頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法分析兩面針根、莖、葉的揮發(fā)性成分

何嘉偉，江漢美，劉天琪，田 宇

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)·湖北省藥用植物研發(fā)中心，湖北 武漢 430065）

兩面針為蕓香科植物兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.的干燥根，具有活血化瘀、行氣止痛、祛風(fēng)通絡(luò)、解毒消腫功效，臨床用于治療跌撲損傷、胃痛、牙痛、風(fēng)濕痹痛、毒蛇咬傷、燒燙傷等［1-9］。兩面針含有生物堿類、香豆素類、木質(zhì)素類、有機(jī)酸等化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗寄生蟲［2］及改善胃腸運(yùn)動(dòng)功能、保護(hù)胃黏膜［4-6］等作用。歷版《中國(guó)藥典（一部）》中兩面針的藥用部位均為根，未涉及植株的其他部位。但《名醫(yī)別錄》記載了兩面針的藥用部位和藥用方式為“采莖、根，煮釀酒”。歷代本草藥用部位又增加了果實(shí)、皮、枝葉等［3］。揮發(fā)性成分廣泛存在于植物中，是中藥的重要有效成分。固相微萃?。⊿PME）為樣品前處理與富集技術(shù)，能較真實(shí)地反映樣品中揮發(fā)性成分的組成，現(xiàn)已應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域［7］。主成分分析通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)降維、變量提取與壓縮、確定分類與聚類，可從復(fù)雜的數(shù)據(jù)中提取有意義的信息［8］。本研究中采用頂空固相微萃取（HS-SPME）法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC- MS）法對(duì)兩面針根、莖、葉的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，并結(jié)合主成分分析結(jié)果進(jìn)行比較，為兩面針除根以外的其他入藥部位的研究提供了參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

C-MAG HS- 4 型手動(dòng)SPME 進(jìn)樣裝置（德國(guó)IKA公司）；Agilent 6890/ 5973 型氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Hewlett - Packard 公司）；頂空瓶（15 mL）；65 μm聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯（PDMS/DVB）萃取纖維頭（美國(guó)Supelco 公司）；ALC- 210.2 型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司，精度為0.01 g）。

1.2 試藥

兩面針采自湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)楊紅兵教授鑒定為正品，后經(jīng)晾曬、加工分別得到兩面針的根、莖、葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品前處理

取兩面針根、莖、葉樣品各適量，打粉，過(guò)40 目篩，備用。取根、莖、葉粉末各0.4 g，分別置15 mL 頂空瓶中，插入裝有65 μm 的PDMS / DVB 萃取纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，80 ℃下平衡10 min，壓縮手柄，伸出萃取頭萃取30 min，取出，立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口解吸3 min，即得。

2.2 試驗(yàn)條件

2.2.1 GC 條件

色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：從50 ℃開始，以10 ℃/ min 的速率升至230 ℃；載氣：高純度氦氣（99.99%）；柱流速：0.80 mL/min；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；不分流進(jìn)樣。

2.2.2 MS 條件

離子源：電子轟擊離子源；離子源溫度：230 ℃；電離電壓：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；質(zhì)荷比（m/z）掃描范圍：45～500。

2.3 揮發(fā)性成分分析

取兩面針根、莖、葉樣品，按2.2項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，共鑒定出72 種揮發(fā)性成分，包括烯類、醛類、酮類、醇類、酚類、烷類、酯類及其他類化合物，3 個(gè)部位的共有成分有10 種，詳見表1，總離子流圖見圖1。其中，根中鑒定出24 種成分，其含量占揮發(fā)性成分總量的56.34%，含量最高的為β-石竹烯（32.74%），其次為甲基壬基甲酮（9.42%）、α-姜黃烯（2.40%）、環(huán)氧化蛇麻烯Ⅱ（1.91%）等；莖中鑒定出36 種成分，其含量占揮發(fā)性成分總量的75.64%，含量最高的為β- 石竹烯（16.82%），其次為甲基壬基甲酮（14.56%）、2-十三烷酮（11.20%）、3，7，11，11-四甲基雙環(huán)［8.1.0］2，6-十一烯（8.96%）等；葉中鑒定出50 種成分，其含量占揮發(fā)性成分總量的82.31%，含量最高的為β- 石竹烯（25.56%），其次為3，7，11-三甲基-1，3，6，10-十二碳- 四烯（5.88%）、（+）- 香橙烯（5.52%）、甲基壬基甲酮（5.45%）等。根、莖、葉中烯類化合物相對(duì)含量均最高，分別為44.51%，42.15%，49.47%。詳見表2。

圖1 兩面針揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 TIC chromatograms of volatile components in Zanthoxylum nitidum

表1 兩面針根、莖、葉的揮發(fā)性成分Tab.1 Volatile components in roots，stems and leaves of Zanthoxylum nitidum

表2 兩面針根、莖、葉揮發(fā)性成分種類和相對(duì)含量Tab.2 Types and relative content of volatile components in roots，stems and leaves of Zanthoxylum nitidum

2.4 主成分分析

通過(guò)SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)兩面針根、莖、葉的73 種揮發(fā)性成分及其含量進(jìn)行主成分分析，得特征值與貢獻(xiàn)率（表3）及各成分的主成分特征向量與特征載荷（表4）。可見，第1 主成分和第2 主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為100.00%，能反映樣品的整體信息。其中，第1 主成分的貢獻(xiàn)率為74.304%，主要反映烯類、酚類、醛類和酯類化合物的變異信息，且第1 主成分與這4 類化合物均呈正相關(guān)；第2 主成分的貢獻(xiàn)率為25.696%，與醇類和酮類化合物呈正相關(guān)，與烷類化合物呈負(fù)相關(guān)。以F1 和F2代替原來(lái)的8類成分所表達(dá)的信息進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，得綜合得分與排序（表5）?？梢姡瑑擅驷樃?、莖、葉的揮發(fā)性成分經(jīng)主成分分析表現(xiàn)出了明顯的差異，第1主成分得分最高的為葉，第2 主成分得分最高的為莖，綜合得分由高到低依次為莖＞葉＞根。

表3 主成分的特征值與貢獻(xiàn)率Tab.3 Eigenvalues and contribution rate of principal components

表4 主成分的特征向量與特征載荷Tab.4 Eigenvector and load matrix of principal components

表5 主成分綜合得分與排序Tab.5 Comprehensive scores and ranking of principal components

3 討論

3.1 樣品前處理方法考察

預(yù)試驗(yàn)中，考察了不同取樣量（0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 g），不同萃取溫度（40，60，80，100，120 ℃），不同萃取時(shí)間（10，15，20，25，30 min），不同解吸時(shí)間（1，2，3，4，5 min）對(duì)揮發(fā)性成分的影響，并結(jié)合色譜峰面積和質(zhì)譜鑒定出化合物種類數(shù)，最終確定取樣量0.4 g，80 ℃下萃取30 min，解吸3 min 為最佳的HS - SPME條件。

3.2 揮發(fā)性成分分析

HS - SPME 法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，較蒸餾法減少了煎煮過(guò)程中揮發(fā)性的成分流失，如3 個(gè)部位共有成分且含量最高的β- 石竹烯相較于蒸餾法提取含量明顯提高［10］，根、莖、葉中分別含32.74%，16.82%，25.56%。β- 石竹烯具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗癌等作用［11］，是兩面針治療跌撲損傷、燒燙傷等疾病的有效成分，且已作為香料應(yīng)用于化妝品和食品添加劑中［12］。右旋萜二烯、桃金娘烯醛具有鎮(zhèn)痛、抑菌、抗腫瘤等作用［13-14］，是常見的食品香料［15-16］，對(duì)兩面針的香氣貢獻(xiàn)較大；甲基壬基甲酮具有抗炎作用［17］；氧化石竹烯具有鎮(zhèn)痛和消炎作用［18］。上述揮發(fā)性成分經(jīng)其他提取方法提取含量較低或未檢出［10，19］，但本研究中均有檢出。

主成分分析通過(guò)數(shù)據(jù)降維等方法更直觀地反映出兩面針不同部位揮發(fā)性成分及含量的差異。結(jié)合綜合得分可知，兩面針莖揮發(fā)性成分的綜合得分最高，提示兩面針莖部為最佳入藥部位。兩面針莖特有的桉油烯醇、杜松烯具有抗菌、殺菌、祛痰、保護(hù)胃黏膜等作用［20-22］，表明兩面針的非常規(guī)藥用部位具有開發(fā)應(yīng)用潛力。