大承氣湯對(duì)腸源性膿毒癥小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制Δ

鐘 旋 ，李袁袁 ，林榮鋒 #，姚韻婕 ，劉偉瓊 ，羅毅平 ，凌家俊 （.廣東省婦幼保健院成人重癥監(jiān)護(hù)室，廣州 544；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 50006；3.東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究院，廣東 東莞 53808）

膿毒癥是全身性炎癥反應(yīng)綜合征，可發(fā)展為嚴(yán)重的膿毒血癥和膿毒癥休克[1]。其可引起機(jī)體過(guò)度的炎癥反應(yīng)，造成多器官損傷，進(jìn)而引發(fā)多器官功能障礙，使患者病死率升高[2]。膿毒癥的臨床治療非常棘手，主要采用非特異性治療（如液體復(fù)蘇、肺保護(hù)性通氣、控制感染、改善血流動(dòng)力學(xué)等）和對(duì)癥治療（如防治器官功能衰竭和休克等）[3]。由于目前尚無(wú)特異性治療方法，其病死率仍然高達(dá)36.6%[4]。中醫(yī)可采用通腑降下法治療膿毒癥，大承氣湯是該治法的代表方劑之一。大承氣湯源于張仲景《傷寒論》，由大黃、枳實(shí)、厚樸和芒硝組成，是《中國(guó)膿毒癥早期預(yù)防和阻斷急診專(zhuān)家共識(shí)》治療腑氣不通型膿毒癥的推薦用藥[4]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，大承氣湯可縮短膿毒癥患者的機(jī)械通氣及住ICU時(shí)間，改善急性生理和慢性健康狀況Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ）評(píng)分和膿毒癥相關(guān)序貫器官衰竭（sequential organ failure assessment，SOFA）評(píng)分，提高治愈率[5]，且對(duì)膿毒癥胃腸損傷[6]、膿毒癥肺損傷[5]、急性胰腺炎并發(fā)肝損傷[7]等疾病均具有較好的治療效果，但其作用機(jī)制尚不清楚，且相關(guān)的基礎(chǔ)研究較少。采用中藥配方顆粒制備的大承氣湯在保持傳統(tǒng)湯劑成分特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，不僅成分穩(wěn)定可控，還具有較明確的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)[8]?；诖?，本研究擬采用中藥配方顆粒制備大承氣湯，并開(kāi)展其改善膿毒癥的藥效學(xué)研究。

Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是最早被人們發(fā)現(xiàn)且研究最為廣泛的TLR家族成員，其在膿毒癥的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要的角色[9]。膿毒癥發(fā)生時(shí)，TLR4可通過(guò)識(shí)別并結(jié)合病原微生物細(xì)胞壁上的脂多糖激活其下游髓分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴(lài)性通路，進(jìn)而促進(jìn)白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥因子的釋放[10]。因此，TLR4/MyD88信號(hào)通路在膿毒癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。本研究以經(jīng)典的盲腸穿刺法復(fù)制腸源性膿毒癥模型小鼠，考察大承氣湯對(duì)腸源性膿毒癥小鼠的保護(hù)作用，并從TLR4/MyD88信號(hào)通路探討其可能機(jī)制，以期為大承氣湯治療膿毒癥的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有ST16 型離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）、DG5033A 型多功能酶標(biāo)儀（南京東華電子科技有限公司）、JB-P5 型石蠟組織包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）、RM2016 型病理切片儀（上海徠卡儀器有限公司）、7500型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）、SMA4000型微量核酸定量?jī)x（美國(guó)Merinton公司）。

1.2 主要藥品與試劑

大黃、枳實(shí)、厚樸、芒硝的配方顆粒購(gòu)自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，參考大承氣湯處方（大黃12 g、枳實(shí)12 g、厚樸24 g、芒硝9 g），按文獻(xiàn)[8]方法加入煮沸的蒸餾水適量，配制成質(zhì)量濃度分別為1、0.5 g/mL的大承氣湯藥液（以生藥量計(jì)），備用。注射用烏司他?。ㄅ?hào)032104073，規(guī)格100 000 U）購(gòu)自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司；戊巴比妥鈉（批號(hào)1905020301）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（批號(hào)RX202412M）、IL-6 ELISA試劑盒（批號(hào)RX203049M）均購(gòu)自泉州睿信生物科技有限公司；TRIzol Reagent 試劑盒（批號(hào)DP424）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)K1622）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；熒光實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)AOPR-1200）購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為C57BL/6J雄性小鼠，共60只，體重為23～25 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2019-0202。動(dòng)物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房（溫度為24～26 ℃，濕度為45%～55%，自然晝夜節(jié)律光照），自由獲取食物和水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為廣東省婦幼保健院醫(yī)倫第[202001070]號(hào)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組、造模與給藥

將60 只C57BL/6J 小鼠按體重隨機(jī)分為6 組，分別為假手術(shù)（Sham）組、假手術(shù)+大承氣湯高劑量（Sham+DCQD-H）組、模型（CLP）組、大承氣湯低劑量（DCQDL）組、大承氣湯高劑量（DCQD-H）組、陽(yáng)性對(duì)照（Positive）組，每組10只。CLP組、DCQD-L組、DCQD-H組和Positive組小鼠均以盲腸結(jié)扎穿刺法建立腸源性膿毒癥模型[11]。DCQD-L組和DCQD-H組在術(shù)前3 d和術(shù)后7 d每天灌胃給予大承氣湯（劑量分別為4、8 g/kg[12]，按生藥量計(jì)）；Positive 組在術(shù)前2 h 腹腔注射烏司他丁1 次，術(shù)后7 d 每日腹腔注射烏司他丁1 次，劑量均為50 000 U/kg[13]。Sham 組僅暴露盲腸，不做結(jié)扎及穿刺；Sham+DCQD-H組僅暴露盲腸，不做結(jié)扎及穿刺，并在術(shù)前3 d和術(shù)后7 d每天灌胃給予大承氣湯8 g/kg（按生藥量計(jì)）；Sham 組和CLP 組每天均灌胃和腹腔注射生理鹽水各0.2 mL，連續(xù)10 d。

2.2 小鼠膿毒癥評(píng)分與7 d生存率評(píng)估

采用小鼠膿毒癥評(píng)分評(píng)價(jià)各組小鼠膿毒癥嚴(yán)重程度[14]。根據(jù)小鼠外觀、行為表現(xiàn)、意識(shí)水平、對(duì)刺激的反應(yīng)、睜眼反應(yīng)、呼吸頻率和呼吸質(zhì)量等情況進(jìn)行綜合評(píng)分，分值越高，表明膿毒癥越嚴(yán)重。術(shù)后7 d每天對(duì)各組小鼠進(jìn)行膿毒癥評(píng)分，并觀察其存活情況，繪制7 d生存曲線用以評(píng)估其7 d生存率。

2.3 標(biāo)本采集

當(dāng)小鼠的膿毒癥評(píng)分超過(guò)21 分或小鼠的呼吸頻率和呼吸質(zhì)量得分超過(guò)3分時(shí)，視為死亡，此時(shí)及時(shí)進(jìn)行取材[15]：摘眼球取血，收集血清備用。將小鼠處死，剖取肝、肺、腎、回腸組織，分批剪取適量組織裝入凍存管并迅速浸入液氮中，然后放入80 ℃冰箱中保存，備用；另取一部分組織浸入4%多聚甲醛溶液中固定，備用。其余小鼠于末次給藥1 h后采用相同方法取材。

2.4 小鼠血清和回腸組織中TNF-α、IL-6水平的測(cè)定

取“2.3”項(xiàng)下小鼠血清和回腸組織樣品適量（每組選取6只小鼠的樣本），采用ELISA法測(cè)定其中TNF-α、IL-6水平，具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.5 小鼠肝、肺、腎、回腸組織的病理學(xué)形態(tài)觀察

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法進(jìn)行觀察。取“2.3”項(xiàng)下固定于4%多聚甲醛溶液中的小鼠肝、肺、腎、回腸組織（每組選取3 只小鼠的樣本），經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察各組織的病理學(xué)形態(tài)并評(píng)分[16]。

2.6 小鼠回腸組織中TLR4、MyD88 mRNA 表達(dá)水平的檢測(cè)

取“2.3”項(xiàng)下小鼠回腸組織樣品適量（每組選取6只小鼠的樣品），使用TRIzol 試劑按照說(shuō)明書(shū)要求提取小鼠回腸組織總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再按照熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑盒制備反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95℃ 10 min；95℃ 10 s，55℃ 20 s，72℃ 35 s；循環(huán)40個(gè)周期。繪制熔解曲線，采用2－ΔΔCt法，以actb為內(nèi)參，計(jì)算TLR4、MyD88 mRNA 的表達(dá)水平。引物序列由廣州四和生物科技股份有限公司合成，具體見(jiàn)表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件、GraphPad Prism 9 醫(yī)學(xué)繪圖軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 小鼠膿毒癥評(píng)分和7 d生存率測(cè)定結(jié)果

膿毒癥評(píng)分結(jié)果見(jiàn)圖1A。Sham 組和Sham+DCQD-H組小鼠的行為正常，精神佳，反應(yīng)靈敏，呼吸正常，毛發(fā)光滑且發(fā)亮，眼睛完全睜開(kāi)。與Sham 組比較，CLP 組小鼠膿毒癥評(píng)分顯著升高（P＜0.01），毛發(fā)豎立，行動(dòng)緩慢，精神萎靡，對(duì)外界刺激（如聲音、觸摸）反應(yīng)遲鈍或行動(dòng)伴隨著震顫，眼睛半閉或緊閉，偶有白色分泌物，呼吸頻率和質(zhì)量較差。與CLP組比較，DCQD-L組、DCQD-H 組和Positive 組小鼠膿毒癥評(píng)分均顯著降低（P＜0.01），且上述癥狀均有所改善或緩解。

圖1 各組小鼠的膿毒癥評(píng)分和7 d 生存率測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

小鼠7 d 生存率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1B。Sham 組和Sham+DCQD-H組均無(wú)小鼠死亡。與Sham組比較，CLP組小鼠7 d生存率顯著降低（P＜0.01），僅為40%；與CLP組比較，DCQD-L 組、DCQD-H 組、Positive 組小鼠7 d 生存率均有不同程度的升高，分別為70%、80%、70%，其中DCQD-H組小鼠7 d生存率顯著升高（P＜0.05）。

3.2 小鼠血清和回腸組織中TNF-α、IL-6 水平的檢測(cè)結(jié)果

與Sham 組比較，CLP 組小鼠血清和回腸組織中TNF-α、IL-6 水平均顯著升高（P＜0.01）。與CLP 組比較，DCQD-L 組、DCQD-H 組和Positive 組小鼠血清和回腸組織中TNF-α、IL-6水平（DCQD-L組回腸組織中IL-6除外）均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠血清和回腸組織中TNF-α、IL-6 水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

3.3 小鼠肝、肺、腎、回腸組織的病理學(xué)變化結(jié)果

肝組織HE染色結(jié)果顯示，Sham組和Sham+DCQDH組小鼠肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，未見(jiàn)明顯的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；CLP組小鼠肝細(xì)胞排列疏松且雜亂不齊，細(xì)胞多腫脹，伴有出血，可見(jiàn)大面積的炎癥浸潤(rùn)和細(xì)胞凋亡；DCQD-L 組、DCQD-H 組和Positive 組小鼠肝細(xì)胞損傷明顯改善，炎癥浸潤(rùn)和凋亡減少，中央靜脈微擴(kuò)張、排列相對(duì)整齊，結(jié)果見(jiàn)圖3A。

圖3 各組小鼠肝、肺、腎、回腸組織的病理學(xué)形態(tài)觀察結(jié)果

肺組織HE染色結(jié)果顯示，Sham組和Sham+DCQDH組小鼠肺泡壁間隙薄，肺泡大、形態(tài)正常，無(wú)明顯的損傷；CLP 組小鼠肺泡壁增厚，肺泡縮小且多見(jiàn)水腫、出血，可見(jiàn)明顯的炎癥浸潤(rùn)；DCQD-L 組、DCQD-H 組和Positive 組小鼠肺組織損傷有所緩解，肺泡萎縮、出血、水腫均有不同程度的改善，結(jié)果見(jiàn)圖3B。腎組織HE染色結(jié)果顯示，Sham 組和Sham+DCQD-H 組小鼠腎組織形態(tài)正常，未見(jiàn)明顯的損傷及炎癥浸潤(rùn)，可見(jiàn)完好的腎小球和腎小管；CLP 組小鼠可見(jiàn)腎小管管腔擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞呈空泡樣變性，腎間質(zhì)多見(jiàn)水腫、出血，有明顯的炎癥損傷；DCQD-L 組、DCQD-H 組和Positive 組小鼠腎組織損傷得到改善，腎小管管腔擴(kuò)張減弱、空泡樣變性減少，結(jié)果見(jiàn)圖3C。回腸組織HE 染色結(jié)果顯示，Sham 組和Sham+DCQD-H 組小鼠回腸組織形態(tài)正常，完整的腸絨毛數(shù)量多，未見(jiàn)明顯損傷；CLP 組小鼠回腸組織可見(jiàn)較多尖銳或破損的腸絨毛，表現(xiàn)出明顯的炎癥損傷；DCQD-L 組、DCQD-H 組和Positive 組小鼠回腸組織損傷及水腫均有明顯改善，結(jié)果見(jiàn)圖3D。另外，與Sham 組比較，Sham+DCQD-H 組小鼠肝、肺、腎、回腸組織損傷評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CLP 組小鼠肝、肺、腎、回腸組織損傷評(píng)分均顯著升高（P＜0.01）；與CLP 組比較，DCQD-L 組、DCQD-H 組和Positive 組小鼠肝、肺、腎、回腸組織損傷評(píng)分均顯著降低（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠組織損傷評(píng)分結(jié)果（±s，n＝3）

3.4 小鼠回腸組織中TLR4、MyD88 mRNA 表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果

與Sham 組比較，CLP 組小鼠回腸組織中TLR4、MyD88 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）。與CLP組比較，DCQD-L 組、DCQD-H 組和Positive 組小鼠回腸組織中TLR4、MyD88 mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠回腸組織中TLR4、MyD88 mRNA 表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

4 討論

TNF-α、IL-6均為重要的炎癥因子，常被視為衡量膿毒癥嚴(yán)重程度的指標(biāo)[10]。本研究結(jié)果顯示，大承氣湯可抑制膿毒癥引發(fā)的血清炎癥因子TNF-α、IL-6 的升高，改善膿毒癥所致的肝、肺、腎、回腸組織的炎癥浸潤(rùn)，提示其對(duì)全身性炎癥反應(yīng)具有顯著的抑制作用。本研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)大承氣湯治療急性或重癥胰腺炎、炎性腸梗阻、肺炎的報(bào)道相符[7，17]。

膿毒癥常引起包括肝、肺、腎、回腸組織在內(nèi)的多器官衰竭，其治療關(guān)鍵在于降低多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的發(fā)生率[18]，因此本研究考察了大承氣湯對(duì)肝、肺、腎、回腸組織損傷的影響，結(jié)果顯示，其對(duì)肝、肺、腎、回腸組織均具有保護(hù)作用，尤其是對(duì)腸道的保護(hù)作用較好。胃腸道不僅是促進(jìn)膿毒癥病情進(jìn)展的關(guān)鍵器官，更是膿毒癥最常受累的靶器官[11]，腸功能損傷的防治是截?cái)嗄摱景Y迅速進(jìn)展為MODS的核心[19]。大承氣湯已被證實(shí)對(duì)腸梗阻、胃腸動(dòng)力不足、腸缺血再灌注損傷等多種腸道疾病具有治療作用[20]，且其成分可能對(duì)腸存在靶向性[21]。本研究亦證實(shí)，大承氣湯可改善腸源性膿毒癥所致的腸道炎癥損傷、浸潤(rùn)、水腫、出血，較好地保護(hù)小腸絨毛的完整。

TLR4信號(hào)通路在先天的免疫反應(yīng)和急性或慢性炎癥性疾病中發(fā)揮著重要的作用[22]。當(dāng)膿毒癥發(fā)生時(shí)，往往會(huì)激活TLR4/MyD88 信號(hào)通路，引起動(dòng)物模型中TLR4、MyD88 mRNA水平的顯著升高，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子大量釋放[23]。本研究結(jié)果顯示，大承氣湯可顯著下調(diào)膿毒癥模型小鼠回腸組織中TLR4、MyD88 mRNA 表達(dá)水平，提示其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/MyD88信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，大承氣湯對(duì)腸源性膿毒癥模型小鼠具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制全身炎癥、減輕多器官損傷以及下調(diào)TLR4/MyD88信號(hào)通路有關(guān)。