CRISPR/dCas9-KRAB系統(tǒng)沉默豬LncRNA-NEAT1基因

趙為民, 戴超輝, 陳 哲, 涂 楓, 李 輝, 付言峰, 李碧俠, 任守文, 程金花

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所,江蘇 南京 210014; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái),江蘇 南京 210014; 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014)

長(zhǎng)鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA,LncRNA) 是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 bp的RNA。研究結(jié)果表明LncRNA參與了X染色體失活、胚胎發(fā)育、基因印記、癌癥、免疫等各種細(xì)胞生命活動(dòng)[1-5]。

近年來(lái)大量畜禽相關(guān)的LncRNA被鑒定出來(lái),這些LncRNA緊密參與了畜禽肌肉發(fā)育、免疫調(diào)控、繁殖等重要性狀[6-9],注釋和解析這些LncRNA的功能對(duì)進(jìn)一步挖掘調(diào)控畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀的功能元件具有深遠(yuǎn)意義。然而大多數(shù)LncRNA定位于細(xì)胞核,而RNAi的工作系統(tǒng)主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用,對(duì)定位于細(xì)胞核的LncRNA作用非常有限[10-12],這限制了LncRNA的功能解析。

CRISPRi系統(tǒng)通過(guò)核酸酶活性失活的Cas9(dCas9)和sgRNA的復(fù)合物結(jié)合到某個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Transcription start site,TSS)附近,物理性阻礙RNA聚合酶的通過(guò),從而導(dǎo)致基因沉默[13]。通過(guò)dCas9融合基因抑制結(jié)構(gòu)域如KRAB(Krüppel-associated box),形成dCas9-KRAB復(fù)合結(jié)構(gòu),可進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)錄抑制的效率[14-16]。Liu等[17]利用CRISPRi系統(tǒng)鑒定了數(shù)百個(gè)與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的LncRNA,Klann等[18]利用CRISPRi系統(tǒng)鑒定了大量與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的功能元件。CRISPRi系統(tǒng)在抑制基因表達(dá)上也呈現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性[19-20],是研究LncRNA功能的新一代工具。

LncRNA-NEAT1是在研究肌細(xì)胞分化時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼 RNA[21],其作為核心組分主要參與細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)旁斑(Paraspeckle)的形成,在細(xì)胞分化,癌癥發(fā)生和病毒感染等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[21-23]。本課題組前期研究結(jié)果表明豬LncRNA-NEAT1基因在脂蛋白刺激下表達(dá)顯著上調(diào),表明其在Toll樣受體2(Toll Like Receptor 2,TLR2)介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)中可能起到調(diào)控作用[24]。本研究利用CRISPR/dCas9-KRAB系統(tǒng)來(lái)抑制LncRNA-NEAT1基因的表達(dá),為后續(xù)進(jìn)一步研究其在先天性免疫反應(yīng)中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、菌株與質(zhì)粒

Trans5a感受態(tài)菌株購(gòu)于北京擎科生物科技有限公司,Lenti-dCas9-KRAB-blast載體由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)趙長(zhǎng)志惠贈(zèng),豬PK15細(xì)胞、px330載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒購(gòu)于南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司;DNA提取試劑盒、DNA marker購(gòu)于北京擎科生物科技有限公司;內(nèi)切酶BbsI、T7E1酶購(gòu)于NEB公司;PCR酶、T載體、末端轉(zhuǎn)移酶TdT、T4連接酶、qPCR試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司;無(wú)內(nèi)霉毒素質(zhì)粒試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司;Blasticidin S HCl (滅瘟素S)購(gòu)于南京碧云天生物技術(shù)有限公司;DNA純化回收試劑盒購(gòu)于Zymo ResearchZymo research_安諾倫(北京)生物科技有限公司公司;DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司;胎牛血清購(gòu)于Biological Industries (BI)公司;opti-MEM和LipofectamineTM3000 Transfection Reagent購(gòu)于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.3 豬LncRNA-NEAT1基因的亞細(xì)胞表達(dá)分布

待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%左右,胰酶消化細(xì)胞,用預(yù)冷PBS清洗兩遍后加入Buffer A(10 mmol/L tris-cl,10 mmol/L NaCl,0.5% IGEPAL? CA-630),冰上放置5 min,離心后上清液用于細(xì)胞質(zhì)RNA的提取。用Buffer A洗滌沉淀2次,沉淀用于細(xì)胞核RNA的提取。

1.4 豬LncRNA-NEAT1基因的5′末端快速擴(kuò)增(5′RACE)

基于前期測(cè)序獲得部分序列結(jié)果[24],LncRNA-NEAT1基因的5′末端快速擴(kuò)增過(guò)程如下:利用oligodT反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈,然后再利用TdT酶進(jìn)行5′末端dC-tailing,回收純化后,用引物5P(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGGGGGGGG-3′)和5′末端的特異性引物5′GSP(5′-CTGCCTCCCTCCTTCAGACAAAG-3′)擴(kuò)增其5′末端。 PCR擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,65 ℃(-0.5 ℃)45 s,72 ℃ 1 min,15個(gè)循環(huán);95 ℃ 1 min,60 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,20個(gè)循環(huán);72 ℃ 3 min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)DNA純化回收后與T載體連接,然后轉(zhuǎn)化Trans5a感受態(tài)細(xì)胞,后續(xù)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 LncRNA-NEAT1基因啟動(dòng)子區(qū)域的sgRNA設(shè)計(jì)

針對(duì)LncRNA-NEAT1基因啟動(dòng)子區(qū)(-300～0 bp)利用CRISPOR(http://crispor.tefor.net/)在線設(shè)計(jì)2對(duì)sgRNA。設(shè)計(jì)原則為選取cfdSpecScore>80,Doench′16-Score>50的sgRNA。

1.6 px330-sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建

依據(jù)sgRNA的序列合成反向互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸sgF和sgR,并在sgF的5′端添加CACCG,在sgR的5′端添加AAAC。95 ℃變性5 min,室溫冷卻,使sgF和sgR退火互補(bǔ)。BbsⅠ 酶切px330載體,回收純化后與退火的寡核苷酸連接,轉(zhuǎn)化Trans5a感受態(tài)細(xì)胞,后續(xù)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證與無(wú)內(nèi)霉毒素質(zhì)粒提取。

1.7 px330- sgRNA-dCas9-KRAB載體構(gòu)建

通過(guò)酶切px330載體,將Cas9序列替換為多克隆位點(diǎn),然后再將dCas9-KRAB-BSD插入到該多克隆位點(diǎn)。具體方法如下:首先以px330載體為模板,通過(guò)引物F:5′-TTGTACCGGTCGTACGGCTAGCCTCGAGAAGCTTGAATTCCTAGAGCTCGCTGA-3′和R:5′-GATGCGGCCGCTCCCCAGCAT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR產(chǎn)物包含引入了多個(gè)酶切位點(diǎn)(引物F下劃線部分)的bGH poly(A)片段。然后對(duì)PCR產(chǎn)物和px330載體分別進(jìn)行AgeⅠ和NotⅠ雙酶切并進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化Trans5a感受態(tài)細(xì)胞,后續(xù)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證與質(zhì)粒提取。此重組后的載體為px330-MCS。將篩選好的sgRNA先構(gòu)建到px330-MCS,為px330-sgRNA-MCS。然后對(duì)px330-sgRNA-MCS和Lenti-dCas9-KRAB-blast進(jìn)行BsiWⅠ和EcoRⅠ雙酶切,將Lenti-dCas9-KRAB-blast載體中的dCas9-KRAB-BSD連接到px330-sgRNA-MCS中,形成重組載體px330-sgRNA-dCas9-KRAB。

1.8 Blasticidin S篩選質(zhì)量濃度摸索

豬PK15細(xì)胞鋪板12孔板,24 h后待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右,分別添加0 μg/ml、1 μg/ml、3 μg/ml、4 μg/ml的Blasticidin S,每個(gè)質(zhì)量濃度處理3次重復(fù),每2 d換1次,在第7 d時(shí)觀察細(xì)胞的死亡情況,使細(xì)胞致死的最小劑量為后續(xù)的藥篩質(zhì)量濃度。

1.9 LncRNA-NEAT1基因的沉默

豬PK15細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前1 d鋪12孔板,轉(zhuǎn)染時(shí)密度大約70%。對(duì)照組轉(zhuǎn)染px330-dCas9-KRAB,實(shí)驗(yàn)組分別轉(zhuǎn)染px330-sgRNA1-dCas9-KRAB和px330-sgRNA2-dCas9-KRAB質(zhì)粒,48 h后,利用Blasticidin S篩選細(xì)胞7 d后進(jìn)行LncRNA-NEAT1基因的表達(dá)檢測(cè)。

1.10 定量PCR

1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用QuantStudio 5進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。對(duì)照組與試驗(yàn)組各3個(gè)生物學(xué)重復(fù),每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用三步法擴(kuò)增,程序簡(jiǎn)要如下:預(yù)變性95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用單因素方差分析各組之間的差異顯著性。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 豬LncRNA-NEAT1表達(dá)的亞細(xì)胞定位

利用低滲溶液將細(xì)胞總RNA分為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核RNA,RT-PCR結(jié)果顯示LncRNA-NEAT1表達(dá)于細(xì)胞核,在細(xì)胞質(zhì)中幾乎不表達(dá)(圖1)。HPRT作為細(xì)胞內(nèi)參基因,其在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄后會(huì)向細(xì)胞質(zhì)中運(yùn)輸,其mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)量多于細(xì)胞核。圖1結(jié)果顯示HPRT在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)量高于細(xì)胞核,符合其表達(dá)定位。

圖1 LncRNA-NEAT1在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中的表達(dá)Fig.1 Expression of LncRNA-NEAT1 in cytoplasm and nucleus

2.2 豬LncRNA-NEAT1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

為了確定LncRNA-NEAT1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),通過(guò)5′RACE對(duì)其5′端序列進(jìn)行了克隆,圖2結(jié)果顯示得到大約270 bp的條帶,與預(yù)期相符。

圖2 LncRNA-NEAT1的5′RACE擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 5′RACE amplification of LncRNA-NEAT1

2.3 豬LncRNA-NEAT1啟動(dòng)子區(qū)的sgRNA設(shè)計(jì)與效率驗(yàn)證

通過(guò)CRISPOR在線設(shè)計(jì)程序,對(duì)LncRNA-NEAT1啟動(dòng)子區(qū)(-300～0 bp)設(shè)計(jì)了2對(duì)sgRNA,分別為sgRNA1:5′-CCGAGGCGTCTCCTCAGACA-3′,PAM為GGG,位置約-200 bp,Doench 16-Score參數(shù)為63;sgRNA2:5′-GAGCAATGCCCCGGGTGACG-3′,PAM為CGG,位置約-150 bp,Doench 16-Score參數(shù)為63。

2.4 px330-sgRNA-dCas9-KRAB載體的酶切驗(yàn)證

圖3顯示構(gòu)建的px330-sgRNA-dCas9-KRAB經(jīng)過(guò)BsiWⅠ和EcoRⅠ雙酶切后,得到約4 200 bp的px330骨架和5 000 bp的dCas9-KRAB-BSD片段,與預(yù)期相符。

M:DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)樣品;1:px330-sgRNA1-dCas9-KRAB載體BsiWⅠ和Eco RⅠ雙酶切;2:px330-sgRNA2-dCas9-KRAB載體BsiWⅠ和Eco RⅠ雙酶切。圖3 px330-sgRNA-dCas9-KRAB質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 Identification of px330-sgRNA-dCas9-KRAB plasmid by enzyme digestion

2.5 Blasticidin S篩選質(zhì)量濃度的確定

圖4結(jié)果顯示,在加Blasticidin S培養(yǎng)7 d后,1 μg/ml質(zhì)量濃度Blasticidin S處理的細(xì)胞只有部分細(xì)胞死亡(圖4B),而3 μg/ml與4 μg/ml質(zhì)量濃度Blasticidin S處理的的細(xì)胞幾乎全部死亡(圖4C、圖4D),因此在后續(xù)的篩選中,Blasticidin S篩選質(zhì)量濃度為3 μg/ml。圖4A為陰性對(duì)照組,細(xì)胞生長(zhǎng)正常。

A:陰性對(duì)照組;B:1 μg/ml的Blasticidin S;C:3 μg/ml 的Blasticidin S;D:4 μg/ml 的Blasticidin S。圖4 不同質(zhì)量濃度Blasticidin S對(duì)細(xì)胞的致死效果Fig.4 The killing effect of different concentrations of Blasticidin S on cells

2.6 CRISPR/ dCas9-KRAB系統(tǒng)沉默豬LncRNA-NEAT1的表達(dá)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染px330-sgRNA-dCas9-KRAB(試驗(yàn)組)與px330-dCas9-KRAB(對(duì)照組)36 h后,添加Blasticidin S篩選細(xì)胞7 d,對(duì)LncRNA-NEAT1基因的表達(dá)進(jìn)行qPCR檢測(cè)。結(jié)果(圖5)顯示,與對(duì)照組相比,sgRNA1和sgRNA2分別使LncRNA-NEAT1表達(dá)下降了73%和55%,達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。圖5 sgRNA1和sgRNA2對(duì)LncRNA-NEAT1基因的沉默效果Fig.5 Silencing effect of sgRNA1 and sgRNA2 on LncRNA-NEAT1 gene

2.7 豬LncRNA-NEAT1啟動(dòng)子區(qū)的切割驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證CRISPR/ dCas9-KRAB系統(tǒng)中的sgRNA是否會(huì)切割其結(jié)合位點(diǎn),利用Sanger測(cè)序?qū)gRNA1和sgRNA2的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果(圖6)顯示試驗(yàn)組中sgRNA1和sgRNA2的結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)照組一致,其序列沒(méi)有發(fā)生堿基缺失或者插入。

圖6 豬LncRNA-NEAT1啟動(dòng)子區(qū)sgRNA結(jié)合位點(diǎn)的Sanger測(cè)序峰圖Fig.6 Sanger sequencing peak map of sgRNA binding sites in the promoter region of pig LncRNA-NEAT1

3 討 論

近年來(lái)隨著重測(cè)序以及功能基因組學(xué)的發(fā)展,豬相關(guān)的LncRNA與增強(qiáng)子等被大量鑒定出來(lái)[6,25]。CRISPRi與RNAi和CRISPR/dCas9敲除相比,在研究細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)的LncRNA或表達(dá)增強(qiáng)子(Enhancer-derived RNAs,eRNAs)上有著較大優(yōu)勢(shì)[12,15],并且也可以進(jìn)行高通量的篩選研究,為解析豬功能基因組以及挖掘重要調(diào)控元件奠定基礎(chǔ)。

LncRNA-NEAT1在最初發(fā)現(xiàn)時(shí)定位于小鼠肌細(xì)胞核內(nèi),作為核心組分主要參與細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)旁斑(Paraspeckle)的形成[21]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)豬LncRNA-NEAT1幾乎只表達(dá)于細(xì)胞核,表明LncRNA-NEAT1的表達(dá)定位在物種間相對(duì)保守。由于Lenti-dCas9-KRAB-blast載體較大(約14 kb),如果再聯(lián)合轉(zhuǎn)染sgRNA表達(dá)載體,會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低,從而會(huì)影響基因沉默效果。本研究通過(guò)酶切與亞克隆構(gòu)建了px330-sgRNA-dCas9-KRAB這種“All-in-one”載體,將sgRNA和dCas9-KRAB表達(dá)元件都整合到一個(gè)載體,大幅度縮減了載體,提高了表達(dá)效率[26-27],從而進(jìn)一步提升沉默效果。

位于TSS不同位置的sgRNA對(duì)CRISPR/ dCas9-KRAB的沉默效果具有決定性作用[15,28]。因此本研究首先利用5′RACE確定了LncRNA-NEAT1的TSS。由于大多數(shù)編碼LncRNA基因,其表達(dá)水平相對(duì)于編碼蛋白基因較低[29-31], 確定這些重要而表達(dá)水平較低的LncRNA的TSS并不容易,這也是利用CRISPR/dCas9-KRAB系統(tǒng)沉默LncRNA一個(gè)限制因素。

TSS附近啟動(dòng)子區(qū)對(duì)基因表達(dá)水平有重要影響,其區(qū)域內(nèi)堿基的刪除或插入會(huì)影響其基因的表達(dá)[32-34]。盡管dCas9呈現(xiàn)失活的狀態(tài),并不會(huì)切割sgRNA的結(jié)合位點(diǎn)[13],為了進(jìn)一步驗(yàn)證LncRNA-NEAT1的表達(dá)下調(diào)不是由于sgRNA切割TSS附近啟動(dòng)子區(qū)造成的,本研究利用Sanger測(cè)序?qū)υ囼?yàn)組sgRNA的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行序列分析,結(jié)果顯示其結(jié)合位點(diǎn)并沒(méi)有發(fā)生刪除或者插入,表明LncRNA-NEAT1的表達(dá)下調(diào)是通過(guò)CRISPR/dCas9-KRAB系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

本研究獲得了LncRNA-NEAT1基因的TSS位點(diǎn),在其附近啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了2對(duì)有效sgRNA,通過(guò)構(gòu)建“All-in-one”載體,利用CRISPR/dCas9-KRAB系統(tǒng)有效沉默了豬LncRNA-NEAT1基因的表達(dá)。