非小細胞肺癌組織PRRX1、HOXC8表達及其臨床意義

鄒裕海,符仕康,劉 雨,梁必雄

海南西部中心醫(yī)院胸外科,海南儋州 571700

非小細胞肺癌(NSCLC)包括肺腺癌、肺鱗狀細胞癌和大細胞癌,占所有肺癌的80%以上[1]。目前,NSCLC的發(fā)病率正在增加,由于肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,NSCLC患者的生存率仍然很低[2-3]。有研究顯示,NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)密切相關(guān),EMT與多種信號通路有關(guān),在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著決定性作用[4]。配對相關(guān)同源框蛋白 1(PRRX1)屬于配對同源框家族,PRRX1可作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控多種基因表達。目前研究顯示,PRRX1表達下調(diào)后,上皮標志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達降低,削弱了細胞間接黏附性,有利于促進癌細胞從原發(fā)部位脫離,促進了惡性腫瘤中EMT作用及腫瘤轉(zhuǎn)移[5]。有研究表明,多種實體腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移均與HOX基因表達有關(guān)[6]。同源盒C8(HOXC8)屬于HOX基因簇的重要成員,是惡性腫瘤進展中EMT的標志物[7]。本研究旨在探討NSCLC患者癌組織中PRRX1、HOXC8的表達及其臨床意義,現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年5月至2017年5月本院收治的120例NSCLC患者為研究對象,癌組織及癌旁組織(距離腫瘤3～5 cm)標本在手術(shù)切除后保存于10%的中性福爾馬林溶液中固定24 h,然后進行組織脫水,制備石蠟包埋切片。120例NSCLC患者中男83例,女37例;年齡38～80歲,平均(65.75±9.16)歲;腫瘤最大徑1.3～7.0 cm,平均(5.21±1.75)cm;肺鱗狀細胞癌75例,肺腺癌45例;高/中分化55例,低分化65例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期86例,ⅢA期34例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例。納入標準:(1)經(jīng)手術(shù)切除后病理證實為NSCLC,且為首次確診患者;(2)年齡18周歲或以上,自愿簽署知情同意書者。排除標準:(1)嚴重心肝腎功能障礙;(2)患免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾病;(3)入院前近6個月內(nèi)有大手術(shù)史;(4)患其他部位的原發(fā)性腫瘤;(5)既往有精神障礙史。本研究方案獲本院倫理委員會批準。

1.2方法 采用免疫組化法測定NSCLC組織、癌旁組織中PRRX1、HOXC8、 EMT相關(guān)標志物E-cadherin和波形蛋白(Vimentin)表達情況。所有組織標本均經(jīng)10%的中性福爾馬林溶液固定,液體石蠟包埋標本置于模具中。將代表性蠟塊切成4 μm厚連續(xù)切片,所有病理組織切片用二甲苯和梯度酒精脫蠟,然后用蒸餾水沖洗這些切片10 min。將組織切片浸入檸檬酸鈉緩沖液 (pH 6.0) 中,高壓鍋煮沸后冷卻至37 ℃進行抗原修復(fù)。為了抑制內(nèi)源性過氧化物酶并進行組織抗原修復(fù),將3%過氧化氫溶液逐滴加入到所有切片中,然后將切片在室溫下孵育15 min。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,pH 7.2) 清洗載玻片3次,每次3 min。將切片置于孵育箱中,加入幾滴小鼠單克隆抗PRRX1(稀釋比例1∶150,北京傲銳東源生物科技有限公司),小鼠單克隆抗HOXC8(稀釋比例1∶150,北京傲銳東源生物科技有限公司),兔單克隆抗E-cadherin(稀釋比例1∶200,西格瑪奧德里奇公司) 和抗Vimentin(稀釋比例1∶200,英國Abcam公司) 抗體,然后將其置于37 ℃培養(yǎng)箱中1 h。之后 PBS洗滌切片3次,每次9 min,滴加二抗羊抗兔/小鼠IgG-HRP,室溫放置30 min。將所有切片浸入新制備的 DAB 溶液中,用蘇木精復(fù)染,用蒸餾水沖洗,用梯度酒精脫水并用中性樹脂密封。免疫組化結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師判定,每個組織標本須至少觀察1 000個腫瘤細胞。陽性染色均為淡黃色、棕黃色或棕褐色,定位于細胞質(zhì)。評分采用二級計分法[8]:(1)按陽性細胞所占比例計數(shù),其中陽性細胞數(shù)<5%計0分,5%～<25%計1分,25%～<50%計2分,50%～<75%計3分,≥75%計4分;(2)按染色強度分類,其中無著色計0分,淡黃色計1分,黃或深黃色計2分,褐或棕褐色計3分。將兩者計分相乘,乘積≥3分為陽性表達,反之則為陰性表達。

1.3預(yù)后隨訪 出院后隨訪5年,隨訪截止時間為2022 年5月。術(shù)后1年內(nèi)每3個月復(fù)查一次,1年以后改為6個月復(fù)查一次。出院后同時通過電話、短信、微信等多種形式隨訪。

2 結(jié) 果

2.1NSCLC患者癌組織、癌旁組織中PRRX1、HOXC8及EMT相關(guān)標志物表達率比較 NSCLC患者癌組織PRRX1、E-cadherin陽性表達率低于癌旁組織,HOXC8、Vimentin陽性表達率高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 NSCLC患者癌組織、癌旁組織中PRRX1、HOXC8及EMT相關(guān)標志物表達率比較[n(%)]

2.2NSCLC患者PRRX1、HOXC8表達與E-cadherin和Vimentin蛋白表達的相關(guān)性分析 PRRX1表達與E-cadherin表達呈正相關(guān)(P<0.05),與Vimentin表達呈負相關(guān)(P<0.05)。HOXC8表達與E-cadherin表達呈負相關(guān)(P<0.05),與Vimentin表達呈正相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 PRRX1、HOXC8表達與E-cadherin和Vimentin蛋白表達的相關(guān)性分析

2.3NSCLC患者PRRX1表達與臨床病理特征的關(guān)系 PRRX1陽性表達患者腫瘤最大徑≥5 cm、TNM分期為ⅢA期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移占比低于PRRX1陰性表達患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 NSCLC患者PRRX1表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4NSCLC患者HOXC8表達與臨床病理特征的關(guān)系 HOXC8陽性表達患者腫瘤最大徑≥5 cm、TNM分期為ⅢA期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移占比高于HOXC8陰性表達患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HOXC8陽性表達患者性別、年齡、組織病理類型、分化程度與HOXC8陰性表達患者比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 NSCLC患者HOXC8表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.5不同PRRX1、HOXC8表達患者的預(yù)后比較 隨訪5年,隨訪期間失訪5例,其中PRRX1陽性表達患者失訪2例,陰性表達患者失訪3例。HOXC8陽性表達患者失訪3例,HOXC8陰性表達患者失訪2例。PRRX1陽性表達患者5年總體生存率[69.05%(29/42)]高于陰性表達患者[36.99%(27/73)],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.956,P=0.026)。HOXC8陽性表達患者5年總體生存率[39.47%(30/76)]低于陰性表達患者[66.67%(26/39)],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.974,P=0.008)。見圖1、2。

圖1 不同PRRX1表達患者Kaplan-Meier生存曲線圖

圖2 不同HOXC8表達患者Kaplan-Meier生存曲線圖

2.6NSCLC患者預(yù)后的COX風險回歸模型分析 將相關(guān)變量納入COX風險回歸模型,以NSCLC患者預(yù)后為因變量X(生存=0,死亡=1),多因素COX風險回歸結(jié)果提示腫瘤最大徑≥5 cm、TNM分期ⅢA期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HOXC8陽性表達為預(yù)后的危險因素(P<0.05),PRRX1陽性表達是預(yù)后的保護因素(P<0.05)。見表5。

表5 NSCLC患者預(yù)后的COX風險回歸模型分析

3 討 論

NSCLC是呼吸系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤,整個疾病發(fā)展涉及復(fù)雜多變的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,會導(dǎo)致一系列基因或蛋白表達的結(jié)構(gòu)或者功能異常[9]。盡管該疾病的多學(xué)科診斷和治療方法顯著提高,但NSCLC的早期診斷率和預(yù)后仍不理想。因此充分了解其中的分子機制對于指導(dǎo)臨床診斷和治療有重要意義。癌癥發(fā)展過程中,癌細胞可能重新激活處于休眠狀態(tài)的胚胎程序性EMT,EMT是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵所在,可從多方面介入和促進腫瘤的疾病進程[10]。經(jīng)歷EMT后,腫瘤細胞能夠穿透Matrigel膠進行浸潤性生長,并誘導(dǎo)細胞微環(huán)境促進腫瘤生長,還可能導(dǎo)致免疫抑制,提高腫瘤干細胞表面標志物表達,促進腫瘤進展[11]。在NSCLC中,癌細胞轉(zhuǎn)移也與EMT相關(guān),EMT程序主要調(diào)節(jié)因子是通過激活或抑制啟動子來控制EMT相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[12]。

PRRX1屬于配對同源盒家族,可作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控各種基因。PRRX1作為新的EMT 誘導(dǎo)劑,可通過調(diào)節(jié)E-cadherin、Vimentin誘導(dǎo)細胞EMT[13]。FELDMANN等[14]研究顯示,PRRX1高基質(zhì)表達的胰腺癌患者最具侵襲性。BLOCK等[15]在三陰性乳腺癌模型中的研究發(fā)現(xiàn),RNA結(jié)合基序單鏈相互作用蛋白3 (RBMS3)與乳腺癌中的EMT轉(zhuǎn)錄程序顯著相關(guān),而PRRX1是RBMS3介導(dǎo)的EMT所必需蛋白,這也提示PRRX1與乳腺癌中的EMT轉(zhuǎn)錄程序有關(guān)。本次研究中,NSCLC癌組織中PRRX1陽性表達低于癌旁組織,腫瘤最大徑≥5 cm、TNM分期為ⅢA期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者PRRX1陽性表達率占比更低,提示NSCLC組織中PRRX1陽性表達下降,且PRRX1陽性表達可能與抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。目前已有研究證實,E-cadherin、Vimentin與NSCLC疾病進展及預(yù)后密切相關(guān)[16]。E-cadherin表達缺失、Vimentin表達上調(diào)是腫瘤進展中EMT的標志。本研究結(jié)果顯示,PRRX1表達與E-cadherin表達呈正相關(guān),與Vimentin表達呈負相關(guān),這也進一步提示PRRX1表達可能通過EMT參與NSCLC進展。在不同的惡性腫瘤中,PRRX1的表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系有明顯差異。在胃癌的相關(guān)研究中,PRRX1的高表達預(yù)示著預(yù)后較差[17]。然而,FAN等[18]在肝細胞癌的研究中卻顯示,PRRX1表達下調(diào)可通過p53依賴的信號通路,導(dǎo)致預(yù)后不良。本研究Kaplan-Meier分析也發(fā)現(xiàn),PRRX1陽性表達患者5年總體生存率高于陰性表達患者。COX風險回歸模型分析也顯示,PRRX1陽性表達是預(yù)后的保護因素。PRRX1陽性表達與E-cadherin陽性表達呈正相關(guān),與Vimentin陰性表達呈負相關(guān),提示PRRX1陽性表達可促進E-cadherin再表達,抑制Vimentin表達,進而影響EMT過程,抑制癌細胞侵襲和遷移。

HOXC8是HOX家族的一員,已被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中表達失調(diào),并作為轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子調(diào)節(jié)許多基因轉(zhuǎn)錄[19]。有研究表明,HOXC8與E-cadherin啟動子結(jié)合,并作為轉(zhuǎn)錄抑制因子調(diào)節(jié)肺癌中的E-cadherin轉(zhuǎn)錄,E-cadherin的缺失導(dǎo)致肺癌癌細胞錨定非依賴性生長和遷移的增加[20]。本研究結(jié)果顯示,NSCLC患者癌組織HOXC8陽性表達率高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而且HOXC8陽性表達與腫瘤最大徑、TNM分期為ⅢA期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。HOXC8表達與E-cadherin表達呈負相關(guān),與Vimentin表達呈正相關(guān)。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn),HOXC8陽性表達患者5年總體生存率低于陰性表達患者,COX風險回歸模型分析也顯示,HOXC8陽性表達、腫瘤最大徑增大、TNM分期越高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為預(yù)后的危險因素。分析可能與HOXC8調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因的表達促進NSCLC增殖、遷移有關(guān)。E-cadherin表達缺失是EMT的關(guān)鍵一環(huán),可增加癌癥患者腫瘤細胞的遷移和侵襲。Vimentin是間充質(zhì)細胞的標志物之一,與癌細胞侵襲和遷移能力增強密切相關(guān),可作為腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的標志之一[21]。HOXC8陽性表達,可抑制E-cadherin陽性表達,促進Vimentin陰性表達,預(yù)示患者預(yù)后不良,進一步表明HOXC8與NSCLC腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲有關(guān),或可作為預(yù)測患者生存預(yù)后的指標。

綜上所述,NSCLC患者癌組織中PRRX1陽性表達率下降,HOXC8陽性表達率升高,且與EMT有一定相關(guān)性。HOXC8陽性表達為預(yù)后的危險因素,PRRX1陽性表達是預(yù)后的保護因素,有望作為判斷NSCLC預(yù)后的標志物。