益生菌發(fā)酵制備金針菇抑菌肽

王廣慧，魏雅冬，于德涵，張騰霄，王斌

（綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061）

抑菌肽是生物體內(nèi)產(chǎn)生的具有抑菌功能的肽類物質(zhì)。研究顯示，抑菌肽不僅對細菌、真菌、病毒和腫瘤細胞等具有殺傷作用，而且還有抗寄生蟲、加快傷口愈合等生理功能。抑菌肽的抗菌機理無特異性，與抗生素相比，其不易產(chǎn)生耐藥性，且抑菌肽在殺死癌細胞的同時又不對正常細胞產(chǎn)生毒性作用，因此抑菌肽在綠色食品防腐劑、綠色飼料添加劑、治療腫瘤藥物和新型農(nóng)藥的研發(fā)等領(lǐng)域發(fā)展前景廣闊[1-2]。

抑菌肽的制備方法主要有酶解、微生物發(fā)酵、化學(xué)合成和基因工程重組法等。酶解法是以農(nóng)副產(chǎn)品和水產(chǎn)品等為原料工業(yè)化生產(chǎn)抑菌肽最常用的方法，但是使用此法不僅要對原料進行嚴(yán)格預(yù)處理，還需對蛋白水解酶進行篩選，且一些副產(chǎn)物的產(chǎn)生會降低抑菌肽分離純化的效率。化學(xué)合成法中副產(chǎn)物及殘留化合物較多，抑菌肽的分離純化步驟繁瑣，反應(yīng)過程中會有大量有機溶劑的參與，處理不當(dāng)會對環(huán)境造成污染?；蚬こ讨亟M法制備的抑菌肽與天然抑菌肽相比存在差異，因此其抑菌活性與天然抑菌肽有所不同，此外制備過程中產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素不易被排除，表達出的產(chǎn)物包涵體居多。微生物發(fā)酵法是利用微生物生長代謝過程中產(chǎn)生的蛋白酶將基質(zhì)中蛋白水解成小分子活性肽的方法，具有生產(chǎn)工藝簡便、副產(chǎn)物少、易于推廣的優(yōu)點[3-4]。

金針菇（Flammulina velutipes），又名金錢菌、冬菌，屬擔(dān)子菌綱。作為世界四大食用菌之一的金針菇，其子實體內(nèi)不僅含多種礦物質(zhì)、維生素、黃酮類化合物、多糖及膳食纖維等成分[5-8]，而且富含蛋白質(zhì)，是活性肽開發(fā)和生產(chǎn)的極好原料[9-12]，但目前尚未見有關(guān)利用固態(tài)發(fā)酵法制備金針菇抑菌肽的研究，所以本研究嘗試通過益生菌發(fā)酵金針菇制備抑菌肽，以期為金針菇的應(yīng)用研究提供新方向，為金針菇抑菌肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 主要材料

金針菇：市售；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella）：綏化學(xué)院微生物實驗室提供。

1.2 主要試劑

牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（分析純）：北京酷爾化學(xué)科技有限公司；考馬斯亮藍G-250、檸檬酸三銨、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵（均為分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.3 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（LX-100 型）：深圳良誼實驗室儀器有限公司；紫外可見分光光度計（752 型）：上海菁華科技儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器（SHA-B型）：上海新乘儀器設(shè)備有限公司；萬能粉碎機（JR-750A 型）：浙江金華永康市云達機械設(shè)備廠；高速冷凍離心機（TGL-20bR 型）：上海安亭科學(xué)儀器廠；數(shù)顯電熱恒溫培養(yǎng)箱（HPX-9162 MBE 型）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；酸度計（pHS-3C 型）：上海雷磁儀器有限公司；牛津杯（內(nèi)徑6 mm）：上海魯碩實業(yè)有限公司；超濾離心管（截留分子量分別為3 kDa 和10 kDa）：美國Millipore 公司。

2 方法

2.1 抑菌肽產(chǎn)率的測定方法

抑菌肽質(zhì)量的測定采用考馬斯亮藍G-250 染色法，按照文獻[13]中所述步驟進行操作。抑菌肽產(chǎn)率（Y，%）計算公式如下。

式中：m1為抑菌肽質(zhì)量，g；m 為金針菇用量，g。

2.2 抑菌肽抑菌性的檢測

2.2.1 菌懸液的制備

將裝有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的錐形瓶滅菌后分別接入3 種待測菌種，然后放置在水浴恒溫振蕩器中，于37 ℃下以150 r/min 培養(yǎng)約24 h，取菌懸液于600 nm 處測定吸光值，當(dāng)吸光值為0.1 時停止培養(yǎng)，此時菌體濃度約為1×106～1×107CFU/mL[14]。

2.2.2 抑菌試驗

采用抑菌圈法測定金針菇抑菌肽對3 種常見菌種（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌）的抑菌活性。在牛肉膏蛋白胨固體平板上加入0.1 mL 菌懸液并涂布均勻，每個平板上用無菌鑷子放置6 個滅菌后的牛津杯。取經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾的金針菇抑菌肽溶液0.1 mL 加入已編號的牛津杯中，以滴加無菌生理鹽水的牛津杯作為陰性對照。37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h 后觀察統(tǒng)計抑菌圈直徑。

2.3 金針菇抑菌肽的制備及益生菌的篩選

菌種活化：枯草芽孢桿菌的活化方法同2.2.1；釀酒酵母用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基于28 ℃下振搖培養(yǎng)36 h，轉(zhuǎn)速150 r/min；黑曲霉用查氏培養(yǎng)基在恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃下培養(yǎng)5 d，至孢子成熟后用無菌水制成孢子懸液。培養(yǎng)后適當(dāng)稀釋使釀酒酵母菌體濃度和黑曲霉孢子濃度約為1×108CFU/mL（采用血球計數(shù)板直接計數(shù)法計數(shù)）[15]。

稱取3 g 蔗糖和40 g 金針菇粉（由洗凈的金針菇子實體于50 ℃下烘干后用萬能粉碎機粉碎并過80 目篩制得）充分混勻，裝入500 mL 錐形瓶中并加入150 mL蒸餾水，于121 ℃滅菌20 min。待培養(yǎng)基冷卻后將活化好的3 種菌的菌懸液或孢子懸液2 mL 接種至固體培養(yǎng)基中，混合均勻后進行發(fā)酵。其中枯草芽孢桿菌的發(fā)酵溫度設(shè)置為37 ℃，釀酒酵母和黑曲霉菌的發(fā)酵溫度設(shè)置為28 ℃，發(fā)酵時間均為96 h。發(fā)酵過程中每24 h振蕩一次。發(fā)酵完成后加入蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍? 500 r/min離心20 min，取上清液，用pH 沉淀法獲取金針菇抑菌肽。將金針菇抑菌肽沉淀用蒸餾水復(fù)溶后測其抑菌性。篩選出所產(chǎn)抑菌肽的抑菌活性最強的菌種[16-19]。

2.4 沉淀法分離金針菇活性肽最佳pH 值的篩選

當(dāng)發(fā)酵完成后，向發(fā)酵瓶中加入蒸餾水并攪拌均勻，然后離心取上清液，采用酸度計分別在pH3、4、5、6、7、8、9 進行測試（利用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl調(diào)pH 值），分別測定在各pH 值所獲得的金針菇肽沉淀物的抑菌性。篩選出最適合沉淀抑菌肽的pH 值。

2.5 單因素試驗設(shè)計

2.5.1 液料比對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響

稱取40 g 金針菇粉和3 g 蔗糖混勻裝于錐形瓶中，依次按液料比（蒸餾水體積/金針菇粉質(zhì)量）3.25∶1、3.75∶1、4.25∶1、4.75∶1、5.25∶1（mL/g）添加蒸餾水，將培養(yǎng)基在121 ℃滅菌20 min。冷卻后用篩選出的最適菌種接種，置于28 ℃下發(fā)酵96 h。發(fā)酵完成后加入蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍? 500 r/min 離心20 min 后取上清液，用沉淀法在最適pH 值下獲取金針菇抑菌肽，依次測定金針菇抑菌肽產(chǎn)率。

2.5.2 發(fā)酵時間對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響

稱取40 g 金針菇粉和3 g 蔗糖混勻裝于錐形瓶中，液料比為3.75∶1（mL/g），接菌后在28 ℃下分別發(fā)酵24、48、72、96、120 h，之后的處理方法同2.5.1，依次測定金針菇抑菌肽產(chǎn)率。

2.5.3 發(fā)酵溫度對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響

稱取40 g 金針菇粉和3 g 蔗糖混勻裝于錐形瓶中，液料比設(shè)置為3.75∶1（mL/g），將接菌后的培養(yǎng)基分別置于23、28、32、37、40 ℃下培養(yǎng)96 h。依次測定金針菇抑菌肽產(chǎn)率。

2.5.4 金針菇用量對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響

分別稱取10、20、40、60、80 g 金針菇粉和3 g 蔗糖，液料比為3.75∶1（mL/g），將接菌后的培養(yǎng)基置于28 ℃下發(fā)酵96 h。依次測定金針菇抑菌肽產(chǎn)率。

2.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，通過Design-Expert 8.0.6 軟件的Box-Behnken 試驗設(shè)計，進行響應(yīng)面分析，以獲得金針菇抑菌肽的最佳制備條件[20-23]。因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Factors and level arrangement of response surface experiment

2.7 金針菇抑菌肽的分級分離

將在最適發(fā)酵條件下獲得的金針菇抑菌肽用沉淀法分離，然后用蒸餾水復(fù)溶后先經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，再用截留3 kDa 和10 kDa 兩種分子量的超濾離心管進行離心，將金針菇抑菌肽分離成3 個截留分子量區(qū)間，即小于3 kDa、3～10 kDa、大于10 kDa。研究不同分子量肽的抑菌性。

2.8 數(shù)據(jù)處理

每組試驗均重復(fù)3 次，所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行分析處理并制圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 抑菌肽質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

由試驗數(shù)據(jù)繪制的抑菌肽質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

由圖1 可知，得到的線性回歸方程為y=0.007 3x＋0.025 3，R2=0.994 0。

3.2 篩選試驗結(jié)果

發(fā)酵結(jié)束后，在金針菇固體培養(yǎng)基中并未見到釀酒酵母的菌落生長，可見金針菇固體培養(yǎng)基不適合釀酒酵母的生長?？莶菅挎邨U菌可以在金針菇基質(zhì)上正常生長，但發(fā)酵產(chǎn)物在各pH 值沉淀得到的肽均不具有抑菌活性。黑曲霉的篩選數(shù)據(jù)如表2 所示。

表2 黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物在各pH 值所獲得金針菇活性肽的抑菌圈直徑Table 2 Diameter of inhibition zone of Flammulina velutipes active peptides obtained from fermentation products of Aspergillus niger at various pH value mm

由表2 可以看出，黑曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物在pH4 處的沉淀物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌活性，且抑菌圈直徑較大；在pH8 處的沉淀物只對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌有抑菌活性，且抑菌圈直徑較小。因此pH4 為最適合沉淀抑菌肽的pH 值。

3.3 單因素試驗結(jié)果

3.3.1 液料比對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響

不同液料比條件下金針菇抑菌肽產(chǎn)率變化趨勢如圖2 所示。

圖2 液料比對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of bacteriostatic peptides from Flammulina velutipes

由圖2 可知，隨著蒸餾水體積逐漸增大，抑菌肽產(chǎn)率出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。液料比為3.75∶1（mL/g）時，抑菌肽產(chǎn)率最高。這可能是由于固態(tài)發(fā)酵中基質(zhì)的濕潤和致密程度會影響菌體生長和代謝速度，從而影響抑菌肽產(chǎn)率。蒸餾水體積過大，水分含量過高，會導(dǎo)致培養(yǎng)基底部出現(xiàn)結(jié)塊，難以進行氧氣的交換，從而不利于黑曲霉菌絲生長；蒸餾水體積過小，水分含量過低，則會阻礙金針菇中能源物質(zhì)溶解，妨礙基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，也會影響黑曲霉生長，使蛋白酶的產(chǎn)量下降，從而使抑菌肽產(chǎn)率降低[24]。因此選擇液料比3.75∶1（mL/g）進行后續(xù)試驗。

3.3.2 發(fā)酵時間對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響

不同發(fā)酵時間條件下金針菇抑菌肽產(chǎn)率變化趨勢如圖3 所示。

圖3 發(fā)酵時間對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the yield of bacteriostatic peptides from Flammulina velutipes

由圖3 可知，在24 ～96 h 時，隨著發(fā)酵時間延長，抑菌肽產(chǎn)率逐漸升高，在發(fā)酵96 h 時達到最大值，但在此之后，產(chǎn)率呈下降趨勢。這可能是由于黑曲霉在發(fā)酵時間為24 ～96 h 時生長旺盛，蛋白質(zhì)水解酶分泌能力強，從而促進了抑菌肽的積累。而隨著發(fā)酵時間延長，菌體細胞大量繁殖，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)不斷被耗盡，菌體生長逐漸進入衰亡期，造成蛋白質(zhì)水解酶分泌量減少，而另一方面肽逐漸被菌體降解利用，從而使抑菌肽產(chǎn)率下降。因此選擇發(fā)酵時間96 min 進行后續(xù)試驗。

3.3.3 發(fā)酵溫度對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響

不同發(fā)酵溫度下金針菇抑菌肽產(chǎn)率變化趨勢如圖4 所示。

圖4 發(fā)酵溫度對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the yield of bacteriostatic peptides from Flammulina velutipes

由圖4 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，金針菇抑菌肽的產(chǎn)率出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在28 ℃時達到最大值。這是由于溫度適當(dāng)升高會使黑曲霉生長代謝加快，產(chǎn)生的蛋白酶量多且活性強，金針菇抑菌肽的產(chǎn)率提高，但是溫度過高不適宜黑曲霉菌絲的生長，甚至?xí)?dǎo)致菌絲體進入休眠期，不利于發(fā)酵，從而使抑菌肽產(chǎn)率下降[24]。因此選擇發(fā)酵溫度28 ℃進行后續(xù)試驗。

3.3.4 金針菇用量對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響

不同金針菇用量下金針菇抑菌肽產(chǎn)率變化趨勢如圖5 所示。

圖5 金針菇用量對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of the amount of Flammulina velutipes on the yield of bacteriostatic peptides from Flammulina velutipes

由圖5 可以看出，隨著金針菇用量的增加，金針菇抑菌肽的產(chǎn)率呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，在20 g 時達到最大值。這是因為菌種處于對數(shù)期生長時，對氧氣需求量較高，當(dāng)發(fā)酵瓶中金針菇培養(yǎng)基用量過高時，培養(yǎng)瓶內(nèi)氧氣不足繼而造成黑曲霉生長繁殖速率減慢，金針菇抑菌肽產(chǎn)率下降；當(dāng)發(fā)酵瓶中金針菇培養(yǎng)基用量過低時，無法為后續(xù)發(fā)酵過程提供充足營養(yǎng)，造成黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌肽被菌體利用，使抑菌肽產(chǎn)率降低。因此選擇金針菇用量20 g 進行后續(xù)試驗。

3.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進行四因素三水平的Box-Behnken 設(shè)計，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 3 Results of the response surface experiment

方差分析結(jié)果見表4。

表4 方差分析Table 4 ANOVA of regression analysis

表5 3 個分子量區(qū)間內(nèi)肽的抑菌圈直徑Table 5 Diameter of inhibition zone of peptides in three molecular weight ranges mm

利用軟件Design-Expert 8.0.6 進行數(shù)據(jù)分析，進行二次多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程為R=-1 115.343 23＋228.498 89A＋4.768 85B＋32.984 36C＋3.537 93D -0.580 83AB -1.511 11AC -0.041 333AD -0.018 958BC＋7.89583×10-3BD-0.048815CD-17.30533A2-0.011 027B2-0.429 51C2-0.052 889D2。

由表4 可知，模型的P＜0.000 1，表明該回歸方程模型高度顯著，且模型失擬值P=0.098 1＞0.05，不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.955 3，R2Adj=0.910 6，說明模型擬合程度較好，可以用此模型來分析和預(yù)測黑曲霉發(fā)酵制備金針菇抑菌肽的工藝條件。B、AB、A2、B2、C2、D2對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響高度顯著，C、D 的影響極顯著，AC、BD、CD 的影響顯著。

響應(yīng)曲面見圖6～圖11。

圖6 液料比和發(fā)酵時間對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響Fig.6 Effects of liquid-solid ratio and fermentation time on the yield of bacteriostatic peptides from Flammulina velutipes

圖7 液料比和發(fā)酵溫度對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響Fig.7 Effects of liquid-solid ratio and fermentation temperature on the yield of bacteriostatic peptides from Flammulina velutipes

從圖6～圖11 可以看出，圖8 和圖9 中曲面圖的等高線近乎圓形，說明A 與D 間以及B 與C 間交互作用影響不顯著，其余4 個曲面圖中的等高線均為橢圓形，說明圖中兩個因素交互作用影響顯著。又由于等高線通常向影響相對大的因素軸向聚集，綜合表4 的F 值可知，4 個因素的影響程度排序為B＞C＞D＞A。

圖8 液料比和金針菇用量對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響Fig.8 Effects of liquid-solid ratio and the amount of Flammulina velutipes on the yield of bacteriostatic peptides from Flammulina velutipes

圖9 發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響Fig.9 Effects of fermentation time and fermentation temperature on the yield of bacteriostatic peptides from Flammulina velutipes

圖10 發(fā)酵時間和金針菇用量對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響Fig.10 Effects of fermentation time and the amount of Flammulina velutipes on the yield of bacteriostatic peptides from Flammulina velutipes

圖11 發(fā)酵溫度和金針菇用量對金針菇抑菌肽產(chǎn)率的影響Fig.11 Effects of fermentation temperature and the amount of Flammulina velutipes on the yield of bacteriostatic peptides from Flammulina velutipes

預(yù)測此工藝的最優(yōu)條件為液料比3.50∶1（mL/g）、發(fā)酵時間109.59 h、發(fā)酵溫度28.28 ℃、金針菇用量27.21 g。在此條件下預(yù)測金針菇抑菌肽的產(chǎn)率為59.94%。為了試驗操作方便，將條件校正為液料比3.5∶1（mL/g）、發(fā)酵時間109.6 h、發(fā)酵溫度28 ℃、金針菇用量27.21 g。為檢驗該預(yù)測條件的可靠性，進行3 次驗證試驗，得到金針菇抑菌肽的產(chǎn)率為（61.25±1.14）%。實測值與預(yù)測值相差較小，表明所建模型與實際情況高度擬合，此響應(yīng)面法優(yōu)化的黑曲霉發(fā)酵制備金針菇抑菌肽的工藝可靠。

3.5 金針菇抑菌肽分級分離的結(jié)果

3 個截留分子量區(qū)間抑菌肽的抑菌性見表5。

由表5 可知，肽分子量越小，抑菌性越強。截留分子量小于3 kDa 的抑菌肽抑菌活性最強。

4 結(jié)論

本文對益生菌發(fā)酵金針菇基質(zhì)制備抑菌肽的條件進行了優(yōu)化。試驗結(jié)果表明，黑曲霉為最適發(fā)酵菌種；沉淀法分離金針菇抑菌肽的最適pH 值為4；最佳發(fā)酵條件為液料比3.5∶1（mL/g）、發(fā)酵時間109.6 h、發(fā)酵溫度28 ℃、金針菇用量27.21 g，在此條件下得到金針菇抑菌肽的產(chǎn)率為（61.25±1.14）%。此外，本文還對金針菇抑菌肽進行了分級分離和活性比較。結(jié)果表明，截留分子量小于3 kDa 的肽抑菌活性最強。此研究成果將為金針菇抑菌肽的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。在下一步的工作中，將擴大益生菌的篩選范圍，并對沉淀法分離金針菇抑菌肽的pH 值篩選范圍進一步細化，還將對抑菌肽的相對分子質(zhì)量及氨基酸組成做進一步的鑒定和分析。