一株鵪鶉大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

趙洪杰

（山東省肥城市潮泉鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，山東 肥城 271614）

禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的禽多病型的總稱，嚴(yán)重者可導(dǎo)致病禽的死亡[1]。其中鵪鶉大腸桿菌病的發(fā)生無(wú)明顯的季節(jié)性，各日齡均可感染，飼養(yǎng)條件不良、飼養(yǎng)管理不善和應(yīng)激反應(yīng)等均可導(dǎo)致鵪鶉免疫力的下降，引發(fā)鵪鶉發(fā)病[2]，臨床表現(xiàn)為食欲不振、機(jī)體消瘦、羽毛蓬松、產(chǎn)蛋量下降，主要病理變化為多器官組織的實(shí)質(zhì)性損傷并伴有氣囊炎、心包炎、卵泡液化和卵黃性腹膜炎等癥狀。鵪鶉的大腸桿菌病感染率高，給鵪鶉養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。目前治療該病的主要手段為使用抗菌藥物，但隨著抗生素在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，致病性大腸桿菌對(duì)常用抗生素的耐藥性日益增強(qiáng)，多重耐藥性菌株不斷增多，為該病的防控和治療帶來(lái)困難[4]。因此，對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性分析，可為該病的藥物防治提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例來(lái)源 山東省一鵪鶉養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病死亡的42日齡產(chǎn)蛋鵪鶉。

1.1.2 主要儀器與試劑 MALDI-TOF質(zhì)譜儀（德國(guó)BRUKER）；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌藥敏試紙購(gòu)自杭州濱和微生物有限公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司。

圖1 剖檢病理變化A. 口腔有黏液；B. 氣管環(huán)出血；C. 心包炎；D. 腸黏膜脫落；E. 心包積液；F. 心臟干酪樣壞死。

圖2 細(xì)菌的分離鑒定及鏡檢結(jié)果A. 麥康凱培養(yǎng)基上培養(yǎng)形態(tài)；B. 可疑菌鏡檢圖片（1000 X）。

圖3 疑似菌落的質(zhì)譜測(cè)定

1.2 方法

1.2.1 病理剖檢觀察 對(duì)病死鵪鶉進(jìn)行病理剖檢，觀察各臟器的病理變化。

1.2.2 病原學(xué)檢測(cè) （1）細(xì)菌的分離培養(yǎng)。于超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌采集病死鵪鶉的肝臟，用滅菌接種環(huán)進(jìn)行取樣，分別劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h。（2）革蘭染色。挑取上述（1）步驟中培養(yǎng)基所長(zhǎng)菌落進(jìn)行革蘭染色，具體操作步驟參照北京索萊寶科技有限公司革蘭染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，染色后于顯微鏡下觀察細(xì)菌染色情況及形態(tài)特征。

1.2.3 質(zhì)譜測(cè)定 挑取麥康凱培養(yǎng)基上的單菌落，利用MALDI-TOF細(xì)菌質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 將分離到的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，然后稀釋均勻涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基，最后將藥敏試紙有序貼至培養(yǎng)基上，于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h，觀察抑菌效果。

2 結(jié)果

2.1 剖檢結(jié)果

剖檢可見(jiàn)病死鵪鶉機(jī)體干癟呈脫水狀，口腔嗉囊有黏液分泌，氣管環(huán)渾濁出血，腸道壁變薄，腸黏膜脫落，內(nèi)容物呈黃褐色，彌漫性條帶狀出血。卵泡液化變性，卵黃性腹膜炎，肝臟充血壞死，心臟、肝臟有纖維滲出、干酪樣分泌物。具體病變見(jiàn)圖1。

2.2 細(xì)菌的分離鑒定及鏡檢結(jié)果

將病料用接種環(huán)接種于麥康凱培養(yǎng)基上，可見(jiàn)粉紅色的菌落（圖2 A）。革蘭染色后于顯微鏡下觀察，見(jiàn)紅色短小桿狀菌（圖2 B），初步判斷為大腸桿菌。

2.3 細(xì)菌質(zhì)譜檢測(cè)

質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果顯示，麥康凱培養(yǎng)基上的紅色菌落為大腸桿菌。

2.4 藥敏結(jié)果

藥物敏感性試驗(yàn)見(jiàn)圖4，可見(jiàn)1、2、5、6、9、12號(hào)藥物周圍具有抑菌圈，結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表1所示，分離到的大腸桿菌對(duì)阿米卡星敏感，對(duì)慶大霉素、頭孢他啶、氨芐西林、頭孢噻吩、鏈霉素、頭孢噻肟、頭孢唑林、頭孢哌酮、氧氟沙星、卡那霉素和妥布霉素耐藥。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖4 大腸桿菌分離株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

鵪鶉是家禽中體型較小的品種，在國(guó)內(nèi)外家禽養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)重要地位，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。鵪鶉大腸桿菌病是由埃希氏大腸桿菌引起的鵪鶉常見(jiàn)病，各日齡鵪鶉均易感染發(fā)病，感染鵪鶉常表現(xiàn)為精神萎頓、羽松翅垂、閉眼昏睡、站立不穩(wěn)、食欲不振或廢絕、飲水增加、腹瀉下痢甚至死亡，同時(shí)對(duì)產(chǎn)蛋率及蛋的品質(zhì)影響很大，給鵪鶉養(yǎng)殖帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。大腸桿菌在環(huán)境中常在，且絕大多數(shù)大腸桿菌不會(huì)影響動(dòng)物的健康，但當(dāng)機(jī)體因各種原因出現(xiàn)免疫力下降和應(yīng)激等情況下，大腸桿菌就會(huì)成為影響動(dòng)物健康的“罪魁禍?zhǔn)住?。在?jīng)詢問(wèn)病史、臨床癥狀觀察及剖檢檢查后，初步確定發(fā)病原因?yàn)榇竽c桿菌感染。因此，采集病死雞肝臟進(jìn)行細(xì)菌的病原學(xué)檢測(cè)，分離物在特定培養(yǎng)基上的菌落特點(diǎn)及革蘭染色結(jié)果符合大腸桿菌的特征。常規(guī)的細(xì)菌鑒定方法可通過(guò)生化試驗(yàn)來(lái)確證，為實(shí)現(xiàn)疾病的及時(shí)診斷，采用微生物MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行了細(xì)菌的快速鑒定。微生物MALDI-TOF質(zhì)譜儀檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、通量高、靈敏度高、準(zhǔn)確度好的優(yōu)點(diǎn)[6]，在本次診斷中，將質(zhì)譜儀檢測(cè)運(yùn)用到大腸桿菌的鑒定中，快速獲得了陽(yáng)性結(jié)果，為疾病的控制贏得了時(shí)間。通過(guò)剖檢變化、細(xì)菌分離鑒定，特別是質(zhì)譜快速測(cè)定，該鵪鶉場(chǎng)產(chǎn)蛋鵪鶉大量死亡的原因可判定為致病性大腸桿菌的感染導(dǎo)致。建議飼養(yǎng)場(chǎng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保持籠舍干燥通風(fēng)，定期進(jìn)行消毒，同時(shí)減少對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激。

目前治療鵪鶉大腸桿菌病的常用方法為使用抗生素，但隨著抗生素在鵪鶉養(yǎng)殖中的廣泛應(yīng)用，大腸桿菌對(duì)常用抗生素的耐藥性日益增強(qiáng)，本試驗(yàn)對(duì)分離到的大腸桿菌做了藥物敏感性測(cè)定。結(jié)果顯示分離株只對(duì)阿米卡星敏感，對(duì)其他11種抗生素均耐藥，因此建議該飼養(yǎng)場(chǎng)可選擇阿米卡星進(jìn)行治療。

4 結(jié)論

本文利用臨床診斷、細(xì)菌分離鑒定，特別是質(zhì)譜快速測(cè)定方法，對(duì)發(fā)病產(chǎn)蛋鵪鶉的病原做了快速檢測(cè)，并分析了大腸桿菌分離菌株的藥物敏感性，為鵪鶉大腸桿菌病的及時(shí)防治提供了借鑒與參考。