雪蓮菌富硒條件優(yōu)化及體外抗氧化活性分析

陳珂，韓瑋鈺，袁亞宏，岳田利*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710069）

雪蓮菌（Tibetan kefir grains，TKGs），又稱藏靈菇，是一種天然混菌發(fā)酵系統(tǒng)，通過(guò)大自然長(zhǎng)期馴化，逐步形成由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等多種微生物組成的穩(wěn)定共生的群落，其作為傳統(tǒng)發(fā)酵劑在青海和西藏等地已有幾百年的食用歷史[1]。雪蓮菌生長(zhǎng)形狀無(wú)規(guī)律且不規(guī)則，多數(shù)呈球狀或米粒狀，逐漸生長(zhǎng)為花椰菜狀，顆粒直徑大小從10 mm 到40 mm 不等，顏色從白色到淺黃色，由大約86%的水分和14%的干物質(zhì)組成，干物質(zhì)包括多糖、蛋白質(zhì)、脂肪和灰分，其來(lái)源不同成分含量可能有所不同[2-5]。雪蓮菌的質(zhì)地具有一定的彈性和黏稠感，其黏稠感來(lái)源于胞外多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的天然凝膠基質(zhì)結(jié)構(gòu)[2]。這種凝膠基質(zhì)結(jié)構(gòu)由雪蓮菌中的乳酸菌產(chǎn)生，乳酸菌可以分泌表層蛋白和由葡萄糖、半乳糖通過(guò)糖苷鍵連接的胞外多糖——開菲爾多糖[6]。雪蓮菌化學(xué)成分十分復(fù)雜，具有多種功能活性成分[7]，其發(fā)酵乳也具有多種功能活性，如調(diào)節(jié)腸道菌群、抗氧化、抑制有害菌群生長(zhǎng)等[8]。

硒（Se）是人體必需的微量元素之一，其存在形式主要分為無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒[9]。在自然界中，無(wú)機(jī)硒包括硒酸鹽和亞硒酸鹽，有機(jī)硒以硒氨基酸和硒蛋白為主[10]。硒具有多種重要的生理功能，如抗氧化、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力和調(diào)節(jié)腸道菌群等[11-12]。機(jī)體主要是通過(guò)食物攝取硒元素[13]。飲食硒攝入不足可能會(huì)導(dǎo)致硒缺乏癥，從而引起克山病、大骨節(jié)病等[14]。因此，通過(guò)膳食合理地補(bǔ)充硒元素成為目前的研究熱點(diǎn)，而微生物富硒因其時(shí)間短、效率高、安全可控等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。

大量研究證明，微生物可以將無(wú)機(jī)硒生物轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒或納米硒[15]，相較于無(wú)機(jī)硒，有機(jī)硒和納米硒的生物利用率更高[16]。因此，富硒微生物具有更高效地為機(jī)體補(bǔ)充硒元素的潛力。多種益生菌都可以吸收和轉(zhuǎn)化無(wú)機(jī)硒，如酵母菌、乳酸菌和雙歧桿菌等[17-19]。雪蓮菌作為一種復(fù)雜的混菌基質(zhì)，主要有乳酸菌、酵母菌和醋酸菌，同時(shí)含多種益生菌[20]。基于此特點(diǎn)，雪蓮菌可能具有較好的吸收和轉(zhuǎn)化硒的潛力。本文通過(guò)雪蓮菌富硒條件的優(yōu)化，確定最佳的富硒時(shí)間、富硒溫度、富硒方式和培養(yǎng)條件等，將雪蓮菌與硒有機(jī)結(jié)合，制備出具有較高生物功能活性的富硒雪蓮菌，為雪蓮菌的創(chuàng)新型應(yīng)用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雪蓮菌：本試驗(yàn)所用菌種來(lái)自西藏拉薩農(nóng)戶家中。亞硒酸鈉（分析純）：上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；純牛奶：內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)股份有限公司；濃硝酸、濃鹽酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硼氫化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈉、K3[Fe（CN）6]、氨基水楊酸、無(wú)水乙醇（均為分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）試劑、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]試劑：北京Solarbio 科技公司。

微波消解儀（Multiwave PRO）：奧地利Anton Paar Gmbh 公司；液相-原子熒光光度計(jì)（LC-AFS-8530）：北京海光儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀（VictorX3）：美國(guó)PE 公司；真空冷凍干燥機(jī)（FD5-3）：金西盟科技有限公司；電熱石墨消解儀（BHW-09A45）：上海博通化學(xué)科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

參考文獻(xiàn)[21]將雪蓮菌菌種活化培養(yǎng)。雪蓮菌在4 ℃無(wú)菌牛奶中保藏。菌種活化時(shí)，將保藏的菌種通過(guò)篩網(wǎng)濾出，無(wú)菌純水洗滌數(shù)次，并接種至無(wú)菌純牛奶中，于28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h。

1.2.2 總硒含量測(cè)定

將所測(cè)樣品預(yù)凍后進(jìn)行真空冷凍干燥，完成后記錄樣品質(zhì)量，將樣品置于消解罐中，加入5 mL 濃硝酸，120 ℃預(yù)消解40 min。結(jié)束后向消解罐中加入1 mL濃硝酸和1 mL 體積分?jǐn)?shù)30%過(guò)氧化氫，并將消解罐放入微波消解儀中，設(shè)置程序?yàn)?20 ℃保持1 min，150 ℃保持5 min，180 ℃保持10 min，最后冷卻至60 ℃保持20 min。結(jié)束后將消解罐打開泄壓，移至電熱石墨消解儀中160 ℃趕酸1 h 至消解罐中保留1 mL的液體，冷卻后向消解罐中加入5 mL 體積分?jǐn)?shù)為50%鹽酸進(jìn)行還原，110 ℃還原30 min。將消解罐內(nèi)液體倒入50 mL 容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為40%鹽酸溶液定容至50 mL，必要的進(jìn)行稀釋測(cè)量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的總硒含量（Z，μg/g）。

式中：C1為樣品消解定容稀釋后的溶液濃度，μg/L；T 為樣品測(cè)量前的稀釋倍數(shù)；V 為樣品消解后的定容體積，mL；M1為樣品富硒后生物量，g。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 富硒率的測(cè)定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的總硒含量，再根據(jù)富硒過(guò)程中加入的總硒含量計(jì)算富硒率（X，%）。

式中：C1為樣品消解定容稀釋后的溶液濃度，μg/L；T 為樣品測(cè)量前的稀釋倍數(shù)；V 為樣品消解后的定容體積，mL；S1為富硒培養(yǎng)基中加入的無(wú)機(jī)硒量，μg。

1.2.3.2 生物量及生物量增長(zhǎng)率的測(cè)定

將培養(yǎng)結(jié)束后的富硒雪蓮菌從培養(yǎng)基中濾出，收集菌體并用無(wú)菌純水洗滌數(shù)次，于-20 ℃預(yù)凍3 h，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，結(jié)束后立即進(jìn)行稱量并記錄質(zhì)量，生物增長(zhǎng)率（S，%）計(jì)算公式如下。

式中：M1為樣品富硒后生物量，g；M2為樣品富硒前生物量，g。

1.2.3.3 無(wú)機(jī)硒含量的測(cè)定

向待測(cè)樣品中加入8 mL 50%鹽酸，通過(guò)600 W 功率進(jìn)行超聲45 min，超聲結(jié)束后將樣品放入沸水中，沸水浴30 min。然后通過(guò)8 000 r/min 離心30 min。離心結(jié)束取上清液，取上清液1 mL 進(jìn)行總硒含量測(cè)定，根據(jù)稀釋倍數(shù)和總硒含量標(biāo)曲計(jì)算樣品無(wú)機(jī)硒含量。

1.2.3.4 有機(jī)硒含量的計(jì)算

樣品有機(jī)硒含量（Y，μg）和有機(jī)硒占比（B，%）計(jì)算公式如下。

式中：S1為樣品總硒總量，μg；S2為樣品無(wú)機(jī)硒含量，μg。

1.2.4 菌體透析

菌體透析用于除去富硒雪蓮菌菌體表面附著的無(wú)機(jī)硒。將0.1 g 菌體與10 mL 的無(wú)菌純水混合，置于分子量為100 Da 的透析袋中。將透析樣品放入無(wú)菌純水中靜置透析，每2 h 換一次透析外液，透析48 h 后收集透析袋中的液體和菌體。將液體與菌體于-80 ℃預(yù)凍過(guò)夜，然后真空冷凍干燥后用于下一步試驗(yàn)或測(cè)量。

1.2.5 富硒條件優(yōu)化

1.2.5.1 富硒溫度、富硒時(shí)間、亞硒酸鈉添加時(shí)間

設(shè)定富硒溫度為20、25、28、30、35、37 ℃下富硒24 h，接種量為1%，培養(yǎng)基中的亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為15 μg/mL，培養(yǎng)基體積為15 mL，考察不同富硒溫度對(duì)富硒雪蓮菌總硒含量的影響。

設(shè)定富硒時(shí)間為6、12、24、36、48 h，富硒溫度為28 ℃，接種量為1%，培養(yǎng)基中的亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為15 μg/mL，培養(yǎng)基體積為60 mL?？疾觳煌晃鴷r(shí)間對(duì)富硒雪蓮菌總硒含量的影響。

設(shè)定亞硒酸鈉添加時(shí)間為雪蓮菌接種后、3、6、9、12 h，富硒溫度為28 ℃，接種量為1%，培養(yǎng)基中亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為45 μg/mL，培養(yǎng)基體積為60 mL?？疾觳煌瑏單徕c添加時(shí)間對(duì)富硒雪蓮菌總硒含量的影響。

1.2.5.2 培養(yǎng)方式和富硒方式

分為靜置培養(yǎng)和160 r/min 搖床培養(yǎng)，富硒溫度為28 ℃，接種量為1%，培養(yǎng)基中亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為45 μg/mL，亞硒酸鈉添加時(shí)間為3 h，培養(yǎng)基體積為60 mL?？疾觳煌囵B(yǎng)方式對(duì)富硒雪蓮菌總硒含量、富硒率、生物量及有機(jī)硒占比的影響。

設(shè)定富硒方式分為馴化和非馴化，富硒溫度為28℃，接種量為1%，培養(yǎng)基中亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為45 μg/mL，亞硒酸鈉添加時(shí)間為3 h，培養(yǎng)基體積為60 mL。馴化過(guò)程為梯度富硒馴化，即3 μg/mL 富硒24 h、6 μg/mL富硒24 h、9 μg/mL 富硒24 h、12 μg/mL 富硒24 h、15 μg/mL 富硒24 h。非馴化過(guò)程為菌體在45 μg/mL富硒24 h。

1.2.5.3 富硒底物濃度

初步設(shè)定富硒底物濃度為15、30、45、60、75 μg/mL，富硒溫度為28 ℃，接種量為1%，培養(yǎng)基體積為60 mL。考察不同富硒底物濃度對(duì)富硒雪蓮菌生物量、總硒含量及透析后總硒含量占比的影響。

馴化過(guò)程中設(shè)定馴化富硒質(zhì)量濃度分為兩種梯度，第一種梯度為3、6、9、12、15 μg/mL；第二種梯度為9、18、27、36、45 μg/mL。富硒溫度為28 ℃，接種量為1%，培養(yǎng)基中亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為45 μg/mL，亞硒酸鈉添加時(shí)間為雪蓮菌接種后3 h，培養(yǎng)基體積為60 mL。考察馴化過(guò)程中不同富硒底物濃度對(duì)富硒雪蓮菌總硒含量、富硒率、生物量及有機(jī)硒占比的影響。

1.2.6 抗氧化活性測(cè)定

1.2.6.1 樣品前處理方式

取雪蓮菌和富硒雪蓮菌各0.5 g，向其中加入5 mL蒸餾水，將菌體渦旋10 min，再通過(guò)過(guò)濾收集液體，獲得菌懸液。

1.2.6.2 DPPH 自由基清除率測(cè)定

DPPH 自由基清除率測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[22]并稍作修改。試驗(yàn)所用DPPH 溶液的濃度為0.1 mol/L，用無(wú)水乙醇溶解。每0.1 mL 樣品與0.9 mL DPPH 溶液混合，在室溫下放置在黑暗中60 min，然后使用酶標(biāo)儀在517 nm 處測(cè)量其吸光度。根據(jù)吸光度計(jì)算DPPH 自由基清除率（X1，%），計(jì)算公式如下。

式中：A1為樣品與DPPH 溶液反應(yīng)后吸光度；A2為無(wú)水乙醇與DPPH 溶液混合后吸光度；A3為樣品與無(wú)水乙醇混合后吸光度。

1.2.6.3 ABTS＋自由基清除率測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[23]的方法稍加修改。將7 mm ABTS 水溶液與2.45 mmol/L K2S2O8等體積混合，室溫靜置12 h。12 h 后，用蒸餾水將ABTS 溶液稀釋至734 nm 處的吸光度為0.70±0.02。將0.1 mL 不同濃度的樣品溶液和0.9 mL ABTS 溶液混合。在室溫黑暗條件下反應(yīng)30 min后，于732 nm 處測(cè)量吸光度。ABTS＋自由基清除率（X2，%）計(jì)算公式如下。

式中：A1為樣品與ABTS 溶液反應(yīng)后吸光度；A2為蒸餾水與ABTS 溶液混合后吸光度；A3為樣品與蒸餾水混合后吸光度。

1.2.6.4 羥自由基清除率測(cè)定

按照文獻(xiàn)[24]的方法改進(jìn)后進(jìn)行測(cè)定。取2 mL 樣品與1 mL 9 mmol/L FeSO4和2 mL 8.8 mmol/L H2O2均勻混合，放置10 min 后加入2 mL 9 mmol/L 水楊酸溶液，于37 ℃反應(yīng)30 min，測(cè)510 nm 吸光度。羥自由基清除率（X3，%）計(jì)算公式如下。

式中：A1為樣品反應(yīng)后吸光度；A2為蒸餾水代替樣品混合后吸光度；A3為樣品與蒸餾水代替H2O2混合后吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，方差分析和顯著性分析采用SPSS 18.0，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Duncan's 檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的顯著性，P＜0.05 為顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 總硒含量的測(cè)定

使用原子熒光光譜法測(cè)量硒標(biāo)準(zhǔn)溶液的總硒含量，擬合建立硒標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1 所示。

由圖1 可知，硒標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品硒濃度保持在0～20 μg/L 范圍內(nèi)?；貧w方程R2達(dá)到0.999 8，說(shuō)明儀器所測(cè)量的硒濃度和熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系較好，在此線性關(guān)系范圍內(nèi)，可用于樣品總硒含量的測(cè)定。

2.2 富硒溫度、富硒時(shí)間和亞硒酸鈉添加時(shí)間的確定

富硒溫度、富硒時(shí)間和亞硒酸鈉添加時(shí)間對(duì)總硒含量的影響見圖2。

圖2 富硒溫度、富硒時(shí)間和亞硒酸鈉添加時(shí)間對(duì)總硒含量的影響Fig.2 Effects of temperature，time and sodium selenite addition time on total selenium content

由圖2A 可知，隨富硒溫度的升高，富硒雪蓮菌的總硒含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在28 ℃時(shí)總硒含量顯著高于其他溫度。這可能與雪蓮菌中微生物的活性有關(guān)，當(dāng)微生物處于適宜生存環(huán)境中，其活力較高，因此對(duì)硒轉(zhuǎn)化的效率最高，從而使得富硒雪蓮菌總硒含量較高，28 ℃即為雪蓮菌的最適生存溫度，當(dāng)富硒溫度低于或高于28 ℃時(shí)，微生物活性較低，從而出現(xiàn)了隨著富硒溫度升高，富硒雪蓮菌的總硒含量先上升后下降的現(xiàn)象。在富硒過(guò)程中，富硒時(shí)間的把控至關(guān)重要。由圖2B 可知，隨著富硒時(shí)間的延長(zhǎng)，富硒雪蓮菌的總硒含量呈現(xiàn)逐漸上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。富硒時(shí)間達(dá)到24 h 后，總硒含量并無(wú)顯著上升趨勢(shì)。這說(shuō)明在整個(gè)富硒過(guò)程中，雪蓮菌在對(duì)培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)硒進(jìn)行吸收與轉(zhuǎn)化，靜置培養(yǎng)使得雪蓮菌只接觸到底層培養(yǎng)基，在富硒24 h 時(shí)，雪蓮菌已對(duì)其周圍培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)硒進(jìn)行充分地吸收與轉(zhuǎn)化。研究表明，亞硒酸鈉添加時(shí)間對(duì)菌體富硒效果有一定的影響[25]。如圖2C所示，在雪蓮菌接種后3 h 時(shí)，添加亞硒酸鈉的富硒效果最好，樣品總硒含量顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)。這可能是因?yàn)榇藭r(shí)雪蓮菌內(nèi)部的菌群正處于活性最佳狀態(tài)，對(duì)培養(yǎng)基內(nèi)環(huán)境的改變比較敏感，能積極吸收和轉(zhuǎn)化無(wú)機(jī)硒。因此，選擇富硒溫度為28 ℃，在接種后3 h 添加亞硒酸鈉并富硒24 h 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 富硒底物濃度優(yōu)化結(jié)果

培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的濃度會(huì)極大影響富硒雪蓮菌的總硒含量。底物濃度對(duì)總硒含量、透析后總硒含量占比和生物量的影響見圖3。

圖3 富硒底物濃度對(duì)總硒含量、透析后總硒含量和生物量的影響Fig.3 Effects of substrate concentration on the total selenium content，the total selenium content after dialysis，and biomass

由圖3A 可知，培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的濃度越高，富硒雪蓮菌的總硒含量越高，可見雪蓮菌對(duì)亞硒酸鈉有很強(qiáng)的吸收和吸附能力。通過(guò)將富硒樣品進(jìn)行透析，將樣品表面吸附的無(wú)機(jī)硒除去，發(fā)現(xiàn)透析后樣品的總硒含量占原樣品的總硒含量的比例隨富硒底物濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。這可能是雪蓮菌菌體自身結(jié)構(gòu)導(dǎo)致。富硒底物濃度太高時(shí)，雪蓮菌將大量無(wú)機(jī)硒吸附在菌體表面，而并非吸收進(jìn)菌體內(nèi)部。雪蓮菌是多糖-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)組成的一種具有黏彈性的基質(zhì)，微生物則嵌在基質(zhì)表面或內(nèi)部。而一些生物大分子，即多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)可以吸附和包裹無(wú)機(jī)硒和硒納米顆粒[26]。當(dāng)雪蓮菌接觸到無(wú)機(jī)硒時(shí)，多糖-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)基質(zhì)首先充分包裹和結(jié)合無(wú)機(jī)硒，再由微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。因此，亞硒酸鈉濃度較低時(shí)，無(wú)法使微生物充分吸收和接觸無(wú)機(jī)硒，從而限制其發(fā)揮轉(zhuǎn)化的作用；而隨著富硒底物濃度的升高，在富硒底物濃度為45 μg/mL 時(shí)，微生物充分發(fā)揮其吸收和轉(zhuǎn)化有機(jī)硒的作用；當(dāng)富硒濃度再升高，雪蓮菌更多是吸附無(wú)機(jī)硒，也可能將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為單質(zhì)硒而不是有機(jī)硒。

由圖3B 可知，隨著富硒底物濃度的增加，富硒雪蓮菌的生物量呈先升高后下降的趨勢(shì)。富硒濃度升高過(guò)程中，促進(jìn)了雪蓮菌的生長(zhǎng)，而在濃度過(guò)高時(shí)，則抑制雪蓮菌的生長(zhǎng)。為確保富硒雪蓮菌的具有較高有機(jī)硒含量和菌活性，選擇富硒底物濃度為45 μg/mL。

2.4 富硒培養(yǎng)方式的確定

在傳統(tǒng)制作工藝中，雪蓮菌發(fā)酵一直通過(guò)靜置發(fā)酵進(jìn)行培養(yǎng)，微生物無(wú)法充分與培養(yǎng)基進(jìn)行接觸，菌活性會(huì)受限。因此本研究對(duì)比靜置發(fā)酵與搖床培養(yǎng)對(duì)總硒含量、富硒率、生物量和有機(jī)硒占比的影響，結(jié)果見表1。

表1 培養(yǎng)方式對(duì)總硒含量、富硒率、生物量和有機(jī)硒占比的影響Table 1 Effects of culture method on total selenium content，selenium enrichment rate，biomass，and organic selenium percentage

由表1 可知，搖床富硒的樣品總硒含量和富硒率顯著較高。通過(guò)搖床培養(yǎng)，菌體得以充分接觸培養(yǎng)基，使得生物量顯著高于靜置培養(yǎng)條件下的富硒雪蓮菌。而培養(yǎng)方式對(duì)富硒樣品中有機(jī)硒占比沒有影響，還需要通過(guò)其他優(yōu)化方式改善。

2.5 富硒方式的確定

有研究表明，定向馴化富硒可以提升硒耐受能力和富硒能力，提高有機(jī)硒含量[27]。為提升富硒雪蓮菌的有機(jī)硒含量，本研究通過(guò)梯度馴化雪蓮菌富硒，富硒方式對(duì)總硒含量、富硒率、生物量和有機(jī)硒占比的影響見表2。

表2 富硒方式對(duì)總硒含量、富硒率、生物量和有機(jī)硒占比的影響Table 2 Effects of selenium enrichment methods on total selenium content，selenium enrichment rate，biomass，and organic selenium percentage

由表2 可知，富硒馴化使雪蓮菌的生物量、富硒率和有機(jī)硒占比得到了極顯著的提高，由于其生物量的顯著提高，根據(jù)其生物量所得的總硒含量則會(huì)有一定程度的下降。結(jié)果表明，馴化富硒是一種有效提高菌體對(duì)硒耐受能力、富硒能力和硒轉(zhuǎn)化效率的方法，此方法可以讓雪蓮菌慢慢接受含硒培養(yǎng)基的生存環(huán)境，并主動(dòng)吸收和轉(zhuǎn)化無(wú)機(jī)硒，顯著提升富硒雪蓮菌有機(jī)硒占比。

2.6 馴化過(guò)程中富硒底物濃度的確定

馴化過(guò)程中富硒底物濃度對(duì)總硒含量、富硒率、生物量和有機(jī)硒占比的影響見表3。

表3 馴化過(guò)程中富硒底物濃度對(duì)總硒含量、富硒率、生物量和有機(jī)硒占比的影響Table 3 Effects of substrate concentration during domestication on total selenium content，selenium enrichment rate，biomass，and organic selenium percentage

由表3 可知，提高富硒馴化濃度梯度對(duì)其生物量的增長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制效果，其富硒率和有機(jī)硒占比都顯著降低。試驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度梯度中，18 μg/mL 的富硒濃度時(shí)菌體就出現(xiàn)了紅色，而在低濃度梯度中并未出現(xiàn)紅色。以上結(jié)果可知，提高富硒馴化濃度梯度，會(huì)抑制整體富硒效果，高濃度梯度富硒不僅會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，降低富硒率，還會(huì)使菌體產(chǎn)生大量單質(zhì)硒，使有機(jī)硒占比顯著降低。因此確定富硒馴化濃度底物為3、6、9、12、15 μg/mL。

2.7 富硒雪蓮菌優(yōu)化后的基本參數(shù)

通過(guò)富硒條件優(yōu)化，確定富硒雪蓮菌制備的條件：富硒溫度為28 ℃、富硒時(shí)間為24 h、亞硒酸鈉添加時(shí)間為雪蓮菌接種后3 h，通過(guò)160 r/min 搖床培養(yǎng)，以3、6 、9、12、15 μg/mL 梯度馴化富硒。由此得到的富硒雪蓮菌的基本參數(shù)，見表4。

表4 富硒雪蓮菌基本參數(shù)Table 4 Basic parameters of selenium-enriched Tibetan kefir grains

2.8 抗氧化能力分析

硒和雪蓮菌均具有一定的抗氧化活性[28-29]，富硒雪蓮菌的抗氧化能力測(cè)定結(jié)果見圖4。

圖4 抗氧化能力Fig.4 Antioxidant capacity

如圖4 所示，富硒雪蓮菌的抗氧化活性顯著高于雪蓮菌。富硒后的雪蓮菌抗氧化活性較高可能是菌體本身的抗氧化活性與硒結(jié)合的結(jié)果。經(jīng)過(guò)微生物將硒進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化后，有機(jī)形式的硒的抗氧化活性更高[30]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)雪蓮菌對(duì)無(wú)機(jī)硒進(jìn)行吸收和轉(zhuǎn)化，最終確定了富硒條件為富硒溫度為28 ℃，富硒時(shí)間為24 h，亞硒酸鈉添加時(shí)間為雪蓮菌接種后3 h，通過(guò)160 r/min搖床培養(yǎng)，以3、6、9、12、15 μg/mL 梯度馴化富硒。富硒雪蓮菌的菌活性、富硒率、有機(jī)硒增長(zhǎng)比提高。優(yōu)化后的富硒雪蓮菌，總硒含量為（2 194.41±58.49）μg/g，生物量增長(zhǎng)率為（262.22±34.59）%，富硒率（35.47±0.78）%，有機(jī)硒占比（84.57±1.45）%。同時(shí)富硒雪蓮菌的抗氧化活性顯著高于雪蓮菌，達(dá)到了硒和雪蓮菌有機(jī)結(jié)合的效果。制備所得的富硒雪蓮菌具有更高的抗氧化活性，可進(jìn)一步提升雪蓮菌的開發(fā)利用價(jià)值，對(duì)擴(kuò)展雪蓮菌的實(shí)際應(yīng)用和創(chuàng)新研究具有重要意義。