木瓜蛋白酶納米簇?zé)晒馓结樀墓x子檢測(cè)及其在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

曹 毅，許心愿，張進(jìn)浩，桂心平，王寶娟，2

（1.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.安徽省重要生物資源保護(hù)與利用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000）

引言

在早期工業(yè)化的發(fā)展中，我國多數(shù)河流和湖泊都曾受到汞的影響，且由于早期含汞農(nóng)藥的濫用，致使我國土壤中有相當(dāng)大一部分受到汞的污染。然而汞作為一種常見的、毒性強(qiáng)的重金屬在土壤中常以Hg2+形式存在，并在土壤微生物的共同作用下發(fā)生富集[1］，當(dāng)被生物攝入體內(nèi)后，會(huì)被轉(zhuǎn)化為毒性更高的甲基汞[2］，借助食物鏈進(jìn)一步加重毒性，具有高度的生物富集性且進(jìn)入人體后會(huì)破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，對(duì)人體健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響[3-4］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織規(guī)定，飲用水中的Hg2+含量不得超過29.9 μM，而中國國家飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定Hg2+含量不得超過5.0 μM，因此對(duì)Hg2+的靈敏檢測(cè)是極其必要的。現(xiàn)階段常用的Hg2+檢測(cè)方法有原子吸收光譜[5］、高效液相色譜法[6］、電化學(xué)檢測(cè)[7］等，然而這些方法通常需要復(fù)雜昂貴的設(shè)備、嚴(yán)格的樣品預(yù)處理、繁瑣耗時(shí)的檢測(cè)程序，難以實(shí)現(xiàn)Hg2+的快速檢測(cè)。

金屬納米簇（nanoclusters，NCs）是由幾個(gè)到幾十個(gè)原子與模板分子構(gòu)成的一種新型熒光納米傳感器，粒徑通常在2~3 nm左右[8］，由于其制備簡單、成本較低、操作方便、靈敏度較高等優(yōu)勢(shì)，在離子檢測(cè)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，逐漸引起研究者們的重視。目前，已經(jīng)成功報(bào)道的金屬納米簇包括金、銀、銅、鉑、鐵納米簇等[9-12］，除離子的種類在選擇上有所不同外，其模板也多種多樣，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、DNA等。其中，以具有不同氨基酸序列和空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)為模板制備的鉑納米簇因其良好的生物相容性、更高的光穩(wěn)定性以及潛在的催化能力而備受研究者們青睞。例如，Xia[13］等人利用牛血清蛋白（BSA）為模板成功合成了BSA-Pt NCs，并將其用于次氯酸的檢測(cè)中，線性檢測(cè)范圍為12~240 μM；Mei[14］等人利用牛血清蛋白（BSA）作為模板成功合成了BSA-Au NCs，利用Hg2+對(duì)BSA-Au NCs的淬滅作用達(dá)到檢測(cè)目的，檢測(cè)限為1 nM，回收率在97.00%~101.89%，具有良好的檢測(cè)效果。但是，到目前為止尚未有將鉑納米簇應(yīng)用于重金屬離子檢測(cè)的報(bào)道。

本文以木瓜蛋白酶（Papain）為穩(wěn)定劑和還原劑，采用“生物礦化法”制備以木瓜蛋白酶為模板的鉑納米簇（Papain-Pt NCs），利用暗箱四用紫外分析儀觀察其光學(xué)性質(zhì)以及紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)該探針的吸收光譜。隨后探究Papain-Pt NCs作為熒光探針對(duì)不同金屬離子檢測(cè)的特異性，選取具靈敏性的金屬離子并在環(huán)境樣品中檢驗(yàn)Papain-Pt NCs對(duì)該離子的實(shí)際檢測(cè)能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

木瓜蛋白酶和氫氧化鈉（NaOH）購自生工生物工程有限公司（上海）。六氯鉑酸（H2PtCl6·6H2O）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）。金屬離子（Mn2+、Mg2+、Na+、La2+、K+、Co2+、Cr3+、Li+、Zn2+、Hg2+、Ca2+、Bi3+、Pb2+、Ba2+、In3+、Al3+）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）且均為氯化物。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程用水均為Milli-Q過濾系統(tǒng)（Millipore，美國）處理的超純水（18.25 MΩ·cm）。如未特殊說明，所用試劑均為分析純，且未經(jīng)過進(jìn)一步純化處理。

1.2 Papain-Pt NCs的制備及鑒定

Papain-Pt NCs的配制參照本課題組已有研究[15］：將Papain與H2PtCl6水溶液按摩爾比為3.5:1充分混合，加入1M NaOH 調(diào)節(jié)pH=12，充分震蕩避光反應(yīng)36 h 使Pt4+與Papain 相互作用，反應(yīng)結(jié)束后8，000 rpm 離心5 min，取上清在截留分子量1，000 Da透析袋中透析24 h后得到Papain-Pt NCs，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

隨后取200 μL Papain-Pt NCs溶液于微量石英比色皿中，在暗箱四用紫外分析儀中觀察Papain-Pt NCs的光學(xué)性質(zhì)；取體積均為200 μL Papain-Pt NCs、Papain、H2PtCl6三種等濃度溶液于微量石英比色皿中，設(shè)置掃描波長范圍為200~500 nm，檢測(cè)其紫外吸收光譜。

將上述Papain-Pt NCs稀釋后，用10 μL移液槍將溶液滴于銅網(wǎng)中央，80 ℃烘干5 min，徹底去除銅網(wǎng)表面水分，利用透射電子顯微鏡（TEM）觀察Papain-Pt NCs的形貌特征。

1.3 金屬離子的選擇性與靈敏性檢測(cè)

為了評(píng)價(jià)Papain-Pt NCs對(duì)金屬離子的選擇性，使用超純水制備了16種濃度均為1 mM的金屬離子溶液。將金屬離子溶液（20 μL）、Papain-Pt NCs溶液（10 μL）和超純水（170 μL）作為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系在25 ℃下混合反應(yīng)5 min，并通過熒光分光光度計(jì)RF-5301PC檢測(cè)Papain-Pt NCs在490 nm處的發(fā)射強(qiáng)度，分別固定激發(fā)與發(fā)射的狹縫波長在5 nm和5 nm。對(duì)于靈敏性測(cè)定，將20 μL不同濃度的特異性金屬離子溶液（0~140 μM）加入到標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中，在25 ℃下反應(yīng)5 min后在相同條件下檢測(cè)Papain-Pt NCs的熒光強(qiáng)度。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次及以上。

1.4 對(duì)實(shí)際樣品中金屬離子濃度的檢測(cè)

水樣分別來自長江（蕪湖市濱江公園段）、蕪湖市鏡湖、安徽師范大學(xué)（中校區(qū)）自來水，土樣來自蕪湖市赭山、葡萄園。長江水、鏡湖水、自來水、赭山土、葡萄園土取樣后過濾得上清液，將上清液經(jīng)8，000 rpm離心5 min，再通過0.45 mm 膜濾器處理后供實(shí)驗(yàn)使用。長江水、自來水及鏡湖水樣品濾液樣品稀釋50 倍后用于金屬離子濃度的檢測(cè)，赭山土和葡萄園土濾液樣品稀釋200倍后用于金屬離子濃度的檢測(cè)。隨后在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中，將Papain-Pt NCs 溶液、經(jīng)過預(yù)處理后的水樣（或土樣）與特異性金屬離子溶液（濃度分別為20、40 和100 μM）混合，在25℃下孵育5 min 后使用熒光分光光度計(jì)記錄490 nm 處混合溶液的熒光強(qiáng)度并計(jì)算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果和討論

2.1 Papain-Pt NCs的鑒定

利用紫外-可見分光光度計(jì)研究Papain-Pt NCs、Papain 以及H2PtCl6的光譜性質(zhì)。Papain-Pt NCs 在300～350 nm 范圍內(nèi)具有較寬的吸收光譜，而Papain 和H2PtCl6在這個(gè)范圍內(nèi)沒有明顯的吸收帶（圖1 A）；合成的Papain-Pt NCs溶液在可見光下呈現(xiàn)淡黃色，在365 nm紫外燈下呈現(xiàn)顯著的綠色熒光（圖1 B）。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，我們成功合成了具有綠色熒光發(fā)射的Papain-Pt NCs新型納米熒光探針。進(jìn)一步利用透射電子顯微鏡對(duì)Papain-Pt NCs的表面形貌進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Papain-Pt NCs粒子呈球形，且分布均勻。

2.2 金屬離子的選擇性檢測(cè)

Hg2+在環(huán)境中的殘留嚴(yán)重影響了人類的身體健康，因此對(duì)環(huán)境中Hg2+含量的測(cè)定至關(guān)重要。為了評(píng)價(jià)Papain-Pt NCs對(duì)Hg2+的檢測(cè)性能，測(cè)定了Papain-Pt NCs與16種濃度均為1 mM金屬離子混合后的熒光強(qiáng)度（圖2）。值得注意的是，Papain-Pt NCs的熒光強(qiáng)度僅在Hg2+存在的情況被明顯淬滅，淬滅程度為84%，而其余金屬離子僅淬滅2%～11%。

圖2 (A)不同金屬離子與Papain-Pt NCs混合時(shí)的相對(duì)熒光強(qiáng)度（I/I0，其中I與I0分別為金屬離子存在和不存在下的熒光強(qiáng)度）；(B)365 nm紫外光照射下的不同金屬離子與Papain-Pt NCs混合溶液Fig.2 (A)Relative fluorescence intensity(I/I0)of Papain-Pt NCs when excited at 380 nm with various metal ions(I/I0，where I and I0 are the fluorescence intensity of Papain-Pt NCs in the presence and absence of various metal ions，respectively)；(B)Photographic image of Papain-Pt NCs solution upon the addition of various metal ions under UV light illumination at 365 nm

金屬納米簇的穩(wěn)定發(fā)光結(jié)構(gòu)依賴于金屬核與蛋白模板之間的共價(jià)鍵或是分子間作用力，基于彼此間的相互作用形成較穩(wěn)定的發(fā)光結(jié)構(gòu)，蛋白模板在這個(gè)過程的作用類似于自然界中的生物礦化作用[16］。因此，Hg2+對(duì)本金屬納米簇的淬滅效應(yīng)，有以下兩個(gè)可能的推測(cè)：一是Hg2+與金屬鎳之間的親金屬相互作用，競爭Papain-Pt NCs中的金屬核，導(dǎo)致熒光淬滅；二是Hg2+與木瓜蛋白酶巰基等負(fù)電基團(tuán)之間的相互作用，破壞了模板與金屬核之間穩(wěn)定的發(fā)光結(jié)構(gòu)，這種強(qiáng)烈的刻蝕作用致使熒光淬滅[14-15］。

2.3 Hg2+的靈敏性檢測(cè)

當(dāng)一系列濃度的Hg2+與Papain-Pt NCs混合，其熒光強(qiáng)度呈濃度依賴性減弱（圖3 A，圖3 B），在5～100 μM的濃度范圍內(nèi)加入Hg2+，線性回歸方程為y=4.52×10-3x+1.00482(R2=0.9919)（圖3 C）。根據(jù)3σ/S原則，計(jì)算得其檢測(cè)限為2.7 μM，其中σ表示空白信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S是線性擬合曲線的斜率。

圖3 (A)365 nm紫外光下不同濃度的Hg2+（0~140 μM）與Papain-Pt NCs的混合溶液；(B)Papain-Pt NCs與不同濃度的Hg2+（0～140 μM）混合后熒光強(qiáng)度；(C)不同濃度的Hg2+（5～100 μM）與混合后相對(duì)熒光強(qiáng)度（I0/I）之間的線性關(guān)系（其中I0為不加Hg2+的熒光強(qiáng)度，I為加不同濃度Hg2+的熒光強(qiáng)度）Fig.3 (A)Photographic image of Papain-Pt NCs solution upon the addition of Hg2+with a certain concentration gradient(from top to bottom:0～140 μM)under UV light illumination at 365 nm.(B)Fluorescence spectra of Papain-Pt NCs with various concentrations of Hg2+(from 0 to 140 μM)；(C)The linear relationship between I0/I and different concentrations of Hg2+(from 5 to 100 μM)

國家規(guī)定飲用水中的Hg2+含量不得超過5.0 μM，因此在復(fù)雜背景中實(shí)現(xiàn)Hg2+的靈敏性檢測(cè)至關(guān)重要。比較不同熒光法對(duì)Hg2+濃度的檢測(cè)（表1），相較于SBA-Pr-IS、RMTE，本研究的檢測(cè)限與之接近甚至更低，因此可實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的靈敏性檢測(cè)。相較于NSCD、N and S co-doped C-dots、TA-GNPs、Coumarin-boronic，盡管上述方法所提供的檢測(cè)限更低，但是本研究提供的熒光納米探針線性檢測(cè)范圍更寬，其應(yīng)用前景更廣闊。在實(shí)物檢測(cè)方面，七種方法的回收率并無明顯區(qū)別，在實(shí)際檢測(cè)中都具備較高的可信度。因此，本方案提供了一種檢測(cè)限低且檢測(cè)范圍更寬的生物傳感器，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表1 不同熒光方法對(duì)Hg2+濃度的線性檢測(cè)范圍及其檢測(cè)限比較Table 1 Comparison of linear detection ranges and detection limits of Hg2+concentrations by different fluorescence methods

2.4 環(huán)境樣品中Hg2+濃度的檢測(cè)

在實(shí)際環(huán)境樣品（例如水體、土樣）中對(duì)Hg2+濃度的靈敏性檢測(cè)十分必要，為了驗(yàn)證Papain-Pt NCs 作為熒光探針對(duì)實(shí)際環(huán)境樣品中Hg2+濃度檢測(cè)方法的可行性，通過加標(biāo)回收法測(cè)定水樣和土樣中的Hg2+濃度。3 種濃度的Hg2+溶液（20、40 和100 μM）分別加入到經(jīng)預(yù)處理后的土樣、水樣中，檢測(cè)并記錄對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，根據(jù)相對(duì)熒光強(qiáng)度與Hg2+濃度的線性回歸方程計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果如表2所示，在水樣和土樣中檢測(cè)的加標(biāo)回收率變化在可接受的良好范圍內(nèi)，為95.82%~109.20%。本研究為在復(fù)雜環(huán)境中檢測(cè)Hg2+提供了一種簡單的分析替代方案，具有較好的準(zhǔn)確性和精確度。

表2 實(shí)際樣品中Hg2+濃度的檢測(cè)Table 2 Detection of Hg2+concentration in actual samples

3 結(jié)論

綜上所述，我們開發(fā)了一種以Papain-Pt NCs為基礎(chǔ)的Hg2+熒光檢測(cè)方法，利用其熒光特性實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+的特異性及靈敏性檢測(cè)。Papain-Pt NCs在365 nm紫外燈下可發(fā)出綠色熒光，在300~350 nm范圍內(nèi)具有較寬的吸收光譜?；贖g2+對(duì)Papain-Pt NCs熒光的淬滅響應(yīng)，本研究發(fā)現(xiàn)該熒光傳感器具有優(yōu)異的靈敏性，檢測(cè)范圍在5~100 μM，檢測(cè)限為2.7 μM。此外，該生物傳感器驗(yàn)證了在長江水、鏡湖水、自來水、赭山土、葡萄園土中檢測(cè)Hg2+的可行性，回收率為95.82%~109.20%，實(shí)現(xiàn)了鉑納米簇在實(shí)際環(huán)境中對(duì)重金屬離子濃度的檢測(cè)，拓寬了鉑納米簇的應(yīng)用領(lǐng)域，為復(fù)雜環(huán)境樣品中的Hg2+濃度檢測(cè)提供了一種新方案。