UPLC-MS/MS法同時(shí)測定同仁牛黃清心丸中15個(gè)膽汁酸的含量 Δ

陳雪婷，林詩鈴，陳 濤，林逸凡，黃鳴清，鄭燕芳 （福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122）

同仁牛黃清心丸由人工牛黃、當(dāng)歸、川芎等27 味中藥制備而成[1]，有清心化痰、鎮(zhèn)驚祛風(fēng)的功能，常用于治療因風(fēng)痰阻竅而引起的頭昏眼花、痰涎壅盛、神智錯(cuò)亂、語言不清以及驚風(fēng)抽搐。人工牛黃為方中君藥，具有清心肝經(jīng)熱、涼血解毒開竅的功效[1—2]。目前，尚未見到有關(guān)同仁牛黃清心丸的法定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，已發(fā)表的文獻(xiàn)僅有采用氣相色譜法測定同仁牛黃清心丸中麝香酮的含量[3]，而能同時(shí)測定該藥中多個(gè)膽汁酸成分的報(bào)道尚未見到。

含牛黃中成藥質(zhì)量的決定性因素是牛黃及其代用品的質(zhì)量[4]，而對牛黃中的膽汁酸成分進(jìn)行定量研究將成為提高含牛黃中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和保障其藥物穩(wěn)定性的關(guān)鍵[5]。膽汁酸的種類、成分復(fù)雜，部分成分的分子量、極性相近，甚至是同分異構(gòu)體，不易分離，且部分膽汁酸含量極低，不易檢測到，這增加了相關(guān)分析檢測的難度[6—7]。近年來，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）技術(shù)因融合了超高效液相色譜的分離能力和高分辨質(zhì)譜的鑒定能力而廣泛用于中藥復(fù)方成分的分析與鑒定[8]。基于此，本研究建立了一種能同時(shí)測定同仁牛黃清心丸中15 個(gè)膽汁酸成分含量的UPLC-MS/MS法，并采用該法對15批樣品進(jìn)行了測定，旨在為該藥的質(zhì)量評價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

Dionex Uitimate 3000 型超高效液相色譜系統(tǒng)、四極桿串聯(lián)靜電場軌道阱質(zhì)譜儀（配備電噴霧離子源）、Heraeus Fresco 17 型離心機(jī)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Milli-Q Direct 16型超純水制備儀購自德國Merck Millipore公司；CPA225D型十萬分之一電子天平購自德國Sartorius 公司；XM-400UHP 型超聲波清洗儀購自小美超聲儀器（昆山）有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

甘氨膽酸（glycocholic acid，GCA，批號Y08A9E57765）、3-oxo-7α，12α-hydroxy-5β-cholanoic acid（3-OCA，批號N07GY167164）、?；蛆Z脫氧膽酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA，批號Y09S8K43540）、3α-羥基-7-氧代-5β-膽烷酸（3α-hydroxy-7-oxo-5β-cholanic acid，3α-OH-7-OCA，批號N30GB169735）、豬脫氧膽酸（hyodeoxycholic acid，HOCA，批號S27M8I36899）、膽酸（cholic acid，CA，批號T16J8Q28663）、甘氨鵝脫氧膽酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDCA，批號Y29M9K57235）、甘氨脫氧膽酸（glycodeoxycholic acid，GDCA，批號Y27M9E56969）、鵝脫氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA，批號Z01011LA14）、脫氧膽酸（deoxycholic acid，DCA，批號S05N6I5476）、脫氫膽酸（dehydrocholic acid，DHCA，批號S30J9I64022，內(nèi)標(biāo)）、7 -酮-3α，12α-羥基膽烷酸（7-oxodeoxycholic acid，7-ODCA，批號Z09M10J82521）、?；悄懰幔╰aurocholic acid，TCA，批號B15J11J118403）對照品均購自上海源葉生物科技有限公司（純度均大于95%）；12-脫氫膽酸（12-dehydrocholic acid，12-DHCA，批號0000080453）、?；敲撗跄懰徕c（taurodeoxycholic acid sodium salt hydrate，TDCA-NA，批號B26J9J53831）對照品均購自美國Sigma-Aldrich公司（純度均大于95%）；豬膽酸（hyocholic acid，HCA，批號A1110816）對照品購自美國Cayman公司（純度不小于98%）。

15 批同仁牛黃清心丸由北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠提供，批號分別為20010460、21010855、21010310、21010095、21010858、21010857、21010189、19010326、21010919、21010312、21011012、21010870、21010859、22010142、22010140（編號依次為S1～S15）；甲醇和甲酸為色譜純或質(zhì)譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil GOLD C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～0.5 min，20%A；0.5～1.5 min，20%A→70%A；1.5～7 min，70%A→61%A；7～8 min，61%A；8～14 min，61%A→80%A；14～15 min，80%A→85%A；15～16 min，85%A→90%A；16～17.5 min，90%A→20%A；17.5～19 min，20%A）；柱溫為40 ℃；流速為0.2 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

采用加熱型電噴霧離子源、負(fù)離子監(jiān)測模式（negative ion mode，Neg）；噴霧電壓為3.0 kV（－）；毛細(xì)管溫度為325 ℃；輔助氣溫度為350 ℃；鞘氣流速為45 arb；輔助氣流速為10 arb；吹掃氣體流速為1 arb；質(zhì)譜測定數(shù)據(jù)采用平行反應(yīng)監(jiān)測（parallel reaction monitoring，PRM）模式。各待測成分及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)見表1；PRM圖見圖1。

圖1 同仁牛黃清心丸中15個(gè)膽汁酸成分的PRM圖

表1 各待測成分及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品母液及內(nèi)標(biāo)溶液

精密稱取上述除DHCA 外的15 種對照品各適量，加甲醇超聲（功率100 W，頻率40 kHz，下同）溶解，制成質(zhì)量濃度均為2 mg/mL的單一對照品母液。分別量取上述各單一對照品母液，用甲醇稀釋，得到TCA、7-ODCA、12-DHCA、GCA、3-OCA、TCDCA、3α-OH-7-OCA、HCA、TDCA-NA、HOCA、CA、GCDCA、GDCA、CDCA、DCA的質(zhì)量濃度分別為3 997.66、206.44、350.86、2 074.28、92.53、223.69、1 709.53、4 257.16、960.72、1 685.76、5 052.81、96.43、545.48、253.55、465.09 ng/mL的混合對照品母液。

精密稱取DHCA 對照品適量，用甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的內(nèi)標(biāo)母液；再取內(nèi)標(biāo)母液適量，用甲醇稀釋，得到質(zhì)量濃度為20 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2 供試品溶液

取同仁牛黃清心丸適量，剪碎，加入等質(zhì)量硅藻土，研磨成粉末，過20 目篩。精密稱取該粉末0.10 g，置于容量瓶中，加入10 mL甲醇充分搖勻，稱重，超聲提取30 min后，再次稱重，加甲醇補(bǔ)足失重，以10 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，置于1 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到供試品溶液。取供試品溶液適量，按1∶1（V/V）加入內(nèi)標(biāo)溶液后進(jìn)樣分析。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系及定量限、檢測限考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品母液適量，用甲醇逐級稀釋后，按1∶1（V/V）加入內(nèi)標(biāo)溶液制成系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下分析條件進(jìn)樣測定，并以各對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、對照品與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度之比為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸；再分別以信噪比（S/N）＝3 計(jì)算檢測限（limit of detection，LOD），以S/N＝10計(jì)算定量限（limit of quantitation，LOQ），結(jié)果見表2。

表2 TCA等15個(gè)待測成分的線性關(guān)系及定量限、檢測限考察結(jié)果

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品母液適量，加甲醇分別稀釋2、30、60倍，配制成高、中、低質(zhì)量濃度的對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下分析條件在同一天連續(xù)進(jìn)樣6次，測定日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，測定日間精密度。結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度的RSD 為1.59%～4.74%（n均為6），日間精密度的RSD為0.29%～5.49%（n均為3），表明儀器精密度較好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（編號S1），分別于制備后0、2、4、6、8、12、24、48 h按“2.1”項(xiàng)下分析條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，TCA 等15 個(gè)待測成分峰面積的RSD 為1.15%～3.21%（n均為8），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批同仁牛黃清心丸（編號S1），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下分析條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算15個(gè)膽汁酸成分的含量。結(jié)果顯示，TCA、7-ODCA、12-DHCA、GCA、3-OCA、TCDCA、3α-OH-7-OCA、HCA、TDCA-NA、HOCA、CA、GCDCA、GDCA、CDCA、DCA 的平均含量分別為356.12、21.78、3.82、144.01、1.83、13.62、41.80、494.18、56.24、151.08、517.84、10.79、39.68、29.50、47.89 μg/g，RSD為0.77%～2.94%（n均為6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（編號S1）0.05 g，共9份，分成3組，分別精密加入低、中、高水平（相當(dāng)于樣品含量的50%、100%、150%）的混合對照品母液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下分析條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，TCA、7-ODCA、12-DHCA、GCA、3-OCA、TCDCA、3α-OH-7-OCA、HCA、TDCA-NA、HOCA、CA、GCDCA、GDCA、CDCA、DCA的平均加樣回收率分別為97.1%～100.1%、102.0%～103.1%、99.1%～104.1%、93.8%～103.0%、96.1%～99.0%、98.2%～103.4%、95.1%～100.3%、98.5%～103.0%、97.7%～105.7%、96.8%～103.2%、97.4%～99.3%、96.7%～101.5%、95.1%～100.5%、97.7%～100.2%、94.6%～103.4%，RSD為0.5%～5.8%（n均為9），表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 樣品含量測定

分別精密稱取15批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下分析條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中15 個(gè)膽汁酸成分的含量，每批樣品平行測定3次，結(jié)果見表3。

表3 不同批次同仁牛黃清心丸中15個(gè)膽汁酸成分的含量測定結(jié)果（n＝3，μg/g）

2.5 不同批次同仁牛黃清心丸的化學(xué)模式識別分析

為考察同一廠家不同批次同仁牛黃清心丸間的質(zhì)量差異性，筆者采用SPSS 24.0軟件，以本法測定的15個(gè)膽汁酸成分的含量為變量，以平方歐氏距離為測度，對15 批同仁牛黃清心丸進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)平方歐氏距離為5時(shí)，15批同仁牛黃清心丸可聚為2 類，其中S1～S12 聚為一類，S13～S15 聚為一類，說明該廠家生產(chǎn)的同仁牛黃清心丸在質(zhì)量上存在差異。

圖2 15批同仁牛黃清心丸的層次聚類圖

筆者又將15批同仁牛黃清心丸中15個(gè)膽汁酸成分的含量作為變量，采用主成分分析的方法進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，提取出的前2 個(gè)主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)91.740%，表明該模型可以解釋原有變量91.74%的信息；其中主成分1的方差貢獻(xiàn)率為83.072%，主成分2的方差貢獻(xiàn)率為8.668%。此外，由主成分分析的得分圖（圖3）可知，15批同仁牛黃清心丸可被分為2類，其中S13～S15為一類，其他批次為另一類，與聚類分析結(jié)果一致。

圖3 15批同仁牛黃清心丸的主成分得分圖

3 討論

3.1 檢測條件的選擇

膽汁酸是一類具有類固醇結(jié)構(gòu)的有機(jī)酸，由一個(gè)甾環(huán)和一個(gè)脂肪側(cè)鏈共同構(gòu)成，缺少共軛體系。有研究聯(lián)用液相色譜儀與蒸發(fā)光散射檢測器檢測膽汁類動(dòng)物藥中的膽汁酸成分，結(jié)果表明，含量較低的膽汁酸成分檢測結(jié)果不佳[9]。膽汁酸種類較多且化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，部分膽汁酸還是同分異構(gòu)體，檢測不易。因此本研究使用高靈敏和高選擇性的UPLC-MS/MS 技術(shù)，采用Hypersil GOLD C18色譜柱，選用Neg 進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測，并以DHCA為內(nèi)標(biāo)，以甲醇-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，所得圖譜峰形對稱、基線平穩(wěn)、分離度好。

3.2 測定結(jié)果分析

本研究采用建立的UPLC-MS/MS法對15批同仁牛黃清心丸中15個(gè)膽汁酸成分的含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)總含量最高的是S13 批次，最低的是S2 批次；15 個(gè)膽汁酸成分中平均含量最高的是HCA，最低的是3-OCA。不同批次同仁牛黃清心丸中膽汁酸成分的含量存在差異，推測其原因可能是牛黃藥材各批次間質(zhì)量不穩(wěn)定，也可能是制劑過程中，由于環(huán)境、機(jī)器性能等不同因素，導(dǎo)致物料混合不均勻或成分降解，使得不同批次產(chǎn)品中各成分含量存在差異。因此，藥品生產(chǎn)廠家在生產(chǎn)過程中應(yīng)不僅重視原料的質(zhì)量控制，還要嚴(yán)格把控制劑的生產(chǎn)工藝，確保產(chǎn)品質(zhì)量的均一性。

結(jié)合聚類分析結(jié)果可知，15批同仁牛黃清心丸可分為2 類，其中S1～S12 為一類，S13～S15 為另一類，說明不同批次的同仁牛黃清心丸中15 個(gè)膽汁酸成分的含量存在一定的差異。主成分分析將膽汁酸成分中的多個(gè)變量通過線性轉(zhuǎn)換選出2個(gè)主成分進(jìn)行分析評價(jià)，所得結(jié)果與聚類分析結(jié)果相似，說明兩種分析方法均能較好地反映出不同批次同仁牛黃清心丸品質(zhì)間的差異性。由此得出，不同批次同仁牛黃清心丸中膽汁酸含量存在一定的差異，今后可進(jìn)一步探究其譜效關(guān)系，為該藥的質(zhì)量控制和藥效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供規(guī)律性的科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，本研究建立了同時(shí)測定同仁牛黃清心丸中15 個(gè)膽汁酸成分含量的UPLC-MS/MS 法，并采用該方法測定了15批樣品的含量，且化學(xué)模式識別分析可反映出不同批次同仁牛黃清心丸品質(zhì)間的差異性。該方法準(zhǔn)確、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，且測定膽汁酸種類較多，能快速實(shí)現(xiàn)對同仁牛黃清心丸中15 個(gè)膽汁酸成分的定量分析，適用于該藥的質(zhì)量控制。