一個玉米ZmMs7復(fù)等位基因突變體的遺傳分析與分子鑒定

曹梟雄 劉伊凡 周玉強 王 婧 吳宇錦 王紅武 李 坤 劉小剛 黃長玲 劉志芳 郭晉杰 胡小嬌,*

一個玉米復(fù)等位基因突變體的遺傳分析與分子鑒定

曹梟雄1,2劉伊凡1,2周玉強2王 婧2吳宇錦2王紅武2李 坤2劉小剛2黃長玲2劉志芳2郭晉杰1,*胡小嬌2,*

1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 國家玉米改良中心河北分中心 / 華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室, 河北保定 071001;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 作物分子育種國家工程研究中心, 北京 100081

我們在自然群體中發(fā)現(xiàn)了一個玉米雄性不育突變體(), 命名為。該突變體雄花育性徹底喪失, 花藥干癟皺縮, 沒有花粉形成。細(xì)胞學(xué)分析發(fā)現(xiàn), 與野生型相比,突變體花藥在S11期表現(xiàn)出明顯的藥室收縮, 絨氈層細(xì)胞腫脹, 小孢子破裂的表型, 表明突變體絨氈層細(xì)胞程序性死亡出現(xiàn)異常, 且花粉敗育。遺傳分析表明該不育性狀受單個隱性核基因控制。為克隆目標(biāo)基因, 以為母本分別與不同自交系雜交構(gòu)建F2定位群體, 利用靶向測序技術(shù)(GBTS)分析群體基因型, 將基因定位于7號染色體124.95～128.47 Mb之間, 進(jìn)一步精細(xì)定位將該區(qū)間縮小到0.68 Mb。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn), 該區(qū)間存在一個已知基因?；蚓幋aPHD-finger轉(zhuǎn)錄因子, 在絨氈層發(fā)育和花粉外壁的形成過程中發(fā)揮重要作用。等位測驗分析發(fā)現(xiàn)為基因的等位突變體?；驕y序結(jié)果表明突變體在外顯子區(qū)存在多處序列變異, 與所報道的基因已知突變體和的突變方式不同, 證明是一個新的基因等位突變體。突變體的發(fā)現(xiàn)與鑒定為探討玉米核雄性不育的分子機(jī)制以及育種應(yīng)用提供了新的材料。

玉米; 雄性不育;; 基因定位; 等位突變

玉米是全球第一大糧食作物, 也是雜種優(yōu)勢利用最成功的作物。雜交種在生長勢、生活力、抗逆性、產(chǎn)量和品質(zhì)上顯著優(yōu)于2個親本, 因此廣泛應(yīng)用于玉米生產(chǎn)[1]。目前, 玉米雜交制種主要利用人工或機(jī)械去除母本雄穗不但費時費力成本高, 且不利于植物生長, 從而降低雜交種的產(chǎn)量[2]。利用玉米雄性不育系生產(chǎn)玉米雜交種可以有效解決以上問題。雄性不育可分為細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)和細(xì)胞核雄性不育(GMS)[3], CMS又稱為核質(zhì)互作雄性不育, 以CMS為基礎(chǔ)的三系制種已成功應(yīng)用于多種作物的雜交制種, 但是CMS材料存在表型不穩(wěn)定、易受病原小種?；腥尽⒒謴?fù)系少等缺點[3-4], 限制了CMS材料的應(yīng)用。GMS育性由核基因控制, 可以克服CMS的缺陷, 具有巨大的育種應(yīng)用潛力。雖然GMS不育系存在保持和繁種困難的問題, 但是隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展, 轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用, 有望將隱性核不育基因有效利用起來[5]。

在擬南芥和水稻中, 已有大量研究解析了調(diào)控花藥和花粉發(fā)育的過程[6-7], 同時也揭示了14個花藥的發(fā)育階段。與水稻花藥發(fā)育過程相比, 玉米花藥發(fā)育的變化與其高度一致, 同樣也可劃分為14個時期?；ㄋ幍陌l(fā)育從雄蕊原基開始, 經(jīng)過一系列分裂分化, 花藥從最外層到最內(nèi)層形成表皮層、內(nèi)皮層、中間層和絨氈層4個典型層。絨氈層是4層壁細(xì)胞中代謝最為活躍的一層, 在植物體小孢子發(fā)育過程中有非常關(guān)鍵的作用[8]。在小孢子發(fā)育的前期, 絨氈層細(xì)胞會給花粉母細(xì)胞提供大分子物質(zhì)及營養(yǎng)供給以促進(jìn)其發(fā)育[9-10]; 在小孢子發(fā)育中期會分泌花粉外壁前體, 如孢粉素是構(gòu)成花粉壁和花藥表皮角質(zhì)層的重要物質(zhì)[11]; 在小孢子發(fā)育后期絨氈層會分泌花粉外殼或含油層[12-14]。而絨氈層細(xì)胞程序性死亡(PCD)也會為小孢子的發(fā)育提供蛋白質(zhì)、脂類等營養(yǎng)物質(zhì), 對于花粉的形成、成熟以及育性都有影響[15-17]。在已報道的眾多植物雄性不育突變體中, 絨氈層發(fā)育缺陷型雄性不育是最多的一類[18]。且在不同植物中, 也有多個與絨氈層發(fā)育相關(guān)的基因被克隆, 如在擬南芥中發(fā)現(xiàn)基因編碼一個富含亮氨酸重復(fù)序列的受體蛋白激酶(LRR-RPK), 其表達(dá)與小孢子母細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞的分化有關(guān), 突變后導(dǎo)致敗育[19]; 在水稻中發(fā)現(xiàn)bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子啟動其同源基因和的表達(dá)。與相互作用來調(diào)控絨氈層分化, 促進(jìn)絨氈層PCD, 然后與相互作用調(diào)節(jié)絨氈層細(xì)胞死亡,突變導(dǎo)致水稻雄性不育[20]; 在玉米中發(fā)現(xiàn)基因編碼一個bHLH蛋白,由于絨氈層前體細(xì)胞不能分化, 導(dǎo)致花粉母細(xì)胞發(fā)育失敗, 最終影響其育性[21]等。

本研究對一個新玉米雄性不育突變體進(jìn)行了表型鑒定、細(xì)胞學(xué)觀察、遺傳分析和基因定位, 最終發(fā)現(xiàn)是已知基因的新等位突變體。研究結(jié)果為深入解析玉米雄性不育的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ), 為細(xì)胞核雄性不育的育種應(yīng)用提供了新材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米雄性不育突變體是自交系也鐵21背景的自然突變體。由于雄性不育突變體不能夠自交繁殖, 因此我們通過對雜合體植株進(jìn)行連續(xù)自交和表型鑒定來分離和保存突變體。本研究中用于表型鑒定和細(xì)胞學(xué)分析的材料為雜合植株連續(xù)自交5代后分離出的野生型(WT)和突變體。基因定位群體為突變體與自交系B73、Mo17、昌7-2 (C7-2)雜交并自交獲得的F2分離群體。用于等位測驗的突變體為北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院萬向元教授饋贈。

1.2 突變體的表型鑒定與細(xì)胞學(xué)觀察

在玉米抽雄散粉期開展表型鑒定, 對WT和的雄穗、花藥和花粉進(jìn)行比較, 同時調(diào)查株高、穗位高、雄穗分枝數(shù)、葉長和葉寬等重要農(nóng)藝性狀。細(xì)胞學(xué)觀察以WT及在S8a、S8b、S9、S10及S11五個時期[2]的花藥為試驗材料, 用FAA固定液保存, 固定后的組織材料進(jìn)行脫水、透明、浸蠟與包埋, 將包埋好的蠟塊切片黏附于載玻片上并干燥, 然后染色并用樹脂封片, 自然晾干。再用OLYMPLUS BX53正置顯微鏡(奧林巴斯, 日本)觀察并照相。

1.3 突變體的遺傳分析和基因定位

對于突變體表型的遺傳分析, 在玉米散粉期統(tǒng)計不同遺傳背景的F2群體中可育單株與不育單株的分離比, 并利用卡方測驗確定遺傳模式。在與B73構(gòu)建的F2定位群體中隨機(jī)選取69株不育單株, 利用CTAB法提取群體及雙親的基因組DNA。利用10K GBTS靶向測序技術(shù)分析樣品基因型[22]?；虺醵ㄎ徊捎肧NP-index算法, 通過計算每個多態(tài)性SNP標(biāo)記的SNP-index, 即突變體基因型占所有F2樣本基因型的頻率, SNP-index越接近1, 表明標(biāo)記與目標(biāo)基因連鎖越緊密[23]。為精細(xì)定位目標(biāo)基因, 我們擴(kuò)大F2定位群體數(shù)量, 并開發(fā)5對插入缺失標(biāo)記(insertion-deletion, InDel), InD124、InD125、InD127、InD128、InD130 (表1), 進(jìn)一步縮小定位區(qū)間。

1.4 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和序列分析

用CTAB法提取親本及突變體的基因組DNA。利用Primer 5軟件設(shè)計引物(表1), 擴(kuò)增基因組序列。以WT與基因組DNA為模板, 分別擴(kuò)增基因片段, 將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。使用DNAMAN軟件比對分析測序結(jié)果, 確定基因突變情況。試驗采用南京諾唯贊生物科技有限公司的PCR反應(yīng)試劑, 擴(kuò)增體系為2× PCR Mix 10 mL, 正向和反向引物(10 μmol L–1) 0.5 μL, 模板DNA 1 μL, 補超純水至20 μL。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3 min; 94℃變性15 s, 58℃退火15 s, 72℃延伸2 min, 34個循環(huán); 72℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

1.5 RNA提取及基因組織表達(dá)分析

基因的組織表達(dá)分析以自交系C7-2苗期的葉和根, 拔節(jié)期的葉、根和第3節(jié)莖間, 抽雄期的葉、根、雄穗、葉耳、雌穗、第3節(jié)莖間、花絲及花藥為研究材料。用植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司, Cat# DP432)提取不同組織的RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司, Cat# KR118-02)反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 以cDNA為模板, 設(shè)計特異引物20q-F/R, 并以Tubulin ()為內(nèi)參基因(表1), 在Bio-Rad CFX96實時定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量分析。按2–ΔCT方法[24]計算基因在各個組織中的表達(dá)水平, 分析其組織表達(dá)模式。

表1 本研究采用的PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體ms20s1的表型鑒定和細(xì)胞學(xué)觀察

在玉米抽雄散粉期, 野生型和突變體植株都能夠正常抽雄。野生型雄花花藥飽滿且顏色較黃, 能夠正常開裂及散粉, 自交可正常結(jié)實; 而不育株花藥干癟較小且顏色較淡, 穎殼不開裂, 花藥不外露(圖1-C, D)。作母本與其他野生型植株雜交后可正常結(jié)實。對野生型和突變體的花藥進(jìn)行I2-KI染色, 發(fā)現(xiàn)野生型花粉粒呈黑褐色, 而花藥中沒有花粉粒, 表明突變體為無花粉型雄性不育(圖1-E, F)。進(jìn)一步對比野生型與突變體植株, 發(fā)現(xiàn)在株高、雄穗主軸長度和雄穗分枝數(shù)上有顯著差異外(表2), 其他農(nóng)藝性狀和野生型植株無明顯差異(圖1-A, B)。

為了確定花藥發(fā)育異常產(chǎn)生的時期, 我們對玉米不同發(fā)育時期的花藥進(jìn)行了石蠟切片和細(xì)胞學(xué)觀察?；ㄋ帣M切面觀察表明, 在S8a～S8b時期, WT和花藥中小孢子母細(xì)胞開始減數(shù)分裂, 依次產(chǎn)生二分體和四分體, 絨氈層細(xì)胞質(zhì)濃縮, 著色加深, 表型沒有明顯差異; S9時產(chǎn)生的小孢子被釋放出來, WT和花藥發(fā)育開始出現(xiàn)差異; S10時小孢子開始液泡化, WT相較于來說更為飽滿,液泡收縮更早。S11時WT花藥小孢子囊泡開始逐步消失, 絨氈層細(xì)胞開始退化, 而藥室開始收縮, 絨氈層細(xì)胞降解異常, 小孢子破裂退化(圖2)。

A: 散粉期野生型(WT)與突變體植株的形態(tài)比較, 標(biāo)尺為20 cm; B: 散粉期野生型(WT)與突變體的雄穗比較, 標(biāo)尺為20 cm; C、D: 野生型(C)與突變體植株(D)的花藥比較, 標(biāo)尺為1 mm; E、F: 野生型(E)與突變體(F)被I2-KI染色后的花粉粒, 標(biāo)尺為200 μm。

A: the comparison of plant morphology between wild type andmutant at anthesis stage, bar: 20 cm; B: the comparison on tassel traits between the WT andmutant at anthesis stage, bar: 20 cm; C, D: the comparison of the anther morphology between the WT (C) andmutant (D), bar: 1 mm; E, F: pollen grains of WT (E) andmutant (F) stained with I2-KI, bar: 200 μm.

表2 野生型和突變體重要農(nóng)藝性狀比較

*表示在< 0.05水平差異顯著。*means significant difference at< 0.05.

圖2 WT和ms20s1突變體玉米花藥(S8a～S11期)的橫切面分析

E: 表皮層; En: 內(nèi)皮層; ML: 中間層; Ta: 絨氈層; Msp: 小孢子; CMsp: 收縮的小孢子; Dy: 二分體; Tds: 四分體。標(biāo)尺為50 μm。

E: epidermis; En: endothecium; ML: middle layer; Ta: tapetum; Msp: microspore; CMsp: collapsed microspore; Dy: dyad; Tds: tetrads. Bar: 50 μm.

2.2 ms20s1的遺傳分析與基因定位

將該突變體分別與B73、Mo17、C7-2進(jìn)行雜交, F1均表現(xiàn)為野生型。統(tǒng)計F1自交得到的3個F2群體中野生型和突變體的數(shù)目, 經(jīng)卡方檢驗其分離比都符合3∶1 (表3), 表明雄性不育性狀是受單個隱性核基因控制。為克隆該基因, 以B73為遺傳背景的F2分離群體為材料, 利用CTAB法提取69株不育植株的葉片及其親本DNA, 利用10K GBTS靶向測序技術(shù)分析樣本基因型。去除雜合及雙親之間的無多態(tài)性位點, 數(shù)據(jù)分析表明親本間存在多態(tài)性的SNP標(biāo)記數(shù)量為4745個, 占總位點數(shù)的47.45%, 平均每條染色體上的數(shù)目為474個, 其中1號染色體最多為850個, 6號染色體最少為361個(圖3)。分析所有多態(tài)性SNP位點對應(yīng)的SNP-index在全基因組水平上的變化, 發(fā)現(xiàn)在7號染色體上124.95～128.47 Mb區(qū)間可能與目標(biāo)性狀連鎖(圖3), 增加F2群體個數(shù)到192, 同時開發(fā)5個InDel標(biāo)記(InD124、InD125、InD127、InD128、InD130), 最終將基因定位在7號染色體的InD127和InD128標(biāo)記之間, 左側(cè)標(biāo)記處交換單株數(shù)為4, 右側(cè)標(biāo)記處交換單株數(shù)為3, 物理距離為0.68 Mb (圖4-A)。利用MaizeGDB (https://www.maizegdb.org/)網(wǎng)站檢索候選區(qū)段的基因及其功能注釋, 發(fā)現(xiàn)該區(qū)間內(nèi)共有13個蛋白編碼基因, 其中包含一個已經(jīng)報道的玉米雄性不育基因()。

表3 F2群體表型分離的卡方檢測

c2(0.05) (1)= 3.84.

圖3 SNP-index全基因組頻率分布圖

2.3 ms20s1與ms7-6007的等位測驗

為了驗證是否為基因的等位突變, 我們利用基因的已知突變體雜合基因型單株做父本與不育單株雜交, 同時再以雜合基因型單株作父本與不育單株作雜交, 在這2個雜交后代群體中均出現(xiàn)了雄性不育植株(圖5-A), 觀察其花藥及被I2-KI染色后的花粉, 證實其不育表型(圖5-B, C)。分別統(tǒng)計2種雜交方式后代不育單株和可育單株數(shù)量。以為母本的等位測驗中, 共調(diào)查了196株, 表現(xiàn)為野生型表型的有96株, 表現(xiàn)為突變體表型的有100株。以為母本的等位測驗中, 共調(diào)查了296株, 表現(xiàn)為野生型表型的有151株, 突變體表型的有145株。經(jīng)卡方檢驗分析表明野生型與突變體植株的分離比均符合1∶1, 證明是新的等位突變體(表4)。

圖4 ms20s1的精細(xì)定位和ZmMs7基因的結(jié)構(gòu)示意圖

A:的精細(xì)定位。Marker: 標(biāo)記名稱; N: 群體大小; Recombinant: 重組單株數(shù); B:基因的結(jié)構(gòu)示意圖。灰色框代表5￠非翻譯區(qū); 黑色框代表外顯子區(qū), 橫線代表內(nèi)含子區(qū)。

A: fine mapping ofmutantMarker: marker names; N: F2recessive population used in mapping; recombinant: the number of recombinants; B: the structure schematic diagram ofgene. The grey box represents the 5￠un-translated region. The black boxes represent the exons and the horizontal lines represent introns.

(圖5)

A: 從左到右分別為突變體、雜交后代中的可育植株、雜交后代中的不育植株、突變體的雄穗, 標(biāo)尺為10 cm; B: 從左到右分別為突變體、雜交后代中的可育植株、雜交后代中的不育植株、突變體的花藥, 標(biāo)尺為1 mm; C: 從左到右分別為突變體、雜交后代中的可育植株、雜交后代中的不育植株、突變體被I2-KI染色后的花粉粒, 標(biāo)尺為100 μm。

A: plants from left to right are the tassels of themutant, the fertile hybrid plant, the sterile hybrid plant, and themutant, respectively, bar: 10 cm; B: plants from left to right are the anthers of themutant, the fertile hybrid plant, the sterile hybrid plant, and themutant, respectively, bar: 1 mm; C: plants from left to right are the I2-KI staining of pollen grains of themutant, the fertile hybrid plant, the sterile hybrid plant, and themutant, respectively, bar: 100 μm.

表4 ms20s1與ms7-6007突變體等位測驗

c2(0.05) (1)= 3.84.

2.4 ms20s1突變位點的鑒定

為進(jìn)一步驗證確認(rèn)的突變位點, 以B73中的基因組序列為參考, 共設(shè)計3對PCR引物(表1), 分別擴(kuò)增野生型和突變體中基因序列, 擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋了基因全長。對擴(kuò)增產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn),突變體中基因在第1個外顯子ATG下游22 bp處缺失了3個堿基; 第3個外顯子上的第999個堿基由T突變?yōu)镃, 纈氨酸變?yōu)楸彼? 第1176個堿基由A突變?yōu)镚, 組氨酸變?yōu)榫彼? 第1193個堿基由G突變?yōu)镃, 丙氨酸變?yōu)楦彼?圖4-B)。與已報道的突變體第2外顯子有7個堿基插入及突變體第3個外顯子有轉(zhuǎn)座子插入的突變方式不同, 以上研究結(jié)果充分證實是基因的新等位突變體。

我們根據(jù)A到G的SNP變異, 開發(fā)了一個CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)酶切標(biāo)記。使用引物Ms7-P3 (表1)擴(kuò)增需要鑒定植株的基因組序列(圖6-A),突變體在突變位點附近包含一個B I限制性內(nèi)切酶的酶切位點, 野生型由于未發(fā)生由A到G的變異, 不能被B I酶切(圖6-B)。該標(biāo)記可以作為基因型鑒定的功能性共分離分子標(biāo)記使用, 為后續(xù)不育性狀向優(yōu)異母本種質(zhì)的回交轉(zhuǎn)育和制種應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖6 基因型鑒定

A: CAPS標(biāo)記PCR產(chǎn)物; B:B I酶切產(chǎn)物, AA、Aa、aa分別代表純合野生型、雜合野生型、純合突變體。

A: PCR products of the CAPS markers; B:B I digestion product. AA, Aa, and aa represent homozygous wild type, heterozygous wild type, and homozygous mutant, respectively.

2.5 ZmMs7基因的組織特異性分析

突變體主要表現(xiàn)在花藥形態(tài)及其功能上的改變, 所以我們預(yù)測該基因在花藥中特異表達(dá)。分別提取野生型在苗期, 拔節(jié)期和抽雄期不同組織的RNA并反轉(zhuǎn)錄, 利用實時熒光定量PCR檢測基因的表達(dá)量(表1)。結(jié)果顯示,基因在根、莖、葉等營養(yǎng)器官中的表達(dá)量非常微弱, 在花藥中特異表達(dá)(圖7-A)。進(jìn)一步分析該基因在不同發(fā)育階段花藥中的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),基因在2.7～3.0 mm長度(S8b～S10)花藥中表達(dá), 且在3.0 mm單核小孢子階段表達(dá)量最高(圖7-B)[25], 表明基因在四分體期和單核小孢子期的玉米花藥發(fā)育中具有重要作用[26]。

圖7 ZmMs7基因在不同組織中的表達(dá)量變化

3 討論

本研究中的屬于無花粉型玉米雄性不育突變體。石蠟切片觀察分析結(jié)果表明,突變體發(fā)育異常起始于花藥發(fā)育的S9階段, 在S11階段最為顯著, 主要表現(xiàn)為絨氈層細(xì)胞降解異常, 小孢子細(xì)胞敗育, 導(dǎo)致無花粉粒形成?；蚨ㄎ缓偷任粶y驗結(jié)果表明為已知基因的新等位突變。

玉米基因編碼一個PHD-finger的轉(zhuǎn)錄因子, 是玉米減數(shù)分裂后花藥發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子[27]。植物中, PHD是鋅指結(jié)構(gòu)域家族的一類轉(zhuǎn)錄因子, 參與了胚胎到營養(yǎng)生長, 營養(yǎng)生長到生殖生長中的各項生命過程[28]。在擬南芥、水稻、大麥中已鑒定出該基因的同源基因、/、, 這些基因在雄性育性調(diào)控、細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)以及時空表達(dá)上也基本相似[29-31]。其中在減數(shù)分裂后的絨氈層中特異表達(dá), 參與花粉外壁和花粉胞質(zhì)組分的形成以及絨氈層的發(fā)育,突變體不能進(jìn)行PCD, 絨氈層細(xì)胞異常降解導(dǎo)致線粒體膨脹和大的自噬泡;控制著絨氈層細(xì)胞的程序性死亡和功能花粉的發(fā)育, 突變體表現(xiàn)為絨氈層細(xì)胞增殖失控、細(xì)胞膨脹、DNA斷裂延遲、烏氏體和花藥壁發(fā)育異常。這些都表明在植物雄性器官發(fā)育過程中PHD-finger蛋白是至關(guān)重要的。

已有研究表明,突變體表現(xiàn)出完全隱性雄性不育, 細(xì)胞學(xué)特征是小孢子壁和芽孔發(fā)育不良, 絨氈層細(xì)胞發(fā)育異常,突變體與其表現(xiàn)相似[27,32]。突變體在減數(shù)分裂期小孢子發(fā)育正常, 在S11時絨氈層細(xì)胞開始腫脹, 小孢子敗育, 且在皺縮的花藥室中產(chǎn)生很多碎片, 表明絨氈層細(xì)胞的程序性死亡降解的異常。在小孢子發(fā)育后期,突變體與突變體表現(xiàn)相同。并且突變體的細(xì)胞學(xué)特征與水稻突變體和擬南芥突變體相似, 表現(xiàn)出絨氈層退化延遲和花粉外壁發(fā)育缺陷[33-34]。作為轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮作用, 僅在花藥中表達(dá)。且在花藥發(fā)育的四分體期和單核小孢子期特異表達(dá)[25]。這與突變體小孢子在四分體期染色體異常濃縮變粗, 絨氈層細(xì)胞直至四分體期發(fā)育都正常, 但之后絨氈層細(xì)胞開始液泡化并迅速降解, 花藥小孢子壁和芽孔及絨氈層細(xì)胞發(fā)育異常這一現(xiàn)象對應(yīng)[26]。

突變體中基因在第1個外顯子上缺失3個堿基, 并沒有在重要結(jié)構(gòu)域上。第3個外顯子不同位置上有3個單堿基的突變, 引起了3個氨基酸的變化, 且靠近PHD結(jié)構(gòu)域, 可能影響蛋白功能; 而突變體是在第2外顯子有7個堿基插入, 導(dǎo)致蛋白翻譯發(fā)生移碼, 造成亮氨酸拉鏈區(qū)域和PHD結(jié)構(gòu)域的缺失; 此外,突變體是在第3外顯子上插入了1136個堿基的轉(zhuǎn)座元件, 導(dǎo)致翻譯提前終止, 同樣造成亮氨酸拉鏈區(qū)和PHD結(jié)構(gòu)域的缺失[27]。由此對比來看,突變體的突變方式與突變體、突變體不同, 證明是基因的一個新等位突變體。我們基于A到G的SNP變異開發(fā)了一個CAPS功能標(biāo)記, 為突變體不育位點向優(yōu)良雜交種母本回交轉(zhuǎn)育, 以及配套的SPT保持系創(chuàng)制和制種應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。CAPS標(biāo)記比較直觀, 但需要進(jìn)行酶切和電泳, 檢測效率偏低。KASP (Kompetitive Allele Specific PCR)標(biāo)記檢測更為方便, 通量大, 效率高, 后續(xù)將在突變位點處開發(fā)KASP標(biāo)記以提高檢測效率。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)了一個玉米雄性不育突變體,該突變體表現(xiàn)為絨氈層細(xì)胞程序性死亡異常。基因定位結(jié)果表明是基因的一個新等位突變體。基因在絨氈層細(xì)胞和小孢子的發(fā)育過程中特異表達(dá)。在突變體中,基因的第3外顯子3個堿基的突變造成了編碼氨基酸的非同義突變, 可能引起了蛋白功能的改變, 進(jìn)而造成植株的雄性不育。本研究為隱性核不育系的創(chuàng)制提供了新的突變位點, 同時也為該位點的育種應(yīng)用提供了有效的功能標(biāo)記。

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Genetic analysis and molecular identification of a multiple allele mutant ofgene in maize

CAO Xiao-Xiong1,2, LIU Yi-Fan1,2, ZHOU Yu-Qiang2, WANG Jing2, WU Yu-Jin2, WANG Hong-Wu2, LI Kun2, LIU Xiao-Gang2, HUANG Chang-Ling2, LIU Zhi-Fang2, GUO Jin-Jie1,*, and HU Xiao-Jiao2,*

1College of Agronomy, Hebei Sub-center of National Maize Improvement Center of China / State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation / Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Engineering Research Center of Crop Molecular Breeding, Beijing 100081, China

We identified a maize male sterile mutant in the natural population, designated as. The mutant had complete male sterility and lacked pollen grains in the withered anthers. Cytological analysis showed that, compared with the wild type, themutant exhibited shrinkage locule, swollen tapetum cells, and aborted microspore at S11 stage, indicating that themutant had abnormal tapetal programmed cell death and complete pollen abortion. Genetic analysis revealed that the male sterility trait was controlled by a single recessive nuclear gene. To clone the target gene, we constructed the F2populations by crossingwith different inbred lines and analyzed the population genotype using genotyping by target sequencing (GBTS) techno-logy. The gene was initially mapped to the 124.95–128.47 Mb region on chromosome 7, and the interval was narrowed down to 0.68 Mb after fine mapping. Bioinformatics analysis indicated that there was one known genein this region.Thegene encoded a PHD-finger transcription factor that played an important role in tapetum development and pollen wall formation. Allelism test demonstrated thatwas an allelic mutant ofgene. Gene sequencing results showed that themutant had multiple sequence variants in the exon region, which were different from the reported mutantsand, confirmingwas a new allelic mutant of. The discovery and identification of themutant provide a new material for exploring the molecular mechanism and breeding application of maize genic male sterility.

maize;;; gene mapping; allelic mutant

10.3724/SP.J.1006.2023.33002

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2022YFD1200802)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(CAAS-ZDRW202004)，作物分子育種國家工程研究中心和河北省玉米現(xiàn)代種業(yè)科技創(chuàng)新團(tuán)隊項目(21326319D)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2022YFD1200802), the Agricultural Science and Technology Innovation Program (CAAS-ZDRW202004), the National Engineering Research Center of Crop Molecular Breeding, and the Science and Technology Innovation Team of Maize Modern Seed Industry in Hebei (21326319D).

胡小嬌, E-mail: huxiaojiao@caas.cn; 郭晉杰, E-mail: guojinjie512@163.com

E-mail: caoxx13@163.com

2023-01-05;

2023-04-17;

2023-05-05.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20230504.1553.002.html

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