不同劑量EGCG 改善代謝綜合征的效果及其機(jī)制

馬慧，王津，額日赫木，魏嘉宇，王碩*

（1. 山西師范大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030031；2. 南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院 天津市食品科學(xué)與健康重點實驗室，天津 300350）

代謝綜合征表現(xiàn)為肥胖、高血壓、血脂異常、胰島素抵抗和高血糖中至少3 個以上特征，其發(fā)生會增加個體罹患2 型糖尿病和心血管疾病的風(fēng)險[1-2]。由于代謝綜合征病理的復(fù)雜性，很難設(shè)計一種有效預(yù)防或延緩代謝綜合征的特效藥，通常采用靶向一種病癥的單一藥物或靶向多種病癥的藥物組合進(jìn)行治療，這些藥物包括他汀類藥物和降血糖藥物等[3]。近年來，食用和藥用植物及其生物活性成分由于無毒或低毒的特點，在慢性病的預(yù)防和控制中受到越來越多的關(guān)注，大量研究表明，許多食用和藥用植物或其活性成分如多酚、多糖等可以抵抗肥胖或代謝綜合征[4]。

綠茶作為一種健康飲品歷史悠久，深受世界各地人們的喜愛，對人體健康有益，可以改善代謝綜合征、降低某些慢性疾病的風(fēng)險，如糖尿病、非酒精性脂肪肝和心血管疾病等[5-6]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG） 是綠茶多酚中含量最豐富的兒茶素，也是最具生物活性的成分，占綠茶總兒茶素的50%以上[7]。在過去的幾十年中，EGCG 對健康的有益作用已被廣泛報道，大量的細(xì)胞實驗、動物實驗和人群干預(yù)實驗都顯示出EGCG 可以減輕體重、緩解代謝綜合征、預(yù)防糖尿病及心血管疾病等[8-10]，例如，在高脂飲食條件（脂肪供能占比為60%）下，與未經(jīng)EGCG 處理的小鼠相比，經(jīng)過16 周EGCG 干預(yù)（在飲食中含量為0.32%）小鼠的體質(zhì)量、體脂和內(nèi)臟脂肪的質(zhì)量顯著降低[11]，這些結(jié)果也在另外一項采用高脂/西式飲食喂養(yǎng)小鼠的研究中重現(xiàn)[12]。Sheng 等[13]指出EGCG 可能會激活肝臟法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR），而使腸道FXR 失活，這可能會對肥胖產(chǎn)生有益影響。此外，EGCG 對膽汁酸受體（takeda G protein-coupled receptor，TGR5） 的激活可以增加血清中酪酪肽（peotideYY，PYY） 和胰高糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）的水平，這可能有助于提高胰島素敏感性。在基因缺陷糖尿病模型db/db小鼠中，通過飲食補(bǔ)充EGCG（在飲食中含量為1%）可預(yù)防葡萄糖不耐受，并減少病變胰島細(xì)胞的數(shù)量[14]。

然而，不同劑量EGCG 對代謝的影響及其作用機(jī)制尚不清楚。Yang 等[15]指出EGCG 的代謝調(diào)節(jié)作用涉及2 個主要機(jī)制，包括直接機(jī)制和間接機(jī)制。直接機(jī)制直接作用于消化器官，如阻止吸收、抑制消化酶和改變微生物群，而間接機(jī)制則通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)和包括肝臟、肌肉和脂肪組織在內(nèi)的各種組織的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來介導(dǎo)[16]。但很少有研究關(guān)注其劑量效應(yīng)，Bitzer 等[17]在用不同劑量EGCG 干預(yù)高脂飲食小鼠肥胖時發(fā)現(xiàn)高劑量EGCG 雖然也可以達(dá)到減肥效果，但是通過測量腸氧化應(yīng)激指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)隨著劑量的增加，腸道氧化應(yīng)激水平并沒有下降趨勢，并隨著EGCG濃度增加，氧化應(yīng)激水平反而升高，表明高濃度EGCG可能具有一定的副作用。因此迫切需要引起對其劑量效應(yīng)的關(guān)注。

本文根據(jù)EGCG 在茶多酚中所占比例，以C57BL/6J 小鼠為研究對象，構(gòu)建高脂小鼠模型，探究不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠體質(zhì)量和血清生理生化指標(biāo)的影響，從腸道脂質(zhì)吸收方面對EGCG 降脂機(jī)制進(jìn)行研究，并測定不同劑量EGCG 對腸氧化應(yīng)激水平的影響，旨在為指導(dǎo)EGCG 在代謝綜合征中的應(yīng)用并降低其可能的副作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60 只無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠：北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號北京SYXK（京）2017-0033。

1.2 材料與試劑

低脂對照飼料（D12450J，脂肪提供10%能量）、高脂飼料（D12492，脂肪提供60%能量）：江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司；EGCG：上海源葉生物科技有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）測定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）測定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC） 測定試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG） 測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C） 測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；LunaScriptTMSuperMix Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Luna Universal qPCR Master Mix 實時熒光定量PCR 預(yù)混液：美國NEB 有限公司；超純水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；NucleoZOL 試劑：德國MACHEREY-NAGEL 公司；乙醚：天津市化學(xué)試劑六廠。

1.3 儀器與設(shè)備

超微量分光光度計（Nanophotometer N50）：德國Implen 公司；實時熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitativepolymerase chain reaction，qPCR）儀（CFX）：美國BIO-RAD 公司；酶標(biāo)儀（M200pro）：瑞士Tecan 公司；組織破碎儀（TP-24）：杰靈儀器制造（天津）有限公司；數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋（HH-6SC）：常州普天儀器制造有限公司；離心機(jī)（Sorvall ST 16R）：美國Thermo Scientific 公司；高壓滅菌鍋（CL-40M）：日本ALP 株式會社；分析天平（QUINIX224-1CN）：賽多利期科學(xué)儀器（北京）有限公司；羅氏血糖測試儀（Accu-Chek）：羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；基因擴(kuò)增儀（Mastercyclernexus gradient）：德國Eppendorf 公司。

1.4 方法

1.4.1 動物實驗

將60 只6 周齡C57BL/6J 小鼠置于室溫為20～25 ℃、12h 光照/12h 黑暗循環(huán)的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，稱小鼠體質(zhì)量并隨機(jī)分為5 組（每組12 只）：正常飲食對照組（記為NC），高脂飲食模型組（記為HFD）、低劑量EGCG 干預(yù)組（記為EL）、中劑量EGCG 干預(yù)組（記為EM）及高劑量EGCG 干預(yù)組（記為EH）。低、中、高劑量EGCG 灌胃劑量分別為50、100、200 mg/kg bw，連續(xù)灌胃12 周，并每周監(jiān)測體質(zhì)量，所有小鼠均可以自由采食和飲水，飼養(yǎng)于南開大學(xué)實驗動物中心的SPF級動物房，末次灌胃禁食12 h 后，所有實驗動物在實驗前用戊巴比妥鈉（40 mg/kg，1%水溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配）進(jìn)行麻醉以減輕疼痛并采集血液，迅速收集肝臟、附睪脂肪、腎周脂肪、回腸組織，稱量肝臟、附睪脂肪和腎周脂肪的質(zhì)量，所有組織立即在液氮中冷凍，以便后期進(jìn)行分析。所有的動物實驗操作都嚴(yán)格遵守天津市《實驗動物管理條例》的相關(guān)規(guī)定。

1.4.2 血清生化指標(biāo)檢測

ALT、AST、HDL-C、LDL-C、TG、TC 均按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.4.3 葡萄糖耐量測試（oralglucosetolerancetest，OGTT）

在第11 周，將動物過夜禁食10 h，然后灌胃葡萄糖溶液（2.0 g/kg bw）。使用血糖儀從尾靜脈尖端收集血液以進(jìn)行葡萄糖灌胃之前（0 min） 和之后（15、30、60、90、120 min）血糖濃度的測量。

1.4.4 實時熒光定量PCR 檢測

使用TRIzol 試劑從冷凍的回腸組織中提取總RNA，然后用LunaScriptTMSuperMix Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，最后在CFX Connect 實時系統(tǒng)上進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。qPCR 引物由天津擎科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1，其中β-Actin 基因被用作歸一化，通過2-ΔΔCt 法計算每個基因的相對表達(dá)水平。

表1 實時熒光定量PCR 所用的引物序列Table 1 Primers for real-time quantitative PCR

1.4.5 腸氧化應(yīng)激指標(biāo)測定

SOD、GSH 和MDA 均按照相應(yīng)試劑盒說明書要求進(jìn)行測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有測試至少重復(fù)3 次，使用T 檢驗對兩組數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計學(xué)差異進(jìn)行計算，P＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01 為有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.001 為有極其顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行。兩組之間的差異通過雙尾學(xué)生t 檢驗進(jìn)行分析。3 組或更多組之間的差異使用單因素方差分析，并用Student-Newman-Keuls 進(jìn)行事后檢驗分析。當(dāng)比較不同組變化涉及時間變量時，采用雙向重復(fù)測量方差分析，并用Student-Newman-Keuls 進(jìn)行事后檢驗，當(dāng)P＜0.05 時，結(jié)果被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG 對高脂飲食小鼠體質(zhì)量和脂肪質(zhì)量的影響

在為期12 周的干預(yù)過程中，不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠體質(zhì)量和脂肪質(zhì)量的影響見圖1。

圖1 不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠體質(zhì)量和脂肪指數(shù)的影響Fig.1 Effects of different doses of EGCG on the body weight and fat indexes of mice fed with a high-fat diet

由圖1A 可知，在實驗結(jié)束時，與NC 組相比，HFD組小鼠的體質(zhì)量明顯增加。EGCG 干預(yù)可顯著降低高脂飲食引起的體質(zhì)量增加，且隨著劑量的增加，降脂效果逐漸增強(qiáng)，但各劑量組間并無顯著性差異（P＞0.05）。由圖1B、圖1C 可知，相比于NC 組小鼠，HFD 組小鼠的附睪脂肪指數(shù)和腎周脂肪指數(shù)顯著增加（P＜0.05），不同劑量EGCG 均可顯著降低HFD 組小鼠的附睪脂肪指數(shù)和腎周脂肪指數(shù)（P＜0.05）。

2.2 EGCG 對高脂飲食小鼠糖代謝的影響

圖2 為不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠血糖的影響。

圖2 不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠血糖的影響Fig.2 Effects of different doses of EGCG on the hyperglycemia of mice fed with a high-fat diet

高脂飲食造成小鼠糖耐量異常，由圖2A 可知，與HFD 組小鼠相比，低、中、高劑量EGCG 均可明顯降低60 min 時小鼠的血糖水平，從而使其接近NC 組小鼠血糖水平，其中低、中劑量EGCG 效果更佳，通過計算曲線下面積（area under the curve，AUC），結(jié)果同樣顯示EL組和EM 組小鼠葡萄糖耐受水平顯著改善（P＜0.05），而EH 組小鼠與HFD 小鼠之間無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 EGCG 對高脂飲食小鼠脂代謝的影響

圖3 為不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠脂質(zhì)代謝的影響。

圖3 不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠脂質(zhì)代謝的影響Fig.3 Effects of different doses of EGCG on the serum lipid levels of mice fed with a high-fat diet

由圖3 可知，高脂飲食導(dǎo)致小鼠血脂代謝異常，特征表現(xiàn)為HFD 組的TC、TG 和LDL-C 的含量顯著高于其他組別（P＜0.05），所有組的HDL-C 含量均未觀察到顯著差異（P＞0.05）。不同劑量EGCG 均可顯著降低高脂飲食引起的血清TG、TC 和LDL-C 含量的升高（P＜0.05），且各劑量之間無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 EGCG 對高脂飲食小鼠肝功能的影響

圖4 為EGCG 對高脂飲食小鼠肝功能的影響。

圖4 不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠肝功能的影響Fig.4 Effects of different doses of EGCG on the liver function

由圖4A 可知，各組之間肝臟指數(shù)（肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量）均無顯著差異（P＞0.05）。由圖4B 可知，高脂飲食造成小鼠肝臟質(zhì)量顯著高于其他組別（P＜0.05）。不同劑量EGCG 可顯著降低肝臟質(zhì)量，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。由圖4C、圖4D 可知，HFD 組小鼠的ALT 活力顯著高于NC 組（P＜0.05），表明肝功能受到了一定損傷，不同劑量EGCG 干預(yù)可顯著降低血清ALT 活力（P＜0.05），各組間AST 活力無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 EGCG 對腸道脂質(zhì)吸收相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖5 為不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠腸道脂質(zhì)吸收相關(guān)基因表達(dá)的影響。

圖5 不同劑量EGCG 對高脂飲食小鼠腸道脂質(zhì)吸收相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of different doses of EGCG on the expression of genes related to lipid absorption in the ileum of mice fed with a high-fat diet

脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白CD36 和脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白4（FATP4） 以及乳糜微粒的載脂蛋白ApoB48 是3 個影響脂質(zhì)吸收的重要蛋白。由圖5 可知，在基因水平上，與NC 組小鼠相比，高脂飲食引起CD36 和ApoB48 表達(dá)的上調(diào)，不同劑量EGCG 均可顯著下調(diào)CD36 及ApoB48 的表達(dá)水平（P＜0.05），中、高劑量EGCG 對CD36的影響程度高于低劑量EGCG，各組之間FATP4 表達(dá)水平無顯著差異（P＞0.05）。

在腸道中高表達(dá)的CD36 蛋白在脂肪酸的攝取過程中發(fā)揮著重要作用[18]，F(xiàn)ATP4 也參與腸道脂肪酸的攝取[19]，在餐后條件下，80%～90%的脂質(zhì)運輸并裝載于含ApoB48 蛋白的乳糜微粒中，乳糜微粒負(fù)責(zé)將外源性食物中的脂肪從小腸攜帶到肝臟[20-21]，在本研究中發(fā)現(xiàn)EGCG 可以降低小腸中CD36 和ApoB48 的基因表達(dá)水平，證明EGCG 可以減少腸道對脂質(zhì)的吸收。綜上，不同劑量的EGCG 可能通過下調(diào)腸道中脂質(zhì)吸收相關(guān)基因的表達(dá)，減少機(jī)體對脂質(zhì)的吸收，從而達(dá)到改善脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)代謝綜合征的效果。

2.6 EGCG 對腸氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

不同劑量EGCG 對腸氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響如表2所示。

表2 不同劑量EGCG 對腸氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Table 2 Effects of different doses of EGCG on oxidative stress indicators in the ileum

由表2 可知，與NC 組小鼠相比，高脂飲食引起腸氧化應(yīng)激水平升高，包括引起SOD 含量和GSH 含量下降，以及MDA 含量的上升。隨著EGCG 劑量的增加，腸道氧化應(yīng)激水平并沒有下降趨勢，并隨著EGCG濃度增加，中、高劑量EGCG 會升高氧化應(yīng)激水平，減少GSH 含量，表明高劑量EGCG 可能具有一定的副作用，這與Bitzer 等[17]的研究結(jié)論相一致。

3 結(jié)論

本研究通過檢測糖脂代謝表觀指標(biāo)以及與腸組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白基因的表達(dá)水平，探究不同劑量EGCG（50、100、200 mg/kg bw）對高脂飲食小鼠脂代謝的效果及機(jī)制研究。結(jié)果表明，與高脂對照組比較，不同劑量EGCG 均可顯著降低小鼠體質(zhì)量，改善脂質(zhì)代謝異常，減輕肝臟損傷，且各劑量之間并無顯著差異，只有低、中劑量EGCG 可改善糖代謝，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)各劑量EGCG 可能通過減少腸道對脂質(zhì)的吸收從而達(dá)到改善代謝綜合征的效果，但中、高劑量EGCG可能具有一定的腸毒性。