生物科技有限公司；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：美國Sigma 公司；環(huán)丙沙星單克隆抗體：MedChemExpress 試劑公司；羧基化的磁珠：海貍生物有限公司；銀染增強(qiáng)液（A 液、B 液）、雜交緩沖液：瑞士羅氏公司；DNA 鏈：生工生物工程（上海）股份有限公司；環(huán)丙沙星多克隆抗體：河北北方學(xué)院河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（LE225D）：北京賽多利斯儀器系列有限公司；恒溫磁力攪拌器（JB-2 型）：上海雷磁新經(jīng)儀器有限公司；離心機(jī)（TGL-16A）：金壇市儀都儀器有限公司；紫外-可見分光光度計(jì)（Lambda365）：鉑金埃爾默儀器有限公司；透射電子顯微鏡（7650）：日本日立公司。

1.3 寡核苷酸鏈的設(shè)計(jì)與合成

試驗(yàn)用DNA 鏈如表1 所示。

表1 試驗(yàn)用DNA 鏈Table 1 DNA chain for test

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 納米金探針的制備

首先取1mL 納米金溶液，通過加入濃度為0.25mol/L K2CO3將其pH 值調(diào)節(jié)為9.0；然后將1.2 μg/mL 的環(huán)丙沙星多克隆抗體加入到上述納米金溶液中，在室溫條件下，充分振蕩孵育1 h；而后加入穩(wěn)定劑（5%BSA），以防止膠體金顆粒和抗體發(fā)生聚集和沉淀。

將寡核苷酸A 鏈（0.5 OD/mL）加入上述已制備完成的混合液中，室溫靜置48 h，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）調(diào)節(jié)pH 值至7.0，然后離心15 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min；最后加入寡核苷酸D 鏈（0.5 OD/mL），室溫雜交8 h，離心20 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min 即得到納米金復(fù)合探針，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 納米金探針的鑒定

1.4.2.1 可見光光譜法鑒定納米金探針

使用紫外-可見分光光度計(jì)，波長選擇在400～700 nm 之間，對納米金探針溶液進(jìn)行掃描，得到納米金探針的可見光吸收光譜，觀察其波形是否為光滑曲線，是否有最大吸收峰，以此確定納米金探針是否制備成功。

1.4.2.2 透射電鏡法鑒定納米金探針

在鑒定前對納米金探針溶液進(jìn)行15 min 超聲處理，目的是分離樣品，防止樣品發(fā)生團(tuán)聚。先將少量納米金探針溶液滴于承載樣品的銅網(wǎng)上，然后用濾紙吸收多余試劑，在室溫條件下干燥30 min，放置于透射電鏡下觀察其形狀及分布情況，進(jìn)一步鑒定納米金探針是否制備成功。

1.4.3 磁性探針的制備

1.4.3.1 磁性顆粒的活化

取5 mL 磁珠放入含有45 mL PBS 的離心管中充分振蕩混勻，然后放置于磁力架上磁性分離，棄去上清溶液；為保證完全去除保護(hù)磁珠的活化液，用PBS緩沖液沖洗磁珠4 次；加入5%戊二醛溶液30 mL，放入振蕩器中振蕩3 h，振蕩完成后重復(fù)上述步驟1 次；最后將磁珠混勻于20 mL 的含吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液中，于4 ℃保存。

1.4.3.2 磁性顆粒與CPFX 單克隆抗體結(jié)合

完成1.4.3.1 步驟后，將10 μL 濃度為2 μg/mL 的CPFX 單抗加入到磁珠溶液中，振蕩反應(yīng)24 h，放置于磁力架上磁性分離，棄去上清液；加入40 mL PBS 緩沖溶液和20 mL 甘氨酸溶液先后與分離后的磁珠混勻，振蕩反應(yīng)30 min，重復(fù)進(jìn)行磁性分離，棄去上清液，用PBS 緩沖溶液重復(fù)清洗3 次，完成清洗后加入45 mL PBST 溶液置于4 ℃條件下保存。

1.4.4 磁性探針的鑒定

磁性探針的鑒定選用透射電鏡法，先將少量磁性探針溶液滴于承載樣品的銅網(wǎng)上，然后用濾紙吸收多余試劑，在室溫條件下干燥30 min，放置于透射電子顯微鏡下觀察其形狀與分散情況，以此鑒定磁性探針是否制備成功。

1.4.5 檢測探針的制備

將寡核苷酸C 鏈用TE 緩沖液溶解，再按照1∶300的體積比與三（2-羧乙基）膦溶液混合，二者充分混勻12 h。然后將上述溶液加入到制備好的納米金溶液中混合均勻，室溫放置20 h。在此過程中，分6 次加入4 mL NaCl 溶液（0.2 mol/L），老化40 h。在4 ℃條件下以10 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心30 min，棄去上清液，最后加入1 mL 的磷酸鹽緩沖液（濃度為10 mmol/L）混勻，所得到檢測探針4 ℃保存。

1.4.6 檢測探針的鑒定

1.4.6.1 可見光光譜法鑒定檢測探針

參照1.4.2.1 的方法對檢測探針溶液進(jìn)行掃描鑒定，得到檢測探針的可見光吸收光譜，觀察吸收光譜是否為光滑曲線，并且有最大吸收峰值，以此鑒定其是否制備成功。

1.4.6.2 透射電鏡法鑒定檢測探針

在鑒定前對檢測探針溶液進(jìn)行10 min 超聲處理，參照1.4.2.2 的方法對檢測探針溶液進(jìn)行觀察，鑒定其是否制備成功。

1.4.7 競爭免疫體系的建立

在室溫條件下，將待檢樣品（CPFX 標(biāo)準(zhǔn)品）0.01 mmol/L 加入到磁性探針溶液中，振蕩反應(yīng)1 h，使其充分雜交融合。振蕩完成后，置于磁力架上磁性分離，用PBS 溶液清洗3～4 次，去除未結(jié)合上的待檢樣品。分離完成后加入納米金復(fù)合探針溶液，使其三者形成一個(gè)夾心結(jié)構(gòu)，振蕩反應(yīng)45 min；同樣進(jìn)行磁性分離和PBS 緩沖溶液清洗步驟4～5 次，除去未結(jié)合成功的探針。在上述制備完成的溶液中加入無菌水，在60 ℃的條件下，充分振蕩反應(yīng)1 h，置于磁力架上分離，收集上清液，此時(shí)該上清液中含有生物條形碼。

1.4.8 基于生物素-親合素系統(tǒng)酶標(biāo)板雜交體系的建立

取25 μL 1.4.7 中制備完成的溶液，向其中加入2 μL生物素探針溶液和25 μL 羅氏雜交緩沖液，于室溫條件下混合均勻，充分反應(yīng)15 min；再向其中加入5 μL檢測探針溶液繼續(xù)反應(yīng)15 min；反應(yīng)完成后將上述所得溶液加入到已預(yù)先包被好鏈霉親和素的酶標(biāo)板中，25 ℃條件下，孵育1 h；孵育完成后用含吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗板工作，共3 次；將50 μL 銀染增強(qiáng)A 液和B 液迅速混勻后加入酶標(biāo)板內(nèi)，置于避光環(huán)境下反應(yīng)一段時(shí)間，放入超純水中終止銀染反應(yīng)，完成終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀記錄各孔在630 nm 處的吸光度。

1.4.9 優(yōu)化微孔板內(nèi)的雜交體系

1.4.9.1 優(yōu)化包被濃度

建立微孔板內(nèi)的雜交體系中關(guān)鍵步驟為鏈霉親和素的包被濃度，依次選擇0、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/kg 5 個(gè)濃度值，按照1.4.8 中的步驟，測定各孔在630 nm處的吸光度，從中選出鏈霉親和素的最佳包被濃度。

1.4.9.2 優(yōu)化檢測探針濃度

檢測探針濃度的優(yōu)化有利于提高檢測技術(shù)的靈敏度，依次選擇0、30、60、90、120 nmol/L 5 個(gè)濃度值，按照1.4.8 中的步驟，測定各孔在630 nm 處的吸光度，從中選出檢測探針的最佳濃度。

1.4.9.3 優(yōu)化生物素探針濃度

若生物素探針濃度過高可能會(huì)抑制檢測技術(shù)的靈敏度，濃度過低而會(huì)使雜交體系反應(yīng)不充分。因此依次選擇0、25、50、75、100、125、150 nmol/L 7 個(gè)濃度值，按照1.4.8 中的步驟，測定各孔在630 nm 處的吸光度，從中選出生物素探針的最佳濃度。

1.4.9.4 優(yōu)化銀染時(shí)間

若銀染反應(yīng)時(shí)間過長則會(huì)導(dǎo)致陰離子產(chǎn)生聚集現(xiàn)象，反應(yīng)時(shí)間過短則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不充分。因此依次選擇0、2、4、6、8 min 5 個(gè)不同的銀染時(shí)間，按照1.4.8中的步驟，測定各孔在630 nm 處的吸光度，從中選出最佳的銀染時(shí)間。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2019 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與繪圖，WPS 2020 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米金探針的鑒定結(jié)果

2.1.1 納米金探針的可見光光譜鑒定結(jié)果納米金探針可見光譜如圖1 所示。

圖1 納米金探針可見光譜圖Fig.1 Visible spectrum of nano-gold probe

以波長為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)，測試試驗(yàn)所得納米金探針溶液，得到一條光滑曲線，具有明顯的吸收峰，最大吸收峰λ 位于528 nm 附近，其對應(yīng)的吸光度為0.952 9。根據(jù)杜鵬飛[18]對納米金探針的研究，初步證明納米金探針制備成功。

2.1.2 納米金探針的透射電鏡鑒定結(jié)果

納米金探針的透射電鏡鑒定結(jié)果如圖2 所示。

圖2 納米金探針透射電鏡圖Fig.2 Transmission electron microscope of nano-gold probe

由圖2 可知，多克隆抗體與DNA 鏈標(biāo)記在粒徑為15 nm 的納米金顆粒上，納米金探針分散比較均勻，并且納米金顆粒周圍有明顯的灰黑色暈環(huán)，表明納米金顆粒、多克隆抗體及DNA 鏈標(biāo)記較為成功。

2.2 磁性探針的鑒定結(jié)果

磁性探針的透射電鏡鑒定結(jié)果如圖3 所示。

圖3 磁性探針透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscope of magnetic probe

如圖3 所示，將CPFX 單克隆抗體與粒徑大小為2.8 μm 的磁性顆粒修飾完成后，其磁性探針在顆粒外圍形成一圈清楚的光暈，這表明外圍有一層低電子密度的物質(zhì)包圍在磁性顆粒表面；從圖中可以看出修飾后的磁性顆粒分散較均勻，表明磁性探針制備成功。

2.3 檢測探針的鑒定結(jié)果

2.3.1 檢測探針的可見光光譜法鑒定結(jié)果

檢測探針的可見光光譜法鑒定結(jié)果如圖4 所示。

圖4 檢測探針可見光譜圖Fig.4 Visible spectrum of detection probe

在波長400～700 nm 下，對檢測探針溶液進(jìn)行檢測，以波長為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，得光滑曲線（圖4），具有明顯吸收峰，最大吸收峰λ 位于524 nm附近，其對應(yīng)的吸光度為0.762 2，初步證明納米金探針制備成功。

2.3.2 檢測探針的透射電鏡鑒定結(jié)果

檢測探針的透射電鏡鑒定結(jié)果如圖5 所示。

圖5 檢測探針透射電鏡圖Fig.5 Transmission electron microscope of detection probe

由圖5 可以看出檢測探針分布均勻、顆粒大小一致且顆粒與顆粒之間沒有出現(xiàn)重疊在一起的現(xiàn)象，與杜鵬飛[18]的研究成果較為匹配，證明檢測探針制備成功。

2.4 測定CPFX 的標(biāo)準(zhǔn)曲線

CPFX 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6 所示。

圖6 環(huán)丙沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of ciprofloxacin

標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)選用環(huán)丙沙星濃度的對數(shù)值，縱坐標(biāo)選用抑制率的倒數(shù)，由圖6 可知，環(huán)丙沙星濃度的對數(shù)值與抑制率的倒數(shù)呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為y=-2.372 6x+5.709 8，R2=0.994 1，根據(jù)所得方程計(jì)算，取抑制率I 為1.5 時(shí)為最低檢出限，則環(huán)丙沙星濃度為2.13 ng/mL。結(jié)果顯示，應(yīng)用微孔板銀染的生物條形碼檢測方法具有超高的靈敏度與準(zhǔn)確性。

2.5 優(yōu)化微孔板內(nèi)的雜交體系

2.5.1 包被濃度優(yōu)化結(jié)果

鏈霉親和素包被濃度優(yōu)化結(jié)果如圖7 所示。

圖7 鏈霉親和素包被濃度的優(yōu)化Fig.7 Optimization of streptavidin coating concentration

包被鏈霉親和素作為建立雜交體系的基礎(chǔ)，其濃度的選擇至關(guān)重要。由圖7 所知，包被濃度達(dá)到0.10 mg/kg后，吸光度值變化趨近于平緩，為保證雜交體系的建立，鏈霉親和素的最佳包被濃度為0.15 mg/kg。

2.5.2 檢測探針濃度優(yōu)化結(jié)果

檢測探針濃度的優(yōu)化結(jié)果如圖8 所示。

圖8 檢測探針濃度的優(yōu)化Fig.8 Optimization of detection probe concentration

由圖8 可知，當(dāng)檢測探針濃度達(dá)到90 nmol/L 后，吸光度值后續(xù)變化幅度變小，為優(yōu)化藥品用量，檢測探針的濃度確定為90 nmol/L。

2.5.3 生物素探針濃度優(yōu)化結(jié)果

生物素探針濃度優(yōu)化結(jié)果如圖9 所示。

圖9 生物素探針濃度的優(yōu)化Fig.9 Optimization of biotin probe concentration

生物素探針作為構(gòu)成三明治結(jié)構(gòu)的一部分，其濃度的確定尤為重要。由圖9 可知，當(dāng)生物素探針濃度達(dá)到125 nmol/L 后，吸光度值變化緩慢，為優(yōu)化生物素探針濃度，因此生物素探針最適濃度確定為125 nmol/L。

2.5.4 銀染時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

銀染時(shí)間優(yōu)化結(jié)果如圖10 所示。

圖10 銀染時(shí)間的優(yōu)化Fig.10 Optimization of silver dyeing time

銀染反應(yīng)作為測定步驟前的最后一步，反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化也是關(guān)鍵因素。由圖10 可知，當(dāng)銀染時(shí)間達(dá)到6 min 后，吸光度值變化緩慢，因此最佳銀染時(shí)間確定為6 min。

2.6 常見方法結(jié)果對比

環(huán)丙沙星殘留的檢測方法眾多，每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。通過將本試驗(yàn)方法與其他檢測方法進(jìn)行對比，結(jié)果見表2。

表2 常見方法結(jié)果比對Table 2 Comparison of common methods and results

由表2 可知，本研究方法的檢出限較低，并且提高了檢測的準(zhǔn)確度，適合廣泛應(yīng)用于檢測過程中。

3 結(jié)論

生物條形碼檢測技術(shù)靈敏度高于酶聯(lián)免疫吸附法檢測的靈敏度，并且結(jié)合微孔板銀染技術(shù)，能夠?qū)Νh(huán)丙沙星進(jìn)行微量檢測，該技術(shù)具有操作相對簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、并且無需大型儀器輔助等優(yōu)點(diǎn)。

本研究所建立的基于微孔板銀染的生物條形碼檢測技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對環(huán)丙沙星殘留量快速、準(zhǔn)確的檢測，首先通過可見光光譜法、透射電鏡法鑒定3 種探針制備成功，其次建立競爭免疫體系和基于生物素-親合素系統(tǒng)酶標(biāo)板雜交體系，通過測定其吸光度值確定檢出限為2.13 ng/mL，應(yīng)用該方法測得的檢出限要低于酶聯(lián)免疫吸附法測得的檢出限。由表2 可知，該方法的建立為未來檢測小分子物質(zhì)殘留量提供了新思路，也為制備環(huán)丙沙星生物條形碼檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。