血流細(xì)菌性感染診斷的研究進(jìn)展

鄭婭瓊,劉 炎 綜述,劉 磊,何穎雨,劉萬(wàn)兵△ 審校

1.中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院輸血醫(yī)學(xué)科,湖北武漢 430070;2.南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510515

血流感染是指各種病原微生物侵入血液循環(huán)系統(tǒng),在其中生長(zhǎng)、釋放代謝產(chǎn)物和毒素,引起機(jī)體產(chǎn)生全身性炎癥反應(yīng),并進(jìn)一步導(dǎo)致血壓下降、凝血功能障礙、器官功能障礙、休克甚至死亡的嚴(yán)重感染性疾病。目前造成血流感染的病原體主要是細(xì)菌。隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步,深靜脈置管、機(jī)械通氣等侵入性技術(shù)的廣泛應(yīng)用,患者得到救助的同時(shí)也伴隨著血流細(xì)菌性感染的高發(fā)生率,血流細(xì)菌性感染不僅造成醫(yī)療費(fèi)用大量增加,也嚴(yán)重威脅到患者的生命健康。血流細(xì)菌性感染的早期診斷,對(duì)于及時(shí)控制感染、提高患者的生存率尤為重要。因此,尋找快速、準(zhǔn)確的血流細(xì)菌性感染診斷方法成為了醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。血流細(xì)菌性感染診斷按照檢測(cè)對(duì)象可分為針對(duì)病原體的實(shí)驗(yàn)室診斷和針對(duì)感染宿主的實(shí)驗(yàn)室診斷兩大類。

1 針對(duì)病原菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

根據(jù)病原菌的生理特征,科學(xué)家們發(fā)明了多種檢測(cè)手段,如利用病原菌生長(zhǎng)代謝特征發(fā)明了血培養(yǎng)聯(lián)合梅里埃全自動(dòng)微生物分析儀鑒定血流細(xì)菌的常規(guī)檢測(cè)方法,另外根據(jù)細(xì)菌的核酸和蛋白等特征標(biāo)志物發(fā)明多種新型檢測(cè)方法。

1.1血培養(yǎng) 血培養(yǎng)檢測(cè)是診斷血流細(xì)菌性感染的傳統(tǒng)“金標(biāo)準(zhǔn)”,是直接培養(yǎng)擴(kuò)增血液內(nèi)病原體的一種方法,培養(yǎng)陽(yáng)性即可作為血流細(xì)菌感染的直接證據(jù)。血培養(yǎng)雖是血流細(xì)菌性感染的主要診斷依據(jù),但仍存在許多不足:(1)操作要求高,標(biāo)本采集時(shí)可能遭受皮膚或培養(yǎng)器械表面雜菌污染造成假陽(yáng)性的結(jié)果;(2)培養(yǎng)周期較長(zhǎng),血培養(yǎng)加上全自動(dòng)微生物分析儀中的培養(yǎng),通常需要48 h以上,造成診斷和治療的延誤;(3)臨床抗菌藥物的使用、采血時(shí)間選擇錯(cuò)誤及苛養(yǎng)菌難于培養(yǎng)等問(wèn)題均易導(dǎo)致血培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率偏低。血培養(yǎng)由于以上因素影響易造成誤診、漏診和出結(jié)果慢,給血流細(xì)菌性感染診治帶來(lái)了難度。

1.2病原菌核酸檢測(cè) (1)PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù):通過(guò)設(shè)定不同菌種的特定引物測(cè)定16s RNA基因,運(yùn)用PCR或qRT-PCR檢測(cè)血流細(xì)菌性感染。(2)DNA芯片技術(shù):將已知的DNA或RNA片段固定在固相支持物上制成探針,利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,使其與待測(cè)核酸標(biāo)本進(jìn)行雜交,從而獲得所需要的生物信息。TISSARI等[1]運(yùn)用該技術(shù)快速準(zhǔn)確地鑒別出了血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中的菌種。(3)宏基因組下一代測(cè)序(mNGS):即高通量測(cè)序,是一種高靈敏度、高通量的測(cè)序技術(shù),一次可測(cè)得幾百萬(wàn)到幾千萬(wàn)條核酸分子序列,通過(guò)序列的分析比對(duì)進(jìn)行病原體鑒定和分型。2019年,BLAUWKAMP等[2]首次對(duì)mNGS檢測(cè)的商品化試劑進(jìn)行了研究,結(jié)果表明mNGS診斷膿毒癥的靈敏度和特異度分別為92.9%和62.7%。另外有研究報(bào)道,mNGS預(yù)測(cè)兒科癌癥患者發(fā)生血流感染的靈敏度為75%,特異度超過(guò)80%,顯示mNGS 還有很好的輔助預(yù)測(cè)作用[3]。目前病原體核酸檢測(cè)技術(shù)在臨床的應(yīng)用越來(lái)越廣,提升了血流感染病原菌的鑒定速度,但該方法存在對(duì)實(shí)驗(yàn)員專業(yè)要求高、核酸提取質(zhì)量要求嚴(yán)、費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)。

1.3病原菌蛋白檢測(cè) 基于細(xì)菌蛋白標(biāo)志物的含量和結(jié)構(gòu)具種屬特異性,蛋白質(zhì)圖譜能夠鑒定某一類或某種特定細(xì)菌[4]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是近幾年來(lái)快速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)利用質(zhì)譜圖中的特征峰對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定的快速檢測(cè)技術(shù),標(biāo)本離子在電場(chǎng)中加速進(jìn)入飛行時(shí)間探測(cè)器,離子的質(zhì)荷比和飛行時(shí)長(zhǎng)成正比,根據(jù)飛行時(shí)長(zhǎng)能夠探測(cè)到不同質(zhì)荷比的離子從而獲得的質(zhì)譜圖,通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定出細(xì)菌種類[5]。FLORIO 等[6]利用MALDI-TOF MS提出了一種快速鑒定血培養(yǎng)中多菌種的方法,總鑒定準(zhǔn)確率可達(dá)85.7%。在含有兩種不同病原菌的血培養(yǎng)中,其鑒定準(zhǔn)確率達(dá)100%,在含有兩種以上病原菌的血培養(yǎng)中,鑒定出兩種病原菌的準(zhǔn)確率達(dá)86%。張小云等[7]在血流細(xì)菌性感染中應(yīng)用MALDI-TOF MS技術(shù)結(jié)合短時(shí)培養(yǎng)方法快速鑒定病原菌,發(fā)現(xiàn)革蘭陰性菌經(jīng)4 h短時(shí)培養(yǎng),96.6%細(xì)菌可鑒定到種屬,革蘭陽(yáng)性菌經(jīng)過(guò)6 h短時(shí)培養(yǎng),98.1%可鑒定到種屬?？梢?jiàn)MALDI-TOF MS解決了常規(guī)方法耗時(shí)長(zhǎng)、工作效率低的問(wèn)題,能夠快速、準(zhǔn)確地鑒定出血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中的病原菌。

1.4內(nèi)毒素 因革蘭陰性菌中含有內(nèi)毒素,它進(jìn)入血液后釋放內(nèi)毒素可引起內(nèi)毒素血癥,因此理論上進(jìn)行血液內(nèi)毒素檢測(cè)對(duì)革蘭陰性菌造成的感染具有一定的診斷價(jià)值。王黎一等[8]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用鱟試驗(yàn)定量比濁法檢測(cè)內(nèi)毒素有助于對(duì)早期菌血癥診斷。磨立達(dá)等[9]在對(duì)艾滋病合并革蘭陰性菌菌血癥患者的研究發(fā)現(xiàn),以血培養(yǎng)檢出革蘭陰性菌陽(yáng)性作為標(biāo)準(zhǔn),內(nèi)毒素檢測(cè)的靈敏度為34.25%、特異度為86.90%。可見(jiàn)內(nèi)毒素是否可應(yīng)用于血流細(xì)菌性感染診斷結(jié)果并不理想,還需通過(guò)進(jìn)一步臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。

2 針對(duì)感染宿主的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

人體在遭受細(xì)菌感染時(shí),會(huì)針對(duì)病原菌做出一系列的應(yīng)答反應(yīng),包括急性時(shí)相反應(yīng)蛋白、細(xì)胞因子、白細(xì)胞等指標(biāo)的變化;另外,病原菌也會(huì)造成感染宿主凝血功能、乳酸含量等指標(biāo)的變化。針對(duì)感染宿主的這些變化發(fā)明了多種檢測(cè)方法。

2.1C反應(yīng)蛋白(CRP) CRP主要是在白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、IL-13等因子刺激下,肝細(xì)胞中產(chǎn)生的一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,在局部炎癥反應(yīng)中巨噬細(xì)胞也可產(chǎn)生。CRP對(duì)炎癥反應(yīng)的靈敏度高,在感染刺激下,在炎癥開(kāi)始6～12 h后上升,12～60 h達(dá)到峰值,半衰期為19 h,其水平可以反映炎癥刺激的嚴(yán)重程度。吳春娃等[10]研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤患者化療后繼發(fā)細(xì)菌感染時(shí),血清CRP升高水平與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān);且性別、年齡、貧血等因素不影響CRP的檢測(cè)值。但莫麗亞[11]報(bào)道表明,在鑒別細(xì)菌或病毒感染時(shí),CRP的特異度不高,特別在鑒別診斷小兒顱內(nèi)病原體感染時(shí)的特異度遠(yuǎn)低于降鈣素原。另外在存在外傷、手術(shù)、心肌梗死、惡性腫瘤及自身免疫性疾病等非感染性疾病時(shí)CRP也會(huì)顯著升高[12],說(shuō)明在血流細(xì)菌性感染的診斷、進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中,CRP標(biāo)志物檢測(cè)的特異度并不高。盡管如此,由于 CRP 的靈敏度高,且檢測(cè)方便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)惠,CRP 仍可作為細(xì)菌感染和指導(dǎo)抗菌藥物使用的標(biāo)志物。

2.2降鈣素原(PCT) PCT作為甲狀腺中產(chǎn)生的降鈣素的前體分子,正常情況下幾乎全部PCT都會(huì)轉(zhuǎn)化成降鈣素,健康人群血清中PCT濃度低于0.1 ng/mL。當(dāng)發(fā)生病原微生物感染時(shí),在內(nèi)毒素和促炎因子誘導(dǎo)下,2～4 h內(nèi)PCT即會(huì)迅速增加,且感染越嚴(yán)重PCT水平越高,許多研究者認(rèn)為PCT是血流感染診斷、病情監(jiān)控、預(yù)后評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[13-14]。鄭超等[15]研究表明,診斷細(xì)菌感染性疾病,血清PCT檢測(cè)的靈敏度為80.98%、特異度為87.02%,均高于CRP。但 PCT在機(jī)體發(fā)生應(yīng)激、創(chuàng)傷、過(guò)敏或局部感染(如呼吸道感染、腸道感染)時(shí)也會(huì)相應(yīng)升高[16]?？梢?jiàn),PCT用于診斷膿毒血癥時(shí)靈敏度較高但特異度較低,仍需要聯(lián)合其他指標(biāo)、結(jié)合臨床癥狀進(jìn)行血流細(xì)菌性感染的診斷。

2.3細(xì)胞因子及黏附因子 病原微生物侵入血液時(shí),引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞因子及黏附因子的表達(dá)量發(fā)生變化,從而發(fā)揮抗炎、抗感染及免疫調(diào)節(jié)的作用。張洲等[17]研究表明IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等細(xì)胞因子在感染組的濃度顯著升高,其中IL-6相較其他3項(xiàng)指標(biāo)升高的更為顯著,提示 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等細(xì)胞因子對(duì)血流細(xì)菌性感染的診斷具有一定的參考價(jià)值。蘇曉清等[18]在分析創(chuàng)傷性膿毒癥患者細(xì)胞因子水平變化時(shí)發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平的高低與創(chuàng)傷嚴(yán)重程度密切相關(guān),創(chuàng)傷越嚴(yán)重患者炎性因子水平越高。同時(shí),細(xì)胞黏附分子(CAM)也在機(jī)體免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究報(bào)道顯示,E-選擇素、血管黏附分子-1(VCAM)等細(xì)胞黏附分子對(duì)于血流細(xì)菌性感染的早期診斷也有重要意義[19]。但細(xì)胞因子與細(xì)胞黏附分子在重癥肺炎、癌癥、心衰、局部炎癥等情況下也可升高[20-21]?？梢?jiàn),細(xì)胞因子及黏附因子對(duì)于血流細(xì)菌性感染診斷的特異度也不高,需結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)室診斷方法綜合判斷。

2.4sCD14-ST CD14分為膜結(jié)合性 CD14(mCD14)和可溶性CD14(sCD14),sCD14位于健康人、動(dòng)物的血清中。 sCD14亞型(sCD14-ST),又名Presepsin,是血漿蛋白酶作用于sCD14生成的一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為 13×103的氨基酸片段[22]。大量研究顯示,sCD14-ST是全身性炎癥反應(yīng)的一種潛在生物指標(biāo),是當(dāng)今熱門(mén)研究的標(biāo)志物之一[23-24]。趙元明等[25]的研究表明,血清中sCD14-ST水平與血培養(yǎng)結(jié)果具有高度相關(guān)性,診斷血流感染時(shí)受試者工作特征曲線的曲線下面積為0.970,臨界值為546 pg/mL,靈敏度為82.0%,特異度為98.1%,準(zhǔn)確度為94.0%優(yōu)于降鈣素原和C反應(yīng)蛋白。此外,有研究顯示sCD14-ST還有助于膿毒癥的預(yù)后評(píng)估,其濃度隨病程進(jìn)展有逐漸升高的趨勢(shì)[26]。目前,sCD14-ST 血淸標(biāo)志物在診斷血液細(xì)菌性感染的研究中仍存在樣本量少、研究對(duì)象不一等問(wèn)題,因此sCD14-ST的應(yīng)用優(yōu)越性還需充分的證實(shí);另外,血清sCD14-ST水平受年齡和腎功能影響的大小尚未明確[27]。盡管如此,sCD14-ST作為近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物,檢驗(yàn)方便快捷,在血流感染早期診斷、預(yù)后分析等方面有著較好的前景,值得臨床與實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行多中心、大樣本量的研究探討。

2.5可溶性髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體1(sTREM-1) sTREM-1是一種促炎因子,屬于免疫球蛋白超家族成員,主要在中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等髓系細(xì)胞上表達(dá),它的表達(dá)和調(diào)節(jié)跟細(xì)菌或真菌感染、炎癥反應(yīng)有關(guān)[28]。感染發(fā)生時(shí)(特別是膿毒血癥時(shí)),sTREM-1從中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞表面脫落,釋放到血液或體液中,導(dǎo)致其在血清中濃度升高,而非感染性疾病不會(huì)導(dǎo)致sTREM-1升高。已有國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者報(bào)道,認(rèn)為血清sTREM-1有望成為預(yù)測(cè)重癥膿毒血癥患者預(yù)后的可靠指標(biāo);并且發(fā)現(xiàn)sTREM-1也可能是重癥膿毒血癥患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[29-30]。但目前sTREM-1作為血流細(xì)菌性感染診斷的生物標(biāo)志物的研究較少,仍然需要大量研究驗(yàn)證,其診斷閾值及鑒別非感染性疾病的能力有待進(jìn)一步探索。

2.6CD64指數(shù) CD64是中性粒細(xì)胞膜上識(shí)別免疫球蛋白、介導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫的Fc受體,在健康人外周血中性粒細(xì)胞表面的表達(dá)水平很低;發(fā)生細(xì)菌感染時(shí),在細(xì)菌脂多糖成分及IL-1、IL-6、TNF-α等炎性因子刺激下,為抵抗機(jī)體感染,中性粒細(xì)胞CD64表達(dá)水平明顯升高[31]。CD64指數(shù)是中性粒細(xì)胞熒光強(qiáng)度,是以淋巴細(xì)胞熒光強(qiáng)度作為陰性參照,以單核細(xì)胞熒光強(qiáng)度作為陽(yáng)性參照運(yùn)算所得。胡蝶[32]研究指出,CD64指數(shù)和PCT的診斷效能高于CRP。MAHMOODPOOR等[33]的研究發(fā)現(xiàn),中性粒細(xì)胞CD64的表達(dá)水平與ICU重癥膿毒血癥患者病死率密切相關(guān),表達(dá)水平越高,病死率越高。但CD64的表達(dá)可受到其他因素的干擾,比如應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子治療疾病時(shí),中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上CD64的表達(dá)會(huì)增加;另外,應(yīng)用干擾素、手術(shù)治療及一些腫瘤疾病等也會(huì)導(dǎo)致CD64的表達(dá)增加[34-35]。因此,CD64指數(shù)的應(yīng)用需結(jié)合患者的臨床癥狀及病史檢查,并聯(lián)合CRP、PCT、IL-6等多個(gè)標(biāo)志物檢測(cè),才能綜合全面地評(píng)價(jià)患者情況并發(fā)現(xiàn)早期血流細(xì)菌感染。

2.7血常規(guī)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC) WBC是臨床判斷感染的常規(guī)檢測(cè)指標(biāo),WBC及分類比例是主要觀察參數(shù)。人體血液中WBC總量和分類比例相對(duì)穩(wěn)定,在機(jī)體發(fā)生感染、自身免疫病、血液病或其他疾病時(shí),可引起白細(xì)胞總數(shù)及白細(xì)胞分類的百分比發(fā)生變化,因此白細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)是診斷感染的一個(gè)重要輔助方法。楊志明等[36]研究認(rèn)為WBC對(duì)新生兒膿毒血癥的早期診斷具有臨床意義。但WBC易受諸多生理性和病理性因素影響,診斷血流細(xì)菌性感染的特異度不高。

2.8凝血功能及血栓彈力圖 當(dāng)機(jī)體發(fā)生血流細(xì)菌感染時(shí),促炎因子大量釋放,炎性細(xì)胞迅速增殖,單核細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)和釋放組織因子,外源性凝血途徑和內(nèi)源性凝血途徑同時(shí)被激活,造成凝血功能紊亂[37]。薛冰蓉[38]研究顯示血液系統(tǒng)惡性腫瘤合并膿毒癥患者會(huì)出現(xiàn) PT、APTT等凝血指標(biāo)的變化,并且這些指標(biāo)與PCT呈正相關(guān),提示菌血癥患者的全身炎癥反應(yīng)與凝血功能異常密不可分。血栓彈力圖(TEG)能反映從凝血啟動(dòng)到血小板聚集、纖維蛋白形成、血凝塊形成、最大血凝塊形成、血凝塊降解至最后溶解的全部信息,較常規(guī)凝血功能檢測(cè)更能提現(xiàn)體內(nèi)凝血的整個(gè)過(guò)程,TEG可以更快速、準(zhǔn)確地幫助判斷其原因,從而有效預(yù)測(cè)患者的感染情況。趙雪松[39]研究表明TEG在膿毒癥嚴(yán)重程度的早期預(yù)測(cè)分析中具有一定作用,血栓彈力圖中的R值、K值、PCT與膿毒癥嚴(yán)重程度呈正相關(guān),MA或CI或α角或PLT與膿毒癥嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。因此,凝血功能指標(biāo)可能具有輔助診斷血液細(xì)菌性感染的潛在價(jià)值。

2.9乳酸(Lac) Lac是無(wú)氧酵解的代謝產(chǎn)物,血清乳酸水平升高反映了器官、組織灌注不足,高乳酸血癥被認(rèn)為是嚴(yán)重膿毒癥的標(biāo)志。大量的研究已經(jīng)把乳酸作為診斷膿毒癥、判斷預(yù)后和糾正休克組織中缺氧的標(biāo)志物[40]。相關(guān)研究表明,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血液Lac水平及其清除率,可以較好地評(píng)估膿毒癥患者住院期間的病死率[41]。有研究中認(rèn)為,血液中Lac水平的早期檢測(cè)甚至比監(jiān)測(cè)生命體征的臨床意義更大[42]。Lac檢測(cè)是從機(jī)體代謝的角度反映血流細(xì)菌感染對(duì)機(jī)體造成的影響,對(duì)診斷血流細(xì)菌性感染具有一定的參考價(jià)值。

3 小 結(jié)

血流細(xì)菌性感染是臨床常見(jiàn)疾病,致死率高,危害嚴(yán)重,尋找快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法是亟待解決的問(wèn)題。病原體侵入機(jī)體可引發(fā)一系列反應(yīng),如炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、凝血改變及組織損傷等復(fù)雜的病理生理改變。目前,盡管診斷血流細(xì)菌性感染的標(biāo)志物有很多,但是單獨(dú)使用某一指標(biāo)的特異度和靈敏度均不夠高,需要多種手段的聯(lián)合應(yīng)用才能加快診斷效率、提高診斷的準(zhǔn)確度。隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷發(fā)展、新型檢測(cè)標(biāo)志物的出現(xiàn)及對(duì)血流細(xì)菌性感染生理特性研究的不斷深入,更準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的診斷方法將逐步涌現(xiàn),為臨床提供可靠的血流細(xì)菌性感染診斷依據(jù),從而提示抗菌藥物的合理使用和提高患者生存率。