廣譜抗稻瘟病水稻保持系贛香B的抗性遺傳解析

陳明亮 熊文濤 沈雨民 熊煥金 羅世友 吳小燕 胡蘭香 肖葉青, *

廣譜抗稻瘟病水稻保持系贛香B的抗性遺傳解析

陳明亮1, 2熊文濤1, 2沈雨民1, 2熊煥金1, 2羅世友1, 2吳小燕1, 2胡蘭香1, 2肖葉青1, 2, *

[1江西省農(nóng)業(yè)科學院 水稻研究所, 南昌 330200；2水稻國家工程研究中心(南昌)/國家水稻改良中心 南昌分中心，南昌 330200；*通信聯(lián)系人，email: xiaoyq1965@163.com]

【目的】贛香B是江西省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所育成的水稻野敗型保持系，在江西、福建、貴州、湖北和浙江等多地都表現(xiàn)較強的稻瘟病廣譜抗性。對贛香B的稻瘟病抗性位點的遺傳解析，有助于今后稻瘟病抗性育種工作?！痉椒ā客ㄟ^抗感株系基因組比較、稻瘟病抗性位點標記檢測、抗性位點測序和片段代換系表型鑒定，分析贛香B中的稻瘟病抗性基因位點。【結果】贛香B中含稻瘟病抗性基因、和。在稻瘟病高感株系中導入后，抗性得到顯著增強；而導入或者后，抗性略微增強或者沒有顯著效果?！窘Y論】贛香B攜帶多個稻瘟病抗性基因，其中，是主效抗性基因，表現(xiàn)出廣譜稻瘟病抗性。

稻瘟?。豢剐?；遺傳解析

稻瘟病（Rice blast）是水稻上最嚴重的病害之一，可造成水稻減產(chǎn)10%～20%，嚴重時可導致絕收。但稻瘟病病原菌的遺傳結構復雜，生理小種變異快，攜帶單一抗性基因水稻品種的抗性一般僅能維持3～5年[1]。培育具有廣譜持久抗性的抗瘟品種是水稻育種的長期目標。

水稻稻瘟病抗性遺傳復雜。目前，水稻中鑒定了500多個抗稻瘟病QTL，100多個抗稻瘟病基因或位點，克隆了37個基因[2]。其中，3個較大的抗病基因簇分別分布在水稻第6、11、12染色體上。在第6染色體上的短臂近著絲粒附近有一個大的抗稻瘟病基因簇，包含位點上的多個復等位基因；在第11染色體長臂近末端區(qū)域存在一個大基因簇，包含位點上的多個復等位基因；在第12染色體著絲粒附近存在一個大基因簇，其中包含[3]。除此之外，第1染色體上也存在一個由、、等組成的基因簇[4-6]。多項研究結果表明位于第6染色體的、、等和位于第11染色體的等具有穩(wěn)定廣譜抗性，在生產(chǎn)上有較大應用價值[3, 7]。

廣譜抗稻瘟病材料通常具有少數(shù)主效廣譜抗性基因和多個微效抗性基因，其中主效廣譜抗性基因具有決定作用，而微效基因起輔助和累加作用。湘資3150攜帶有主效基因（等位）和（等位）[8]；中早39攜帶有主效基因、和等[9]；特特普含有主效基因、和等[10-12]；谷梅4號含有2個主效基因和、等[7, 13]。主效廣譜抗病基因通過分子標記選擇技術或全基因組選擇導入育種材料中，極大推動了稻瘟病抗性育種。在恢復系綿恢725中導入后育成的綿恢6725，具有較好的稻瘟病抗性[14]。在粳稻鹽豐47中導入和、后，育成了具有較強稻瘟病抗性的超級稻品種鹽粳144[15]?；吹?號在導入后，也表現(xiàn)出較強的稻瘟病抗性[16]。

贛香B是江西省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所用03B、IR58025B、金23B、新露B、和江2B等5個具不同優(yōu)良特性的保持系復交，經(jīng)過了多年的稻瘟病自然誘發(fā)及人工接種篩選選育而成的三系保持系，在江西、福建、貴州、湖北和浙江等地自然誘發(fā)和接種鑒定中都表現(xiàn)出較好的抗性，已有十多個雜交組合在南方稻區(qū)品種區(qū)域試驗中通過審定[17]。通過對贛香B中的稻瘟病抗性位點的遺傳解析，明確其中的主效稻瘟病抗性基因，有助于今后稻瘟病抗性育種工作。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

抗稻瘟病材料贛香B及其親本，各抗性位點的陽性對照材料為本實驗室保存，感病株系IL5133篩選自前期構建的野生稻/贛香B近等基因導入系群體[18]。

利用IL5133與贛香B進行雜交，構建重組自交系，在F6代用各標記(表1)檢測挑選出含有不同抗性位點的株系，每個抗性位點組合隨機挑取3個株系，每個株系種植3個重復進行穗頸瘟抗性鑒定。

表1 本研究用于各抗性基因檢測的標記引物

將贛香B與早熟高感材料ZJZ18進行雜交，以ZJZ18為輪回親本回交1次，用不同抗性位點標記進行檢測，挑選BC1F5株系，每個抗性位點組合隨機挑取3個株系，每個株系種植3個重復進行穗頸瘟抗性鑒定。

1.2 DNA提取及標記檢測

DNA提取用CTAB法完成。一般標記的檢測方法：PCR體系總體積為20 μL，其中DNA模板1 μL，正、反引物(10 μmol/L)各0.5 μL，2×混合液10 μL，滅菌雙蒸水8 μL。PCR擴增程序：95℃下預變性5 min；94℃下變性30～60 s，55℃下退火30～60 s，72℃下延伸30～240 s，共40個循環(huán)；72℃下延伸10 min后4℃下保存。PCR產(chǎn)物根據(jù)產(chǎn)物片段大小用1%瓊脂糖凝膠（EB染色）或8%丙烯酰胺（銀染）電泳分離觀察拍照。

KASP標記的驗證和檢測由華智公司用美國Douglas Scientific公司的Array Tape系統(tǒng)完成。PCR完成后用ARAYA進行反應體系熒光信號掃描；然后用INTELLICS進行基因型分型和數(shù)據(jù)分析。

1.3 稻瘟病抗性位點的鑒定

取贛香B和感病株系IL5133葉片，提取DNA后通過華智1K mGPS水稻SNP芯片進行檢測，對4937個SNP位點進行基因分型，比較基因組差異并進行染色體作圖。

根據(jù)前人的研究報道，本研究對和等稻瘟病抗性位點進行檢測。贛香B與株系IL5133中位點差異標記由華智公司篩選出KASP標記K_110583和K_110585，用于重組自交系中該位點的檢測。

為了確認位點抗性基因，針對該基因簇中的、和進行擴增測序。本研究中所用相關標記引物見表1。

1.4 稻瘟病穗頸瘟表型鑒定

在井岡山稻瘟病鑒定基地自然誘發(fā)穗頸瘟，挑選帶有不同抗性遺傳位點且抽穗期與贛香B接近的株系，于2020年和2021年分別種植于井岡山鑒定基地，5月下旬播種，6月下旬移栽，每個重復種移栽100～120株水稻苗，在水稻蠟熟期調查穗頸瘟發(fā)病率[26]。

A為感病株系IL5133與贛香B表型，IL5133出現(xiàn)嚴重的穗頸瘟，贛香B沒有穗頸瘟；B為IL5133與贛香B基因組比較，藍色表示兩者基因組一致位點，紅色表示差異位點，圓圈表示可能存在差異的稻瘟病抗性位點。

Fig. 1. Comparison of phenotype and genome between susceptible line IL5133 and Ganxiang B.

泳道1～6分別為贛香B、IR58025B、金23B、江2B、新露B和03B；圖A～H中各抗性位點陽性對照材料CK分別為IRBLt-K59、日本晴、特特普、特特普、IRBLa-A、鎮(zhèn)稻18、IRBLb-B和華占。

Fig. 2. Validation of the molecular markers in Ganxiang B and its parents.

2 結果與分析

2.1 贛香B稻瘟病抗性位點的確認

利用前期構建的一套野生稻/贛香B近等基因導入系群體，經(jīng)過多年井岡山稻瘟病病區(qū)自然誘發(fā)，篩選出1個稻瘟病高感株系IL5133，生育期與贛香B相近，多年發(fā)生毀滅性穗頸瘟。該感病株系與贛香B進行基因組差異分析，與已報道的稻瘟病抗性基因基因組分布進行比較，在和等稻瘟病抗性位點上可能存在基因型差異（圖1）。

用上述有差異稻瘟病抗性位點（加上過去曾報道贛香B中存在的位點）的分子標記，與已報道攜帶相應抗性位點的陽性材料進行比較，贛香B攜帶和等抗性位點（圖2）。與贛香B的親本材料比較可知，位點來自江2B或者03B，基因普遍存在于親本材料中，抗性位點來自江2B（表2）。

在第1染色體上、、抗性基因位置極為接近，與是等位基因，目前的分子標記暫時無法區(qū)分這幾個基因。為了明確抗性基因，對贛香B中該抗性位點進行測序分析。從贛香B中克隆獲得的長為4474 bp，長為4356 bp，長為4406 bp，測序比對所有擴增片段均與日本晴中的序列相似度為100%。日本晴中已證明存在，而不存在、和，由此可以排除其他抗性基因，確定贛香B中該位點的抗性功能基因為。

擴增位點片段進行測序比對，與相似度為100%，確認贛香B中存在基因。

抗性位點的標記檢測需要同時檢測到CKM1和CKM2才能具有抗性。標記檢測在贛香B中沒有檢測到CKM1標記，位點應該沒有抗性功能，但位點存在豐富的序列變異，通過序列比較很難確定贛香B中該位點是否具有抗性功能，需要進一步的抗性鑒定來確認。

表2 抗性基因在贛香B及其親本中的分布

2.2 贛香B稻瘟病抗性位點抗性確認

為了確認贛香B中的主效抗性基因，從高感株系IL5133和贛香B構建的重組自交系中通過分子標記在每個抗性位點組合中挑選3個株系，于2020年和2021年在井岡山稻瘟病病區(qū)進行自然誘發(fā)，僅攜帶基因或位點株系的穗頸瘟發(fā)病率與高感株系類似，發(fā)病率均在90%。這同時證明贛香B中的位點不具有抗性功能；攜帶基因株系穗頸瘟發(fā)病率下降至50%左右；攜帶基因株系穗頸瘟發(fā)病率均在10%以下；同時攜帶基因和基因的株系基本未發(fā)生穗頸瘟（圖3）。這表明基因是贛香B的主效稻瘟病抗性基因，基因具有一定的抗性效果。

2.3 分子標記輔助培育抗稻瘟病材料

通過分子標記將贛香B中稻瘟病抗性基因導入早熟稻瘟病高感材料ZJZ18，2021年在井岡山自然誘發(fā)進行稻瘟病鑒定，ZJZ18穗頸瘟發(fā)病率在90%左右；攜帶基因株系穗頸瘟發(fā)病率均在10%左右；而攜帶基因和基因的株系和贛香B一樣，基本沒有感染穗頸瘟（圖4）。

1, GXB; 2, IL5133; 3, IL-Pia; 4, IL-Pik; 5, IL-Pita; 6, IL-Pia+Pita; 7, IL-Pia+Pik+Pita; 8, IL-Pish; 9, IL-Pia+Pish; 10, IL-Pish+Pita; 11, IL-Pia+Pish+Pita.

Fig. 3. Resistance to panicle blast of lines with different resistance loci from Ganxiang B(GXB) at Jinggangshan City, Hunan Province.

A為不同株系穗頸瘟表現(xiàn)，B為不同株系穗頸瘟發(fā)病率。

Fig. 4. Resistance of backcrossed ZJZ18 lines.

3 討論

水稻野敗型保持系贛香B具有廣譜稻瘟病抗性，在南方稻區(qū)大部分地區(qū)表現(xiàn)出較好的稻瘟病抗性，已有十多個雜交組合在南方稻區(qū)得到審定。本研究表明贛香B具有多個稻瘟病抗性基因，、和，在井岡山自然誘發(fā)區(qū)穗頸瘟鑒定結果中表現(xiàn)出較強的廣譜抗性，具有一定的抗性效果，而基本喪失抗性。由于稻瘟病抗性鑒定手段的局限，可能遺漏其他抗性位點，但在稻瘟病自然誘發(fā)的鑒定結果說明即使還含有其他抗性位點，也很難產(chǎn)生明顯的稻瘟病抗性，在育種生產(chǎn)上利用價值較小。

首先克隆自日本晴反轉座子突變體，該基因編碼一個包含核苷酸結合位點和富含亮氨酸重復序列（NBS-LRR）蛋白，該基因的缺失突變導致日本晴稻瘟病抗性下降[27]。廣泛存在于粳稻中，能在80.5%的粳稻材料中被檢測到，但僅在2.3%的秈稻材料中檢測到。對泰國、菲律賓稻瘟病生理小種具有廣譜稻瘟病抗性的Jao Hom Nin和對國內外稻瘟病生理小種具有廣譜稻瘟病抗性的Oochikara，均檢測到了抗性基因[24, 28]。該基因對分離自粳稻的稻瘟病小種的抗性頻率為23.2%，對分離自秈稻的小種的抗性頻率為63.2%。將粳稻中導入秈稻后，能夠增加的抗性頻率為23.0%～62.2%[29]。本研究中在高感株系IL5133和ZJZ18導入贛香B的基因后，在井岡山自然誘發(fā)表現(xiàn)為抗病。這些都表明當前基因在南方秈稻的抗稻瘟病育種中尚具有較好的應用價值。目前水稻材料的稻瘟病抗性基因篩查研究，尤其是秈稻，對位點的檢測不夠充分，在今后稻瘟病抗性材料研究中有必要進行更加全面的篩查。

我國秈稻和粳稻種植有顯著的區(qū)域性，分別具有不同的主流稻瘟病抗性基因。在長期與水稻的適應進化過程中，稻瘟病生理小種產(chǎn)生了定向選擇壓力，對同區(qū)域的主流抗性基因產(chǎn)生了適應，而對非本區(qū)域的其他抗性基因適應力仍較差[30]。與主要分布在粳稻中，對秈稻中具有較強稻瘟病抗性相類似，也存在同樣的現(xiàn)象。對分離自秈稻的稻瘟病小種抗譜為70.21%，對分離自粳稻的稻瘟病小種則表現(xiàn)為敏感[4]。與之相反，主要分布于秈稻，存在于90.6%的秈稻材料和18.8%的粳稻材料中。在江蘇分離自粳稻的稻瘟病小種接種實驗中，可顯著提高水稻的穗頸瘟抗性，而所有攜帶了+雙基因的材料抗性均達到了抗病或高抗，在粳稻區(qū)仍具有應用價值[31]。但在本研究中，攜帶有或+的IL5133和ZJZ18株系在井岡山出現(xiàn)嚴重的穗頸瘟，表明或+抗性基因/組合已被秈稻上的稻瘟病生理小種適應，在秈稻區(qū)效果不佳。

贛香B中同時具有抗秈稻稻瘟病生理小種的和抗粳稻生理小種的+基因組合，對于稻瘟病具有廣譜的抗性，豐富了稻瘟病抗性分子育種的抗性基因組合，是下一步稻瘟病抗性育種的優(yōu)良親本材料，其選育后代贛73B和贛蓮B攜帶該稻瘟病抗性基因組合，同樣表現(xiàn)出較好的稻瘟病抗性[32, 33]。但目前我國南方稻區(qū)正在大力進行當?shù)貎?yōu)質粳稻品種選育及推廣，秈粳混合種植區(qū)日益擴大，生理小種也在發(fā)生變化，++的抗性基因組合有抗性減弱甚至喪失的可能，今后需要繼續(xù)利用其他廣譜稻瘟病抗性位點、等。

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Genetic Dissection of Broad Spectrum Resistance of the Rice Maintainer Ganxiang B

CHEN Mingliang1, 2, XIONG Wentao1, 2, SHEN Yumin1, 2, XIONG Huanjin1, 2, LUO Shiyou1, 2, WU Xiaoyan1, 2, HU Lanxiang1, 2, XIAO Yeqing1, 2,*

[1Rice Research Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China;2Rice National Engineering Research Center (Nanchang) / Nanchang Sub-center, National Rice Improvement Center, Nanchang 330200, China;*Corresponding author, email: xiaoyq1965@163.com]

【Objective】Ganxiang B is a WA type rice maintainer line developed by the Rice Research Institute of Jiangxi Academy of Agricultural Sciences. It shows broad spectrum resistance against rice blast in Jiangxi, Fujian, Guizhou, Hubei, and Zhejiang Provinces. Genetic analysis of blast resistance loci in GanxiangB will contribute to the future work for blast resistance breeding. 【Method】The rice blast resistanceloci in Ganxiang B were analyzed by genome comparison between resistant and susceptible lines, marker detection of rice blast resistance locus, resistance genesequencing, and phenotypic identification of segment substitution lines. 【Results】There were resistance genes,, andin Ganxiang B. After introgressed with, the blast resistance of highly susceptible line was significantly enhanced. However, after introgressed withor, the resistance was slightly enhanced or remained unchanged.【Conclusion】Ganxiang B carries several blast resistance genes. Among them,is the main resistant gene, showingbroad resistance to rice blast.

rice blast; resistance; genetic dissection

10.16819/j.1001-7216.2023.221105

2022-11-10;

2022-12-02。

江西省重點研發(fā)計劃項目（20203ABC28W013）；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技協(xié)同創(chuàng)新專項重大項目（JXXTCX202201）