胚胎干細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因PLK1在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)體外不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)研究

帕力塔吉·麥麥提祖農(nóng),吳川川,田夢(mèng)瀟,齊文靜,艾柯代·卡得,焦紅杰,龔巧巧,李 軍,張文寶,,張亞樓,

棘球蚴病是一種被忽視的慢性人獸共患病,通常稱為“包蟲(chóng)病”。囊型棘球蚴病(cystic echinococcosis,CE)是一種世界性分布的疾病,由細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)引起。CE的高流行區(qū)包括中國(guó)西部以及中亞、沿地中海、北非和南美洲的國(guó)家或地區(qū)[1-4]。棘球絳蟲(chóng)是一種寄生在犬科動(dòng)物腸道中的小型絳蟲(chóng)[5]。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)需要兩種哺乳動(dòng)物宿主,包括終末宿主(犬和狼)和中間宿主(牛羊)完成其生活史[5]。犬等食肉動(dòng)物吞食被感染的牲畜內(nèi)臟如肝臟或肺,其中含有原頭蚴的棘球蚴被肉食動(dòng)物吞食后在其腸道中發(fā)育成成蟲(chóng)。自然狀態(tài)下細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)在感染后45 d可以在宿主體內(nèi)產(chǎn)卵(或孕節(jié)脫落的方式將蟲(chóng)卵排除宿主體外)并通過(guò)宿主糞便釋放到環(huán)境中[5]。中間宿主誤食蟲(chóng)卵,在其體內(nèi)發(fā)育成為含原頭蚴的包囊。當(dāng)原頭蚴被食肉動(dòng)物吞食后進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)。

CE是慢性寄生蟲(chóng)病,在人體內(nèi)可以無(wú)癥狀發(fā)展長(zhǎng)達(dá)15年[6]。國(guó)外研究報(bào)告顯示,新西蘭通過(guò)每45 d給犬喂食一次驅(qū)蟲(chóng)藥等措施已成功控制CE在當(dāng)?shù)氐膫魅綶7]。然而至今CE仍然在全球范圍內(nèi)流行,需要控制技術(shù)的突破[3,7]。

包蟲(chóng)病在我國(guó)高發(fā)流行,但目前缺乏有效的技術(shù)手段控制該病。新疆流行病區(qū)合并的總發(fā)病率為4.04%,新疆地區(qū)為我國(guó)包蟲(chóng)病高發(fā)地區(qū)之一[8],2005-2020年新疆塔城地區(qū)共報(bào)告棘球蚴病2 356例,年平均發(fā)病率為14.39/10萬(wàn)[9]。2021-2022年對(duì)北疆阿勒泰、塔城和伊犁部分牛和綿羊屠宰場(chǎng)進(jìn)行包蟲(chóng)病調(diào)查,查出被感染牛羊141頭(只),牛、羊總感染率為2.07%[10]。犬為傳播的核心傳染源,與人類頻繁接觸,是感染的主要途徑。在流行地區(qū)犬遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于羊,如果可以接種疫苗,將是經(jīng)濟(jì)有效的控制手段[11]。但因?yàn)槌上x(chóng)發(fā)育的研究較少,成蟲(chóng)發(fā)育的關(guān)鍵基因研究的更少,目前犬抗細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的疫苗研發(fā)極為困難。只有對(duì)成蟲(chóng)的發(fā)育,尤其成蟲(chóng)發(fā)育的關(guān)鍵基因進(jìn)行深入的生物學(xué)研究,才能取得疫苗研發(fā)的突破。這些研究應(yīng)當(dāng)包括對(duì)原頭蚴向成蟲(chóng)發(fā)育的體外模型、關(guān)鍵的分子與調(diào)節(jié)機(jī)制、節(jié)片生長(zhǎng)與分節(jié)、性器官的分化與發(fā)育以及蟲(chóng)卵的生成機(jī)制等。

Polo樣激酶(Polo Like Kinese,PLKs)蛋白家族在哺乳動(dòng)物干細(xì)胞發(fā)育分化的生理過(guò)程中起重要作用[12]。哺乳動(dòng)物中PLK1(Polo Like Kinese 1)在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),是抗癌治療的重要靶點(diǎn)。曼氏血吸蟲(chóng)SmPlk1的結(jié)構(gòu)和功能分析表明其與哺乳動(dòng)物PLK1具有高度同源性,在血吸蟲(chóng)有絲分裂和減數(shù)分裂中影響卵子生成和精子發(fā)生[13],表明PLK1在寄生蟲(chóng)繁殖中的起到關(guān)鍵作用。通過(guò)RT-PCR、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和原位雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Emplk1在多房棘球絳蟲(chóng)的干細(xì)胞中的特異表達(dá)[14]。因此,PLK1可作為泡狀棘球蚴病、血吸蟲(chóng)病等寄生蟲(chóng)病候選疫苗靶標(biāo)。

Koziol等人[15]通過(guò)基因組學(xué)檢測(cè)不同發(fā)育階段的多房棘球絳蟲(chóng)蟲(chóng)體,發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞在幼蟲(chóng)階段特異表達(dá),尤其在其絳蟲(chóng)原頭蚴階段的胚胎層細(xì)胞里。有學(xué)者提出假設(shè),絳蟲(chóng)生長(zhǎng)來(lái)源于發(fā)育中的成蟲(chóng)頸部區(qū)域的生發(fā)細(xì)胞[16-18]。PLK1抑制劑BI2536體外實(shí)驗(yàn)可明顯減少蟲(chóng)體存活率,抑制蟲(chóng)體生長(zhǎng)發(fā)育[14]。PLK1可能是蟲(chóng)體發(fā)育、生殖器官生成的關(guān)鍵基因,可能影響胚胎干細(xì)胞的產(chǎn)生。本研究利用分子克隆及生物信息學(xué)分析的方法對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)胚胎發(fā)育相關(guān)基因PLK1進(jìn)行克隆并分析其分子特征,為包蟲(chóng)病重組免疫診斷抗原和亞單位疫苗的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。目前在GenBank中可以查到與編碼PLK1蛋白的相似序列EgPlk1和EmPlk1,國(guó)內(nèi)外對(duì)于細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)PLK1蛋白的功能及其胚胎干細(xì)胞發(fā)育相關(guān)研究尚未報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)建立細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴向成蟲(chóng)方向發(fā)育體外培養(yǎng)模型,用熒光定量PCR方法確定不同發(fā)育時(shí)期PLK1的表達(dá)情況,為探索PLK1基因在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng)發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 倫理申明 本研究獲得了新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):IACUC-2015,IACUC-2013),所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和操作均按照中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行。

1.2 蟲(chóng)株 細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusgranulosus)原頭蚴(PSCs)采自于新疆烏魯木齊市華凌屠宰場(chǎng)的自然感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊肝臟。

1.3 主要試劑 PRMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素鏈霉素雙抗均購(gòu)于Hyclone公司;酵母提取物、葡萄糖、犬膽汁、胰蛋白酶、胃蛋白酶、1%亞甲基藍(lán)購(gòu)于Sigma公司;其它試劑包括蘇木素染液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、PLK1兔抗體(abcon公司)、RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SGFast qPCRMix(上海生工生物技術(shù)有限公司)。犬膽汁從新疆醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)解剖犬得到,1∶10稀釋后,0.22 μmol/L濾膜過(guò)濾,-20 ℃保存,保存期為1個(gè)月。

1.4 方 法

1.4.1 原頭蚴的采集 將從新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市華凌屠宰場(chǎng)獲得被感染的帶有包囊的綿羊肝臟,用清水反復(fù)沖洗表面。再用75%酒精進(jìn)行表面消毒,置于生物安全柜中切開(kāi)包囊,用無(wú)菌注射器抽取清亮的囊液,從中分離出細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴,加入適量生理鹽水自然沉降3 min,棄去生理鹽水,如此重復(fù)漂洗5遍,將漂洗干凈的原頭蚴與1%的胃蛋白酶按1∶10比例(pH 2.0)在37 ℃水浴狀態(tài)下消化30 min。為使得充分消化,期間每隔5 min顛倒搖晃1次。觀察到原頭蚴成細(xì)沙狀且在顯微鏡下均為單獨(dú)的個(gè)體,即為消化完全,否則可適當(dāng)增加消化時(shí)間或重新配置消化液。

1.4.2 原頭蚴的活力檢測(cè) 消化后的原頭蚴用含雙抗的 PBS清洗3遍,1 μL原頭蚴加入1%亞甲基藍(lán)9 μL染色3 min后檢測(cè)活力?；钚院玫脑^蚴無(wú)著色,活性差和死的原頭蚴呈藍(lán)色,重復(fù)3次取平均值,活力達(dá)到98%以上的原頭蚴可用于體外培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.4.3 包囊生發(fā)層GL(Germinal Layer)細(xì)胞采集 綿羊包囊抽取原頭蚴和囊液后,置于含有生理鹽水的培養(yǎng)皿里。剪開(kāi)內(nèi)囊壁,使內(nèi)囊皮外翻,然后將內(nèi)囊皮剪碎,加入適量生理鹽水后,快速攪拌15 min,自然沉降2 min,將上層細(xì)胞懸液移到離心管內(nèi),3 000 r/min離心15min,沉淀用生理鹽水洗滌3次,即得到細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞。

1.4.4 體外培養(yǎng)模型的建立 將50 μL沉淀原頭蚴(1萬(wàn)枚)用純水刺激兩次,每次浸泡20 s,再用10倍體積的生理鹽水平衡。加入含0.02%的犬膽汁,0.2%胰蛋白酶的75 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,加入含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基50 mL,全培養(yǎng)基配置如表1所示。原頭蚴在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3 d換液觀察有無(wú)污染情況,棄掉原培養(yǎng)基,加入含0.02%的犬膽汁(無(wú)胰蛋白酶)的完全培養(yǎng)基于事先制備好的帶有犬血清墊子(75 mL培養(yǎng)瓶加入15 mL犬血清,水浴30～45 min,使血清凝集,放入室溫備用)的培養(yǎng)瓶中,繼續(xù)培養(yǎng)至56 d。每隔3 d換1次培養(yǎng)基,并在鏡下觀察蟲(chóng)體發(fā)育狀態(tài)。

表1 成蟲(chóng)培養(yǎng)全培養(yǎng)基配置Tab.1 Composition of adult worm cultu medium

1.4.5 不同發(fā)育時(shí)期蟲(chóng)體收集 培養(yǎng)第0 d、第14 d、第35 d、第56 d的蟲(chóng)體在顯微鏡下觀察拍照并收集樣本,部分4%多聚甲醛固定,4 ℃保存,石蠟切片備用。部分放入凍存管中,-80 ℃保存,用于RNA提取。

1.4.6 蟲(chóng)體石蠟切片制作及免疫組化染色 將保存于4%多聚甲醛中的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的原頭蚴和成蟲(chóng)蟲(chóng)體分別經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次后,加熱2%瓊脂糖至65 ℃,將原頭蚴和成蟲(chóng)放入融化的瓊脂糖溶液中,冷卻后再固定在4%多聚甲醛過(guò)夜,制備石蠟切片,70 ℃烘烤過(guò)夜。無(wú)水乙醇和95%、85%、75%的乙醇各浸泡2 min逐級(jí)脫蠟。檸檬酸緩沖液微波爐加熱15 min進(jìn)行抗原修復(fù)。3%雙氧水避光浸泡10 min封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶,10%山羊血清室溫封閉1 h。加入兔抗PLK1抗體(1∶500稀釋)4 ℃過(guò)夜,室溫放置30 min后PBS洗3次,加入羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀釋),37 ℃撫育1 h,蘇木素染色1 min,鹽酸酒精分化10 s,透明30 min,中性樹(shù)膠封片。

1.4.7 引物設(shè)計(jì)和合成 參照GenBank上已公布的管家基因β-actin(登錄號(hào)AB643460.1)、E.gPLK1(登錄號(hào)XM_024490293.1)mRNA基因序列使用Primer5.0分別設(shè)計(jì)引物,送北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司合成β-actin的引物序列為:上游引物F:5′-GGTTACATCCCTCCGACCTTG-3′,下游引物R:5′-AAGCAGCCTCCTCTTGAGTG-3′,Tm=58 ℃,片段大小為 183 bp;

E.gPLK1序列前1 800 bp序列的引物序列為:上游引物F:5′-AGAGGGAGGTTTCTTGGA-3′,下游引物R:5′-TCTTCTTTCATTGGAGCA-3′,Tm=62 ℃,片段大小為 1 800 bp。

E.gPLK1序列后1 800 bp序列的的引物序列為:上游引物F:5′-AGAGGGAGGTTTCTTGGA-3′,下游引物R:5′-TCTTCTTTCATTGGAGCA-3′,Tm=60 ℃,片段大小為 1 800 bp。

1.4.8 RNA提取、cDNA合成 取各個(gè)發(fā)育階段的蟲(chóng)體 10 μL原頭蚴沉淀(約2 000條)或相應(yīng)體積的沉淀細(xì)胞或成蟲(chóng),按RNA提取試劑盒操作步驟提取蟲(chóng)體RNA,合成cDNA前用DNA酶消化DNA去除基因組DNA。用Mighty Script 第一鏈cDNA合成試劑盒(Master Mix試劑盒)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照下述熒光定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR。

1.4.9 熒光定量PCR反應(yīng) 熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL:2×SG Fast qPCR Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L),cDNA 1 μL,用 dd H2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性5 s,65 ℃退火/延伸30 s,共38個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù),程序結(jié)束后自動(dòng)得出Ct值。

2 結(jié) 果

2.1 PLK1基因序列測(cè)定和氨基酸序列一致性比較 細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)PLK1基因(EgPLK1)鑒定:利用DNA提取試劑盒,檢測(cè)DNA濃度,濃度大于50 ng/μL,DNA濃度合格后,擴(kuò)增原頭蚴EgPLK1基因,所獲得PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴cDNA樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增出的目的片段與預(yù)期大小相符。結(jié)果顯示EgPLK1片段相應(yīng)位置出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增帶,如圖1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示,EgPLK1開(kāi)放閱讀框?yàn)? 441 bp,編碼1 146個(gè)氨基酸;理論等電點(diǎn)為7.33;不穩(wěn)定指數(shù)為36.34,為不穩(wěn)定蛋白;脂肪系數(shù)為106.46;親水性疏水性平均值為0.958,為疏水性可溶性蛋白。

1.DL2000分子標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量; 2.管家基因擴(kuò)增產(chǎn)物; 3. 細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)PLK1序列前1 800 bp片段; 4. 細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)PLK1序列后1 800 bp序列。圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification products

序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)EgPLK1基因的測(cè)序結(jié)果與GenBank的EgPLK1(登錄號(hào)XM_024490293.1)序列一致。EgPLK1(登錄號(hào)XM_024490293.1)與多房棘球絳蟲(chóng)PLK1基因(EmPLK1)(登錄號(hào):HG931729.1)核苷酸序列一致性為96.88%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明,EgPLK1與埃及血吸蟲(chóng)(XM_051208928.1),秀麗線蟲(chóng)(AF080581.1),旋毛蟲(chóng)(ES568453.1)親緣關(guān)系較近,與人類(NP_005021.2),小鼠(NP_035251.3),家貓(XP_003998811.1)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn);EgPLK1與EmPLK1同源性達(dá)100%。如圖2。

圖2 PLK1基因在不同物種之間系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.2 Phylogenetic analysis of PLK1 in different species

2.2 棘球絳蟲(chóng)原頭蚴向成蟲(chóng)體外發(fā)育模型的建立 細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴向成蟲(chóng)方向體外發(fā)育見(jiàn)圖3。胃蛋白酶消化處理后獲得原頭蚴活力近98%,此時(shí)原頭蚴呈現(xiàn)兩種形態(tài):一種為頂突凹陷未外翻狀態(tài),另一種為頂突外翻狀態(tài)。未經(jīng)適當(dāng)濃度的膽汁酸鹽和胰蛋白酶刺激外翻的原頭蚴長(zhǎng)期培養(yǎng)會(huì)發(fā)育成微囊或者萎縮崩解死亡。經(jīng)刺激后82.7%的原頭蚴保持外翻狀態(tài)往成蟲(chóng)方向發(fā)育。原頭蚴頂突和4個(gè)吸盤(pán)完全外翻后表現(xiàn)明顯的活動(dòng)性,伸縮蠕動(dòng)。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)在此培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)17～21 d后產(chǎn)生第2個(gè)節(jié)片,在25～30 d產(chǎn)生第2和第3個(gè)片段,35～45 d大部分成蟲(chóng)產(chǎn)生第3個(gè)節(jié)片,培養(yǎng)后50～55 d產(chǎn)生第4個(gè)片段。觀察發(fā)現(xiàn)具有3個(gè)節(jié)片的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的蟲(chóng)長(zhǎng)平均為(2.39±0.12)mm。當(dāng)成蟲(chóng)有4節(jié)片時(shí)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)平均為(3.12±0.17)mm。培養(yǎng)14 d后,74.4%原頭蚴保持外翻狀態(tài)并且體節(jié)有明顯增長(zhǎng)趨勢(shì),7.4%成囊方向發(fā)育,死亡率為10.57%。發(fā)育至 21 d后,有56.2%成蟲(chóng)發(fā)育至兩個(gè)節(jié)片,死亡率為6.59%。其頭頸節(jié)以下第2節(jié)片狹窄區(qū)域清晰看到生殖器官雛形;培養(yǎng)第35 d時(shí),31.16%成蟲(chóng)形成3節(jié);成蟲(chóng)發(fā)育到45 d時(shí)有26.5%發(fā)育到4個(gè)節(jié)片,此時(shí)第3和第4節(jié)片成蟲(chóng)比例總和已達(dá)到45.7%;培養(yǎng)第56 d部分成蟲(chóng)出現(xiàn)孕節(jié),觀察到明顯的雌性器官子宮的產(chǎn)生,卻未觀察到雄性器官睪丸的產(chǎn)生。此階段成熟蟲(chóng)體由頭頸節(jié)、幼節(jié)、成節(jié)、孕節(jié)組成,4～5節(jié)占比高達(dá)40.32%,死亡率為9.84%(圖3B)。

2.3 PLK1基因在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)體外發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)分析 以細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)β-actin基因作為管家基因,對(duì)原頭蚴、成蟲(chóng)、包囊生發(fā)層cDNA利用熒光定量PCR法進(jìn)行基因表達(dá)相對(duì)定量測(cè)定,獲得Ct值通過(guò)2-Δ ΔCt法計(jì)算,結(jié)果見(jiàn)圖4A-B。在原頭蚴外翻后的0 d階段和培養(yǎng)至14 d 樣本mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),激活后0 d原頭蚴PLK1基因表達(dá)量為14 d成蟲(chóng)的2.7倍;隨著體外培養(yǎng)天數(shù)的增加其表達(dá)量升高,第35 d(發(fā)育至2～3節(jié)成蟲(chóng))時(shí)PLK1表達(dá)量為14 d時(shí)的8.2倍,mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F35 d= 276.85,P<0.05);培養(yǎng)第50 d(培養(yǎng)至4～5節(jié)成蟲(chóng))時(shí),與35 d表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。50 d與0 d、14 d相比PLK1表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,如圖4A(F14 d= 276.85,P<0.05)。表明成蟲(chóng)分節(jié)片旺盛期隨著干細(xì)胞分化加快,PLK1表達(dá)量隨著增高。

A.培養(yǎng)0 d、14 d、35 d、50 d的成蟲(chóng)PLK1的mRNA相對(duì)表達(dá)量; B.原頭蚴,成蟲(chóng),生發(fā)層PLK1的mRNA相對(duì)表達(dá)量(PSC:原頭蚴; AW:成蟲(chóng); GL:生發(fā)層)。ns:P>0.05;*:P<0.05;**:P<0.01圖4 PLK1基因在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)不同階段mRNA表達(dá)水平Fig.4 PLK1 gene mRNA relative tanscription in different development stage of E.granulosis

細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴(0 d), 成蟲(chóng)(50 d), 包囊三大發(fā)育關(guān)鍵階段PLK1基因 mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)包囊生發(fā)層PLK1表達(dá)量最高,為激活原頭蚴表達(dá)量的16.2倍,成蟲(chóng)階段表達(dá)量的5.9倍。mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FGL=210.25,P<0.05)。表明該基因可能在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)胚胎發(fā)育階段表達(dá)量明顯高于其他階段。各時(shí)期的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),如圖4B。

2.4 EgPLK1基因在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)體外發(fā)育成蟲(chóng)不同部位的表達(dá)分析 絳蟲(chóng)的生長(zhǎng)是以鏈體的延長(zhǎng)為基本生物學(xué)特點(diǎn)。而其生長(zhǎng)面為頭節(jié)的末端,其中含有干細(xì)胞群。為了確定PLK1基因是否在這個(gè)區(qū)域高表達(dá),我們將培養(yǎng)56 d的成蟲(chóng)在光學(xué)顯微鏡下切割分為兩部分,一部分包括頭節(jié)和頸部生長(zhǎng)區(qū)域,另外一部分為頸節(jié)之后的部分。定量PCR結(jié)果顯示EgPLK1在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng)階段頭頸節(jié)與體節(jié)這部分高于頸節(jié)下的部分。圖5A為培養(yǎng)56 d細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng)頭節(jié)和頸節(jié)切割后的顯微結(jié)果;圖5B為培養(yǎng)56 d細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng)切割后成熟體節(jié)的顯微結(jié)果;圖5C為A和B中采樣的蟲(chóng)體和頭頸節(jié)中EgPLK1基因的表達(dá)量,可以看出,EgPLK1基因在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng)頭頸節(jié)mRNA表達(dá)量是成熟體節(jié)的1.9倍數(shù),mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.87,P<0.05)。

A.培養(yǎng)56 d成蟲(chóng)進(jìn)行切割對(duì)頭頸節(jié)進(jìn)行采樣;B.培養(yǎng)56 d成蟲(chóng)進(jìn)行切割對(duì)蟲(chóng)體進(jìn)行采樣;C.兩種的樣本進(jìn)行RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)PLK-1基因mRNA表達(dá)量 (a:頭節(jié);b:成節(jié);c:生殖孔);標(biāo)尺:100 μm;**P<0.05。圖5 PLK1基因在Eg成蟲(chóng)不同部位mRNA表達(dá)水平(4×10)Fig.5 PLK1 mRNA relative transcription in different part of adult worm(4×10)

2.5 蟲(chóng)體免疫組化染色結(jié)果 為了進(jìn)一步對(duì)EgPLK1在幼蟲(chóng),成蟲(chóng)表達(dá)定位,我們將PSC, AW瓊脂糖固定的蟲(chóng)體石蠟切片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖6所示,圖6-A為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴;其中CU原頭蚴被膜; SU原頭蚴吸盤(pán);圖6-B為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng);可以看出,在幼蟲(chóng)階段,PLK1在原頭蚴蟲(chóng)體被膜低表達(dá),吸盤(pán)底部高表達(dá);在成蟲(chóng)階段,PLK1在成蟲(chóng)的頭頸節(jié)與幼節(jié)連接處出現(xiàn)帶狀陽(yáng)性區(qū)域,說(shuō)明成蟲(chóng)節(jié)片發(fā)育分化原發(fā)部位在頭頸節(jié)幼節(jié)連處。

A:a和c為對(duì)照組用正常小鼠血清探測(cè);b和d為用抗EgPLK1抗血清探測(cè)原頭蚴。B:a和e為用正常小鼠血清探測(cè)成蟲(chóng);b、c、d、f、g和h為用抗EgPLK1血清探測(cè)成蟲(chóng)。圖6 PLK1基因在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴,成蟲(chóng)不同部位表達(dá)定位(A.a-b, B.a-d:10×10;A.c-d, B.e-h:40×10)Fig.6 Probing PLK1 in protoscoleces (A) and adult worms (B) of E. granulosus with anti-EgPLK1 antibodies(A.a-b, B.a-d:10×10, A.c-d, B.e-h:40×10)

3 討 論

棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng)在犬腸道中發(fā)育的幾個(gè)關(guān)鍵步驟包括胃腸道溶液激活原頭蚴、原頭蚴外翻、頭節(jié)附著到腸壁、蟲(chóng)體分節(jié)、性器官發(fā)育和產(chǎn)卵[5]。這是在45 d內(nèi)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng)發(fā)育的一個(gè)復(fù)雜過(guò)程[5]。由于涉及倫理問(wèn)題和感染風(fēng)險(xiǎn),很難用犬作為動(dòng)物模型來(lái)研究棘球絳蟲(chóng)的發(fā)育。國(guó)外很多學(xué)者在長(zhǎng)達(dá)30多年的探索過(guò)程中也未能體外完全模擬整個(gè)體內(nèi)發(fā)育過(guò)程。Smyth等率先研究并探索出了適用于幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)階段的體外培養(yǎng)模型[19-22]。但我們用Smyth的方法,只有7%～10%的原頭蚴在培養(yǎng)的前兩周向成蟲(chóng)方向發(fā)展,以后大部分的蟲(chóng)體或向包囊方向發(fā)育,或死亡。本研究,通過(guò)對(duì)培養(yǎng)前原頭蚴的刺激處理和培養(yǎng)方式的優(yōu)化,使50%～90%的原頭蚴向成蟲(chóng)方向發(fā)育。成功地在56 d培養(yǎng)了含有4個(gè)體節(jié)的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng),與犬自然感染的發(fā)育時(shí)間相仿。比Smyth的67 d縮短了10 d,說(shuō)明培養(yǎng)體系優(yōu)于Smyth,接近自然感染的生長(zhǎng)速度。本研究中我們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)后14～21 d,蟲(chóng)體開(kāi)始分裂生成第一體節(jié)即幼節(jié),其中頸節(jié)與幼節(jié)分界是由蟲(chóng)體被膜折疊形成,頸節(jié)底部區(qū)域延伸,蟲(chóng)體被膜內(nèi)折形成一個(gè)新的節(jié)片。此后蟲(chóng)體發(fā)育和生長(zhǎng)速度較快。成蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程包括性器官的形成發(fā)生在此階段。這過(guò)程胚胎發(fā)育相關(guān)基因PLK1的研究對(duì)更好了解胚胎干細(xì)胞功能具有重大意義。在我們的研究中培養(yǎng)第21 d成蟲(chóng)活力較高,節(jié)律性伸縮明顯。培養(yǎng)第35 d表現(xiàn)為幼節(jié)持續(xù)增長(zhǎng),部分發(fā)育出第3節(jié)片即成節(jié);培養(yǎng)第45～50 d孕節(jié)出現(xiàn),但在培養(yǎng)至65 d蟲(chóng)體不能進(jìn)一步發(fā)育,未觀察到生殖器官明顯發(fā)育成熟或蟲(chóng)卵產(chǎn)生。

由于胚胎干細(xì)胞對(duì)棘球絳蟲(chóng)的無(wú)性繁殖具有決定性作用,在絳蟲(chóng)的整個(gè)生命周期中作為一個(gè)獨(dú)立的未分化細(xì)胞群,生殖細(xì)胞可視為棘球絳蟲(chóng)體細(xì)胞增殖的唯一來(lái)源[15]。棘球絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)期發(fā)育獨(dú)特,通過(guò)具有干細(xì)胞特性的生發(fā)層細(xì)胞的增殖而生長(zhǎng),也是通過(guò)生發(fā)層細(xì)胞的分化而生成原頭蚴,這是無(wú)性出芽繁殖的過(guò)程。在成蟲(chóng)的生長(zhǎng)過(guò)程中,鏈體的增殖是通過(guò)頭節(jié)下端的胚性細(xì)胞群的增生來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這種獨(dú)特的增殖潛能表明干細(xì)胞是全能的,并具有廣泛的自我更新能力[15]。在本研究通過(guò)精確定位PLK1在蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá),驗(yàn)證了胚性細(xì)胞群在蟲(chóng)體的具體分布。由于胚性細(xì)胞群本身在蟲(chóng)體內(nèi)起發(fā)育分化的主要功能,分布位置特殊,通過(guò)靶向藥物干預(yù)的方式達(dá)到更徹底的殺蟲(chóng)效果。因此它們對(duì)開(kāi)發(fā)化療藥物以防止寄生蟲(chóng)增殖具有最重要意義。

胚胎干細(xì)胞通常為絳蟲(chóng)的體細(xì)胞增殖提供全能干細(xì)胞[10],很早就有學(xué)者提出形成棘球蚴生發(fā)層(GL)的未分化細(xì)胞群負(fù)責(zé)宿主器官內(nèi)寄生蟲(chóng)幼蟲(chóng)的腫瘤樣浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。即使從生發(fā)層的正常組織環(huán)境中轉(zhuǎn)移,生發(fā)細(xì)胞也能夠產(chǎn)生新的組織[13],因此胚胎干細(xì)胞可成為在研究防止寄生蟲(chóng)增殖和轉(zhuǎn)移形成的抗棘球蚴藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

Schubert等人[14]篩選出棘球絳蟲(chóng)胚胎發(fā)育特異性表達(dá)基因PLKs基因家族,研究顯示EmPLK1可以特異性的調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的增殖。Kothe等人[23]先前鑒定了PLKs抑制劑BI 2536與人PLK1的特異性結(jié)合。這種最初設(shè)計(jì)用于抑制人類同源PLK1的化合物BI 2536在體外干擾棘球蚴幼蟲(chóng)的生發(fā)層胚胎干細(xì)胞并阻止了寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育。10 nmol/L劑量BI 2536處理的原頭節(jié)實(shí)驗(yàn)中胚胎干細(xì)胞的數(shù)量減少了50%[14],說(shuō)明EgPLK1可以作為藥物研發(fā)的靶蛋白。

有研究報(bào)道BI 2536在體外誘導(dǎo)曼氏血吸蟲(chóng)性腺的顯著變化并影響了卵子產(chǎn)生和精子發(fā)生[13]。本研究結(jié)果顯示,隨著體外培養(yǎng)天數(shù)的增加PLK1表達(dá)量升高,第35 d表達(dá)量為14 d時(shí)的8.2倍。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)體外培養(yǎng)35 d,PLK1表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于幼蟲(chóng)階段。35 d 時(shí)PLK1表達(dá)量明顯增高預(yù)示PLK1的表達(dá)與胚性細(xì)胞群的增殖與發(fā)育分化正相關(guān),蟲(chóng)體性器官發(fā)育趨勢(shì)可能與PLK1表達(dá)相關(guān),可能影響生殖器的發(fā)育成熟和精子的產(chǎn)生。結(jié)果顯示培養(yǎng)至56 d未能觀察到生殖器官明顯成熟特征。第35 d與56 d PLK1表達(dá)量變化不明顯,由于體外培養(yǎng)蟲(chóng)體性器官發(fā)育的滯后,PLK1表達(dá)量沒(méi)有進(jìn)一步升高。

對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭蚴,成蟲(chóng),包囊mRNA表達(dá)量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)包囊生發(fā)層PLK1表達(dá)量最高,為激活原頭蚴表達(dá)量的16.2倍。提示PLK1存在針對(duì)AE、CE病人特異性藥物研發(fā)的靶蛋白潛力。

有研究報(bào)道,多房棘球絳蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞增殖情況,證明了具有有絲分裂活性的寄生蟲(chóng)干細(xì)胞分布在整個(gè)胚層,并在幼蟲(chóng)囊和原頭節(jié)芽中大量積累。在晚期原頭節(jié)中,干細(xì)胞明顯位于發(fā)育中的吸盤(pán)底部,但也存在于頭頸后的體節(jié)[15]。本研究結(jié)果表明干細(xì)胞明顯位于發(fā)育中的原頭節(jié)的底部(吸盤(pán)的后面)。在成蟲(chóng)發(fā)育階段PLK1基因在蟲(chóng)體頭頸節(jié)片區(qū)域高表達(dá),這個(gè)區(qū)域是成蟲(chóng)節(jié)片增殖的唯一區(qū)域,成蟲(chóng)節(jié)片增殖是從頸節(jié)處胚胎干細(xì)胞層往遠(yuǎn)端生長(zhǎng)。即說(shuō)明干細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因PLK1可以作為兩型包蟲(chóng)病疫苗研發(fā)和治療新藥物靶點(diǎn),從而為兩型包蟲(chóng)病的治療提供新途徑。

總之,PLK1在包囊生發(fā)層細(xì)胞高表達(dá),提示PLK1為原始胚胎干細(xì)胞基因;體外培養(yǎng)的蟲(chóng)體分節(jié)片表達(dá)量迅速增加,可能由于蟲(chóng)體干細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂來(lái)對(duì)發(fā)育新節(jié)片提供機(jī)體所需功能細(xì)胞。生發(fā)細(xì)胞對(duì)棘球絳蟲(chóng)的無(wú)性繁殖起著決定性作用,因此胚胎干細(xì)胞可以成為開(kāi)發(fā)防止寄生蟲(chóng)增殖的化療藥物的最重要的細(xì)胞類型之一。通過(guò)體外培養(yǎng),可以獲得不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng),為研究干細(xì)胞基因表達(dá)以及基因干預(yù)提供材料,同時(shí)可為明確PLK1基因在成蟲(chóng)發(fā)育及蟲(chóng)卵產(chǎn)生中的功能,為犬用疫苗靶抗原奠定理論基礎(chǔ)。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:帕力塔吉·麥麥提祖農(nóng),吳川川,田夢(mèng)瀟,等.胚胎干細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因PLK1在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)體外不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2023,39(8):719-726. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.077