豬肝中瘦肉精的TLC-SERS檢測方法研究

李露露 曹萌 李文婷 王若謹(jǐn) 許鳳

摘 要：目的：建立薄層色譜與表面增強拉曼光譜聯(lián)用技術(shù)檢測豬肝中3種瘦肉精的新方法。方法：先將鹽酸克侖特羅、鹽酸班布特羅和富馬酸福莫特羅等3種對照品及處理后的豬肝樣品分別用甲醇配制對照品溶液和供試品溶液，再建立薄層色譜分離系統(tǒng)，在254 nm下檢視定位后在相應(yīng)組分斑點處滴加表面增強劑銀溶膠后檢測其拉曼光譜，并對其進(jìn)行靈敏度驗證，最后對市售豬肝進(jìn)行檢測。結(jié)果：薄層色譜與表面增強拉曼光譜聯(lián)用技術(shù)可顯著增強拉曼光譜檢測信號。鹽酸克侖特羅、鹽酸班布特羅和富馬酸福莫特羅的檢測限分別為1 μg、0.5 μg和0.5 μg。結(jié)論：本法靈敏度高，為苯乙胺類擬腎上腺素藥物殘留物的鑒別技術(shù)提供了一種快速、高效的新方法。

關(guān)鍵詞：薄層色譜法；表面增強拉曼光譜法；瘦肉精

Abstract： Objective： To establish a new method for the detection of 3 kinds of lean meat powder in pig liver by thin-layer chromatography（TLC） and surface-enhanced Raman spectroscopy（SERS）. Method： Firstly， clenbuterol hydrochloride， bambuterol hydrochloride， formoterol fumarate and the treated pig liver samples were prepared with methanol as the reference solution and the test solution， and then a TLC separation system was established. After examining and positioning at 254 nm， the surface enhancer silver sol was added to the spots of the corresponding components to detect their Raman spectra and verify their sensitivity. Finally， the commercial pig liver was tested. Result： TLC combined with SERS could significantly enhance the detection signal of Raman spectrum. The detection limits of clenbuterol hydrochloride， bambuterol hydrochloride and formoterol fumarate were 1 μg， 0.5 μg and?0.5 μg， respectively. Conclusion： This method has high sensitivity， and provides a rapid and efficient new method for the identification of phenethylamines and adrenergic drug residues.

Keywords： thin-layer chromatography; surface-enhanced Raman spectroscopy; lean meat powder

瘦肉精是一種人工合成的β受體激動劑，學(xué)名鹽酸克侖特羅，它具有苯乙胺類擬腎上腺素藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)增加劑量可以達(dá)到重新分配動物體內(nèi)營養(yǎng)的作用，從而提高了豬的瘦肉率，但其在豬肉中的殘留也存在健康風(fēng)險[1]。中國和歐盟已經(jīng)禁止將它用作家畜的生長促進(jìn)劑。目前特布他林、沙丁胺醇、塞曼特羅、馬布林等10多種化合物統(tǒng)稱為瘦肉精。目前，對瘦肉精的檢測常用氣相色譜-質(zhì)譜法[2]和液相色譜-質(zhì)譜法等[3]。雖然這兩種方法具有精度高的優(yōu)勢，但要求由專門的工作人員操作，儀器設(shè)備也較昂貴等。薄層色譜法（Thin-Layer Chromatography，TLC）可以快速、高效地對微量物質(zhì)進(jìn)行分離，它是最簡單的色譜技術(shù)之一[4]，但易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。表面增強拉曼光譜法（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）具有較高的靈敏度，并可提供其表面分子的結(jié)構(gòu)信息[5]，但SERS不是分離技術(shù)，因此無法使用它來區(qū)分混合物中的幾種成分。豬肝中成分復(fù)雜，本研究采用TLC快速初篩，再采用SERS進(jìn)一步確認(rèn)，建立豬肝中的苯乙胺類擬腎上腺素藥物瘦肉精的TLC-SERS檢測的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

豬肝（市場隨機購買10批豬肝樣品，標(biāo)號為S1～S10）。

鹽酸克侖特羅（100072-201503，50 mg），鹽酸班布特羅（101009-200701，100 mg）和富馬酸福莫特羅（100633-202004，100 mg）均購自中國食品藥品檢定研究院；硝酸銀，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；檸檬酸鈉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸乙酯，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；甲醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；冰醋酸，天津市奧普升化工有限公司。

DXRxi顯微拉曼成像光譜儀（激光波長780 nm），Thermo Fisher Scientific，USA；超聲波清洗器，UP50南京壘君達(dá)超聲電子設(shè)備有限公司；60F254鋁制薄層板，德國默克公司；三用紫外燈（ZF-1S），紹興市蘇珀儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的制備

精密稱取鹽酸克侖特羅、鹽酸班布特羅和富馬酸福莫特羅3種對照品各2 mg，用甲醇溶解稀釋分別配成1 mg·mL-1的對照品溶液，密閉保存?zhèn)溆?。取少量豬肝樣品，攪碎。稱量10.00 g豬肝于50 mL燒杯中，分3次加入15 mL甲醇，超聲15 min后，棄去濾渣，將豬肝溶液置于15 mL棕色離心管中，置離心機（4 000 r·min-1，5 min）離心沉降，取上清液，蒸發(fā)至2 mL得供試品溶液，密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 銀溶膠的制備

用分析天平稱取37.8 mg硝酸銀溶于100 mL超純水中，放入微波爐中加熱至微沸后取出，一次性加入1%檸檬酸鈉溶液2.6 mL，混勻后繼續(xù)加熱2 min，冷卻，得到灰綠色溶膠。

1.2.3 TLC-SERS檢測方法

以硅膠60F254鋁制薄層板為固定相，乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸（9∶l∶2，V∶V∶V）為展開劑，分別點鹽酸班布特羅對照品溶液10 μL，鹽酸克侖特羅和富馬酸福莫特羅對照品溶液各3 μL，采用濾紙條飽和法飽和10 min，再在室溫下展開后取出，晾干，然后在254 nm的紫外燈下檢視各組分斑點。在薄層中分離出的成分斑點上以及樣品相同比移值（Rf）的位置原位滴加8 μL銀溶膠，原位采集拉曼光譜。拉曼光譜的采集條件如下。激發(fā)光源為780 nm，采用10倍顯微鏡，掃描范圍為300～3 500 cm-1，5.0 μm共聚焦針孔光闌，掃描方式為區(qū)域點掃，激光功率為24.0 mW，曝光時間為0.500 0 s，掃描25次。數(shù)據(jù)采集及分析軟件用OMNICxi；制圖軟件為Origin 6.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 TLC組分斑點的確定及對照品的SERS拉曼光譜檢測

按照“1.2.3”項下TLC條件操作，得到鹽酸克侖特羅、鹽酸班布特羅、富馬酸福莫特羅的斑點比移值（Rf）分別為0.69、0.18和0.54。分離出的成分斑點原位滴加8 μL銀溶膠，按照“1.2.3”項下拉曼光譜采集條件操作，得上述3種苯乙胺類擬腎上腺素藥物對照品的SERS，結(jié)果見圖1。3種瘦肉精成分結(jié)構(gòu)相似，但它們的SERS光譜峰形峰位不相同，可分別提供鹽酸克侖特羅、鹽酸班布特羅和富馬酸福莫特羅指紋結(jié)構(gòu)信息，可作為各組分的鑒別手段。

2.2 靈敏度考察

吸取鹽酸克侖特羅對照品溶液0.5 μL、1.0 μL、2.0 μL、4.0 μL、6.0 μL和8.0 μL（相當(dāng)于點樣沉積量0.5 μg、1.0 μg、2.0 μg、4.0 μg、6.0 μg和8.0 μg），按“1.2.3”的方法操作，得鹽酸克侖特羅的SERS圖，鹽酸班布特羅和富馬酸福莫特羅同法操作，結(jié)果見圖2。以信噪比（S/N）等于3時對應(yīng)的點樣量作為檢測限。鹽酸克侖特羅的檢測限為1 μg、鹽酸班布特羅和富馬酸福莫特羅的檢測限均為0.5 μg。

2.3 真實樣品檢測

取10批豬肝，按“1.2.1樣品溶液的制備”方法操作得到樣品溶液，再參照“1.2.3”進(jìn)行操作。根據(jù)樣品與對照品相同比移值處是否有斑點，初步判定1號樣品可能含有鹽酸克侖特羅、鹽酸班布特羅；2號樣品可能含有鹽酸克侖特羅、鹽酸班布特羅；3號樣品可能含有鹽酸克侖特羅；4號樣品可能含有鹽酸克侖特羅；5號樣品可能含有鹽酸克侖特羅、富馬酸福莫特羅；6號樣品可能含有鹽酸克侖特羅；7號樣品可能含有鹽酸克侖特羅；8號樣品可能含有鹽酸克侖特羅；9號樣品可能含有鹽酸克侖特羅；10號樣品可能含有鹽酸克侖特羅。為了避免TLC出現(xiàn)假陽性結(jié)果，考慮利用SERS光譜法進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果，可得3種對照品和樣品溶液的SERS圖。根據(jù)3種對照品及相同比移值處樣品的SERS圖中特征峰的峰形及峰位是否相同再次進(jìn)行確認(rèn)。由圖3可知，樣品4中含有鹽酸克侖特羅組分；樣品8中含有鹽酸班布特羅組分；樣品1中含有富馬酸莫特羅組分，其他樣品2、3、5、6、7、9、10中未檢出鹽酸克侖特羅、鹽酸班布特羅和富馬酸福莫特羅這3種組分。由TLC和SERS結(jié)果可說明TLC法出現(xiàn)了假陽性結(jié)果，且SERS法的靈敏度高于TLC法，即TLC法檢測不出來的組分，通過SERS法可檢出。

3 結(jié)論

本文首次建立了苯乙胺類擬腎上腺素藥物瘦肉精鹽酸克侖特羅、鹽酸班布特羅和富馬酸福莫特羅3種組分的TLC與SERS聯(lián)用的新的鑒別手段。在保證了TLC法檢測快速、操作簡便、靈敏度高的基礎(chǔ)上，通過與SERS技術(shù)聯(lián)用使其專屬性較傳統(tǒng)的TLC法有了顯著提高，為苯乙胺類擬腎上腺素藥物鑒別提供了一種新的思路與參考方法。

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